內(nèi)生細(xì)菌對(duì)香茅草產(chǎn)檸檬醛的影響

柳 倩

閻晉東1,2

徐 婷1,2

李 燕1,2

朱詠華1,2

(1. 湖南大學(xué)生物學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410082；2. 植物基因組學(xué)與發(fā)育調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410082)

內(nèi)生細(xì)菌對(duì)香茅草產(chǎn)檸檬醛的影響

柳 倩1,2

閻晉東1,2

徐 婷1,2

李 燕1,2

朱詠華1,2

(1. 湖南大學(xué)生物學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410082；2. 植物基因組學(xué)與發(fā)育調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410082)

內(nèi)生菌對(duì)于植物的健康和新陳代謝具有非常重要的作用，目前內(nèi)生菌對(duì)芳香植物香茅草揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs)代謝的影響尚不清楚。試驗(yàn)分離了不同生長(zhǎng)季節(jié)的香茅草內(nèi)生細(xì)菌，得到1株具有清新自然香味的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生菌CcLf-2，鑒定為芽孢桿菌屬。通過(guò)頂空氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)香茅草VOCs進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)其主要揮發(fā)性物質(zhì)檸檬醛含量的變化與CcLf-2的分離率分布規(guī)律一致。進(jìn)一步將CcLf-2接種到香茅草無(wú)菌苗中，發(fā)現(xiàn)CcLf-2可以成功定殖到香茅草中，并明顯增強(qiáng)其所產(chǎn)檸檬醛的比例。實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)分析表明，CcLf-2的存在可誘導(dǎo)香茅草中檸檬醛生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)量顯著上升(P<0.05)。說(shuō)明內(nèi)生菌可以作為誘導(dǎo)子來(lái)提高宿主植物中一些重要的VOCs的產(chǎn)量。

內(nèi)生細(xì)菌；香茅草；代謝調(diào)節(jié)；檸檬醛含量；基因表達(dá)

內(nèi)生菌是一類與植物緊密聯(lián)系的特殊微生物，在其生命周期的某一階段或者整個(gè)階段定殖于植物組織或器官內(nèi)，但不引起植物出現(xiàn)明顯病害癥狀[1]。植物內(nèi)生菌幾乎存在于所有植物中[2]，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育[3-4]，適應(yīng)性[5]以及多樣性具有非常重要的作用[6]。由于特殊的生存環(huán)境，內(nèi)生菌在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，具有調(diào)節(jié)其宿主植物次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的能力[7-8]。揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs)是植物次級(jí)代謝產(chǎn)物中的重要成分，具有極重要的生物功能，如抗非生物脅迫或生物脅迫；在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用范圍也很廣，從香料的生產(chǎn)到新藥的來(lái)源[9]，因而受到越來(lái)越多關(guān)注。有報(bào)道[10]顯示，芳香植物的內(nèi)生菌對(duì)宿主萜類揮發(fā)性有機(jī)物的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要的影響，如內(nèi)生真菌PGP-HSF會(huì)影響薄荷中萜類化合物的化學(xué)合成。相對(duì)來(lái)說(shuō)，關(guān)于內(nèi)生細(xì)菌對(duì)宿主次級(jí)代謝，特別是VOCs影響的報(bào)道還非常少。

香茅草，又被稱為檸檬草，是一種重要的香料植物，主要生長(zhǎng)在熱帶地區(qū)[11]。其VOCs的主要成分是檸檬醛。天然狀態(tài)下，檸檬醛主要以橙花醛和香葉醛兩種幾何異構(gòu)體的形式存在[12]。檸檬醛具有拮抗細(xì)菌[13]、真菌[14]以及抗蟲(chóng)性能[15]，并被廣泛用于生產(chǎn)香料，合成紫羅蘭酮、VA和VE等[16]。然而，芳香植物所產(chǎn)生的檸檬醛還遠(yuǎn)不能滿足高速發(fā)展的香料行業(yè)的需求，所以，探究影響香茅草產(chǎn)檸檬醛的因素極其重要。目前，已有研究顯示生長(zhǎng)季節(jié)[17]和植物年齡[18]能影響香茅草精油成分，而內(nèi)生菌對(duì)香茅草VOCs的影響未見(jiàn)諸于報(bào)道。

本研究擬對(duì)不同生長(zhǎng)季節(jié)的香茅草內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離，并鑒定了具有產(chǎn)香能力的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌。通過(guò)對(duì)不同季節(jié)內(nèi)生細(xì)菌的分布規(guī)律以及香茅草揮發(fā)性成分進(jìn)行分析比較，揭示內(nèi)生細(xì)菌與宿主次級(jí)代謝產(chǎn)物合成之間的關(guān)系。進(jìn)一步通過(guò)植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲得香茅草無(wú)菌苗，并用優(yōu)勢(shì)內(nèi)生菌對(duì)無(wú)菌苗進(jìn)行處理，通過(guò)頂空氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(HS-GC-MS)對(duì)用菌處理與未處理的香茅草無(wú)菌苗的VOCs進(jìn)行檢測(cè)分析。同時(shí)，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)對(duì)香茅草中檸檬醛合成途徑中相關(guān)基因的mRNA水平的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，以發(fā)掘內(nèi)生菌影響香茅草生產(chǎn)檸檬醛的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香茅草[Cymbopogoncitrates(DC.) Stapf]：由福建農(nóng)林大學(xué)提供，種植于湖南省長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)湖南大學(xué)(28.10' 47.9994"N, 112.57' 0′′E)；

