南山茶籽中新發(fā)現(xiàn)的一個乙酰基黃酮苷的核磁結(jié)構(gòu)解析

曹清明

蘭 芳1

王蔚婕1

包莉圓1

鐘海雁1,2

(1. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004；2. 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004)

南山茶籽中新發(fā)現(xiàn)的一個乙酰基黃酮苷的核磁結(jié)構(gòu)解析

曹清明1,2

蘭 芳1

王蔚婕1

包莉圓1

鐘海雁1,2

(1. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004；2. 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004)

以南山茶籽為原料，利用溶劑提取法、液液分離、硅膠層析、高效液相半制備色譜等手段提取分離得到了一個高純度的化合物，通過理化性質(zhì)、質(zhì)譜和核磁鑒定該化合物為乙?；S酮苷類化合物山奈酚-3-O-[α-L-鼠李糖基-(1-3)-2,4-di-O-乙?；?α-L-鼠李糖基-(1-6)]-β-D-葡萄糖苷。運用H-H COSY、HSQC、HMBC和TOCSY等二維核磁共振(2D-NMR)技術(shù)對其1H和13C NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行了全歸屬和詳細(xì)解析。

2D-NMR；南山茶；乙?；S酮苷；結(jié)構(gòu)解析

油茶是世界四大木本油料作物之一，作為一種天然的高級油料，其種子含油30%左右[1-3]，可用來榨油，即茶油。茶油中不飽和脂肪酸的含量高達(dá)90%[4-5]，其脂肪酸組成與橄欖油極為接近[6-7]，被譽為“東方橄欖油”。中國政府高度重視油茶產(chǎn)業(yè)，激發(fā)了人們對油茶籽[8-9]、油茶葉[10-11]、油茶果皮[12-16]、油茶種質(zhì)資源[17-18]等方面的研究。油茶的黃酮類化合物具有猝滅自由基[19]、降脂[15, 20]、防骨質(zhì)疏松[21]、抗炎[22]等作用。油茶的研究開展至今，對于現(xiàn)在文獻(xiàn)報道的一些化合物，從Sigma公司等試劑公司都買不到標(biāo)品，各實驗室在開展試驗時都需要臨時制備標(biāo)準(zhǔn)品，難度大，費用高，影響了研究工作的開展。

南山茶(CamelliasemiserrataChi.)又叫做廣寧紅花油茶、廣寧油茶、華南紅花油茶等，屬于山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaL.)山茶亞屬的紅山茶組[23]，為多年生喬木或灌木。主要分布在中國的廣西東南部以及廣東西部[24-25]。本研究以南山茶餅為原料，旨在分析乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位的化學(xué)成分，為研究活性與成分及其量效關(guān)系打下基礎(chǔ)。

核磁共振聯(lián)用技術(shù)可用于化合物的結(jié)構(gòu)鑒定。近年來NMR技術(shù)應(yīng)用于天然產(chǎn)物分析已日趨廣泛和成熟。與一維相比，二維核磁共振譜能將化學(xué)位移、耦合常數(shù)等核磁共振參數(shù)呈現(xiàn)在二維平面上，能夠得到自旋核之間相互作用的信息，分子結(jié)構(gòu)和分子間的關(guān)系表現(xiàn)得更加清晰，極大地方便了核磁共振的譜圖解析。課題組前期報道[26]以南山茶籽為原料，利用高效液相半制備得到了5個高純度化合物，本試驗擬利用2D-NMR研究化合物4的結(jié)構(gòu)，并對其1H和13C化學(xué)位移信號進(jìn)行全歸屬分析。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

油茶籽：廣西藤縣紅羽油茶發(fā)展有限公司，經(jīng)中南林業(yè)科技大學(xué)譚曉風(fēng)教授鑒定為南山茶(CamelliasemiserrataChi.)。

1.1.2 試劑

柱層析硅膠：200～300目，青島海洋化工廠分廠；

凝膠：Sephadex LH-20，美國GE Healthcare Bio-Science AB公司；

氘代試劑CH3OD：氘代率≥99.8%，美國Sigma-Aldrich 公司。

1.1.3 試驗儀器

超導(dǎo)傅立葉變換核磁共振儀：Bruker avance III 600MHz型，瑞士Bruker公司；

高效液相色譜儀(分析型)：Waters 2695-2996型，配備Waters 2996 Photodiode Array Detector檢測器，沃特世科技有限公司；

質(zhì)譜儀：HPLC-QTOF/1290-6530型，安捷倫科技有限公司；

高效液相色譜儀(分析型)：LC3000型，配備Newstyle NU3000 Serials UV/VIS Detector檢測器，北京創(chuàng)新恒通科技有限公司；

高效液相色譜儀(半制備)：LC3000型，北京創(chuàng)新恒通科技有限公司；

分析用色譜柱：C18ME(4.6 mm×250 mm，5 μm)、C18HCE (4.6 mm×250 mm，5 μm)、Unitary C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，華譜新創(chuàng)科技有限公司；

制備用色譜柱：C18HCE(20 mm×250 mm，10 μm)、C18ME(20 mm×250 mm，10 μm)，華譜新創(chuàng)科技有限公司。

1.2 樣品制備

課題組[26]分離制備得到了一個高純度的化合物16 mg，液相色譜檢測其純度約為99.1%，滿足核磁結(jié)構(gòu)鑒定的要求。

1.3 結(jié)構(gòu)鑒定

1.3.1 質(zhì)譜和液相色譜軟件 Agilent UHPLC-QTOF/1290-6530 LC/MS配ESI電噴霧離子源數(shù)據(jù)采集和分析使用軟件Mass Hunter Workstation software (Agilent Mass Hunter Workstation Software, Qualitative Analysis Version B.06.00, Build 6.0.633.0, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)。

1.3.2 LC-MS工作條件 Unitary C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，洗脫劑乙腈—水(體積比25∶75)，進(jìn)樣量2 μL，檢測波長254 nm；電噴霧離子源正離子檢測，氮氣為干燥氣，干燥氣溫度300 ℃，干燥氣流速6 L/min，霧化器壓力344 737.86 Pa，鞘氣溫度400 ℃，鞘氣流速12 L/min，毛細(xì)管電壓4 000 V，噴嘴電壓0 V，參比離子流速10 μL/min，參比離子121.085 5，922.092 2，采集范圍100～1 000，掃描速度2 scan/s。

1.3.3 核磁共振檢測條件 溶劑為CH3OD，NMR的工作頻率分別為1H譜600 MHz，13C譜為150 MHz，核磁共振一維和二維脈沖序列采用儀器的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)程序，1H-NMR譜采樣脈沖寬度90°，累加32次；13C-NMR譜采樣脈沖寬度90°，累加2 000次，H-H COSY、HSQC、HMBC這3種試驗采樣數(shù)據(jù)點陣均為F2×F1=2 048×256，零填充至2 048×1 024進(jìn)行FT變換，窗函數(shù)處理譜圖。

2 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

課題組前期報道[26]，該化合物為黃色晶體，易溶于甲醇、乙醇和丙酮，難溶于氯仿和水，鹽酸鎂粉反應(yīng)顯陽性，三氧化鋁反應(yīng)呈黃綠色熒光，Molish反應(yīng)呈陽性，提示結(jié)構(gòu)為黃酮苷類化合物。質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰為m/z825.245 3[M+H]+，由安捷倫分子式計算器推測其分子式為C37H44O21，有離子碎片m/z679.1873 [(M+H)-146]+，287.055 0 [(M+H)-146-42-42-162]+，推測其化合物有山奈酚母核、1個葡萄糖基、2個鼠李糖基以及2個乙?；?。

1H-NMR(見圖 1)中，δ 6.11(H, d,J=1.7 Hz)與δ 6.26(H, d,J=1.7 Hz)，其化學(xué)位移、裂分及耦合常數(shù)均符合苯環(huán)上間位氫的特征，推斷其分屬于山奈酚A環(huán)H-6與H-8。δ 8.03(2H, d,J=8.7 Hz)與δ 6.89(2H, d,J=8.7 Hz)，通過積分面積可得該兩組信號均包含2個質(zhì)子，應(yīng)屬于對稱結(jié)構(gòu)，其化學(xué)位移、裂分及耦合常數(shù)符合苯環(huán)上鄰位氫的特征，該結(jié)果與山奈酚B環(huán)結(jié)構(gòu)相符合，因此推斷其分屬于山奈酚B環(huán)H-2'，6'與H-3'，5'。δ 5.39(H, d,J=7.5 Hz)為葡萄糖苷端基質(zhì)子信號；δ 4.57(H, s)、5.05(H, s)為鼠李糖苷端基質(zhì)子信號；δ 2.08(H, s)、2.00(H, s)為乙?；|(zhì)子信號；δ 1.22(H, d,J=6.2 Hz)、0.82(H, d,J=6.2 Hz)為鼠李糖苷甲基質(zhì)子信號；δ 3.0～4.0段多組信號為糖苷其它質(zhì)子信號，該結(jié)果與質(zhì)譜推斷相吻合。

13C-NMR(見圖 2)中，δ 103.54、75.80、76.89、70.95、78.09、67.78為一組葡萄糖苷信號，δ 100.12、73.20、76.05、73.91、70.65、17.38以及δ 103.90、72.38、72.07、73.61、70.65、17.93為兩組組鼠李糖苷信號，δ 171.79、20.79和δ 171.88、20.85則歸屬于乙?；罄钐擒罩械囊阴；溆嘈盘柵c山奈酚特征信號高度吻合，該結(jié)果與上述推斷一致。

圖1 1H-NMR圖譜Figure 1 1H-NMR spectrum

圖2 13C-NMR圖譜Figure 2 13C-NMR spectrum

H-H COSY(見圖 3)中，δ 6.11(H, d,J=1.7 Hz)與δ 6.26(H, d,J=1.7 Hz)，其特征符合苯環(huán)上間位氫的特征，推斷其分屬于山奈酚A環(huán)H-6與H-8；δ 8.03(2H, d,J=8.7 Hz)與δ 6.89(2H, d,J=8.7 Hz)相互耦合，形成典型的對位取代苯的AA'BB'自旋耦合體系，符合山奈酚B環(huán)結(jié)構(gòu)；δ 5.39(H, d,J=7.5 Hz)與δ 3.50(m)相互耦合，根據(jù)化學(xué)位移值可推斷其δ 5.39(H, d,J=7.5 Hz)歸屬于葡萄糖苷端基，通過其耦合常數(shù)(J=7.3 Hz>7.0 Hz)可以判斷，該葡萄糖苷鍵為β構(gòu)型。δ 1.22(H, d,J=6.2 Hz)、0.82(H, d,J=6.2 Hz)均與δ 3.00～4.00(m)相互耦合，符合鼠李糖苷甲基質(zhì)子信號特征。

HSQC(圖 4)中，δ 98.83與δ 6.11(H, d,J=1.7 Hz)對應(yīng)，δ 94.90與δ 6.26(H, d,J=1.7 Hz)對應(yīng)，δ 132.25與δ 8.03(2H, d,J=8.7 Hz)對應(yīng)，δ 116.22與δ 6.89 (2H, d,J=8.7 Hz)對應(yīng)，δ 103.54與δ 5.39(H, d,J=7.5 Hz)對應(yīng)，δ 100.12與δ 4.57(H, s)對應(yīng)，δ 103.90與δ 5.05(H, s)對應(yīng)，δ 17.38與δ 1.22(H, d,J=6.2 Hz)對應(yīng)，δ 17.93與結(jié)合TOCSY(見圖 6)及HSQC，通過HMBC可確定不同片段的連接位點，δ 5.39(H, d,J=7.5 Hz)與δ 135.05相關(guān)，可知葡萄糖苷與山奈酚C-3相連；δ 4.57(H, s)與δ 67.78相關(guān)，可知該鼠李糖苷與Glu-C-6相連；δ 5.05(H, s)與δ 76.05相關(guān)，可知另一鼠李糖苷與之前的鼠李糖苷Rha(1)-C-3相連。δ 2.08(H, s)、2.00(H, s)分別與δ 73.20、73.91相關(guān)，可知2個乙?；c鼠李糖苷Rha(1)-C-2及Rha(1)-C-4相連。綜合所有核磁譜圖及質(zhì)譜結(jié)果，化合物鑒定為山奈酚-3-O-[α-L-鼠李糖基-(1-3)-2,4-di-O-乙?；?α-L-鼠李糖基-(1-6)]-β-D-葡萄糖苷，將其1H-NMR、13C-NMR以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27]報道的化合物2對照，基本一致，其核磁信號歸屬見表 1，其結(jié)構(gòu)式見圖 7。Teng Xi-fang等[27]曾在紅花油茶花中發(fā)現(xiàn)該化合物，在油茶籽中尚屬首次發(fā)現(xiàn)。

圖3 1H-1H COSY圖譜Figure 3 1H-1H COSY spectrum

圖4 HSQC圖譜Figure 4 HSQC spectrum

δ 0.82(H, d,J=6.2 Hz)對應(yīng)。

HMBC(見圖 5)中，δ 6.11(H, d,J=1.7 Hz)與δ 163.13、166.46相關(guān)，δ 6.26(H, d,J=1.7 Hz)與δ 166.46、158.58相關(guān)，δ 8.03(2H, d,J=8.7 Hz)與δ 122.82、116.22、161.49相關(guān)，δ 6.89(2H, d,J=8.7 Hz)與δ 132.25、161.49、122.82相關(guān)，其特征與山奈酚完全符合。

圖5 HMBC圖譜Figure 5 HMBC spectrum

表1 1H-NMR及13C-NMR核磁信號歸屬 (溶劑為氘代甲醇)Table 1 Affiliation of 1H-NMR and 13C-NMR ( CD3OD for the solvent)

圖6 TOCSY圖譜Figure 6 TOCSY spectrum

圖7 化合物的結(jié)構(gòu)式及HMBC氫-碳相關(guān)Figure 7 Compound structure and HMBC H-C relation

3 結(jié)論

對于南山茶餅黃酮類化合物的深入研究，可以為油茶副產(chǎn)物的利用打下理論基礎(chǔ)。試驗中，南山茶餅提取物在乙酸乙酯萃取和硅膠柱層析分離、純化的基礎(chǔ)上，用液相色譜半制備得到了純度為99.1%的化合物16 mg。通過高清晰質(zhì)譜和NMR，鑒定為：山奈酚-3-O-[α-L-鼠李糖基-(1-3)-2,4-di-O-乙?；?α-L-鼠李糖基-(1-6)]-β-D-葡萄糖苷，在油茶籽中屬首次報道，對于該化合物的活性及其量效關(guān)系的研究將在以后的文中進(jìn)行報道。

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Structure determination on a new acetyl flavonoid glycoside in seeds ofCamelliasemiserrataChi. by NMR spectroscopy

CAOQing-ming1,2

LANFang1

WANGWei-jie1

BAOLi-yuan1

ZHONGHai-yan1,2

(1.FacultyofFoodScienceandEngineering,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha,Hunan410004,China; 2.KeyLaboratoryofCultivationandProtectionforNon-WoodForestTrees〔CentralSouthUniversityofForestryandTechnology〕,MinistryofEducation,Changsha,Hunan410004,China)

A high-purity compound was extracted by solvent extraction, liquid-liquid separation, silica gel chromatography and high-performance liquid semi-preparative chromatography by using seeds ofCamelliasemiserrataChi. as raw materials. The compound was identified as kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1-3)- 2,4-di-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1-6)]-β-D-glucopyranoside, an acetyl flavonoid glycoside, by physical and chemical properties, mass spectrometry and nuclear magnetic resonance. Two-dimensional nuclear magnetic resonance (2D-NMR) techniques including H-H COSY, HSQC, HMBC and TOCSY were used to affiliate its1H and13C NMR chemical shift and explain the structure.

2D-NMR;CamelliasemiserrataChi.; Acetyl flavonoid glycoside; Structure analysis

湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實驗計劃(編號：XJT2016〔283〕-254)；湖南省教育廳重點項目(編號：17A2292017)；湖南省林業(yè)廳項目(編號：XLK201664，XKL201735)；湖南省科技重大專項(編號：2016NK1001)

曹清明，女，中南林業(yè)科技大學(xué)副教授，博士。

鐘海雁(1963—)，男，中南林業(yè)科技大學(xué)教授，博士。 E-mail:zhonghaiyan631210@126.com

2017—04—06

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.05.004