細(xì)菌DNA提取試劑盒：上海捷瑞生物工程有限公司；

Prime Script RT試劑盒：寶生物工程有限公司；

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀: Thermo-Finnigan Trace GC + Polaris Q型， 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；

qRT-PCR儀：Mx3000P QPCR System型，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 香茅草內(nèi)生細(xì)菌的分離 清洗干凈的香茅草樣品，室溫晾干后,參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行表面消毒和內(nèi)生細(xì)菌的分離。待內(nèi)生細(xì)菌析出后統(tǒng)計(jì)其分離率[分離率為4種分離培養(yǎng)基：大豆酪蛋白培養(yǎng)基(TSA)、甘露醇大豆培養(yǎng)基(MS)、酵母提取物培養(yǎng)基(TWYE)[19]和水瓊脂培養(yǎng)基(WA)[20]分離到內(nèi)生菌的平均值]，并將其挑出到NA培養(yǎng)基上[21]進(jìn)行劃線培養(yǎng)得到純培養(yǎng)物。

1.2.2 細(xì)菌菌種鑒定 用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA。以此為模板，以通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) 對(duì)其16S rRNA進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序后的序列在NCBI酸數(shù)據(jù)庫(kù)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 中進(jìn)行比對(duì)分析，用GENEDOC軟件和MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 HS-GC-MS分析 將新鮮的香茅草用SiO2研磨，所得汁液轉(zhuǎn)移到20 mL色譜瓶。檢測(cè)條件參照文獻(xiàn)[22]，所得總離子流圖與NIST08標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，對(duì)香茅草揮發(fā)性成分進(jìn)行分析鑒定[23]。

內(nèi)生細(xì)菌在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，刮取菌體混合于裝有無(wú)菌水的20 mL色譜瓶中，用于HS-GC-MS分析，檢測(cè)條件同香茅草檢測(cè)條件。

1.2.4 香茅草組織培養(yǎng) 新鮮的香茅草樣品剝?nèi)?～2層葉鞘，選取幼嫩根狀莖作為外植體進(jìn)行表面消毒：70%乙醇浸泡2 min，無(wú)菌水沖洗，2% NaClO浸泡10～15 min，無(wú)菌水沖洗3～10次，于超凈工作臺(tái)晾干。將香茅草樣品切成1 cm左右轉(zhuǎn)移到NB培養(yǎng)基[24][2.0 g/L 2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)]誘導(dǎo)愈傷組織。2周后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基[25][3.0 g/L激動(dòng)素(KT)，0.05 mg/Lα-萘乙酸(NAA)]進(jìn)行分化。培養(yǎng)溫度為28 ℃，14 h光照/10 h黑暗，光強(qiáng)為80 μmol/(m2·s)。

2.3 轉(zhuǎn)染pSIREN-hTERT對(duì)A2780細(xì)胞增殖的影響 MTT比色法描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線提示，空白對(duì)照及轉(zhuǎn)染pSIREN-Con對(duì)照質(zhì)粒的A2780細(xì)胞生長(zhǎng)速率相近，而pSIREN-hTERT轉(zhuǎn)染的A2780細(xì)胞生長(zhǎng)速率明顯降低，后者分別與前兩對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，表明靶向hTERT的shRNA導(dǎo)入抑制了A2780細(xì)胞的增殖能力。見(jiàn)表1。

1.2.5 優(yōu)勢(shì)內(nèi)生菌處理香茅草無(wú)菌苗 將內(nèi)生細(xì)菌的發(fā)酵液稀釋至1×105CFU/mL，待組培瓶中生根培養(yǎng)基[1/2 MS[25]，0.05 mg/L NAA]冷卻至35 ℃左右時(shí)，加入發(fā)酵液2 mL，在培養(yǎng)基中加入2 mL無(wú)菌水作為對(duì)照。待培養(yǎng)基冷卻至室溫后，將90 d苗齡的香茅草幼苗轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.6 植物總RNA提取和qRT-PCR 使用植物總RNA 快速抽提試劑盒對(duì)香茅草總RNA進(jìn)行提取，使用Prime Script RT試劑盒合成cDNA。qRT-PCR引物參照文獻(xiàn)[26]。qRT-PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)[27]。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因表達(dá)相對(duì)值[28]。無(wú)菌水處理的香茅草基因表達(dá)水平設(shè)為1。

2 結(jié)果與討論

2.1 香茅草產(chǎn)香內(nèi)生細(xì)菌的分離

通過(guò)對(duì)2015年7月～2016年6月的香茅草內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離，從14 376個(gè)香茅草組織樣品中分離出3 594株內(nèi)生細(xì)菌。在所分離的內(nèi)生細(xì)菌中，發(fā)現(xiàn)一株細(xì)菌不管是在不同的生長(zhǎng)季節(jié)還是在不同的香茅草組織中，析出頻率都比較高，將其命名為CcLf-2。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合16S rRNA序列分析，鑒定該菌為芽孢桿菌屬(Bacillus)(圖1 )。據(jù)報(bào)道[29]，一些內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生與其宿主植物相似的次級(jí)代謝物，如紫杉醇。然而，關(guān)于內(nèi)生細(xì)菌的類似研究卻很少見(jiàn)[7]。通過(guò)感官評(píng)定，發(fā)現(xiàn)分離自香茅草的一些內(nèi)生細(xì)菌可以產(chǎn)生清新自然的香味，尤其是CcLf-2，香味很明顯。芽孢桿菌屬的菌種具有抗菌、除臭等多種生理功能[30]，但是其具有產(chǎn)香能力卻是首次發(fā)現(xiàn)。通過(guò)HS-GC-MS檢測(cè)CcLf-2的揮發(fā)性物質(zhì)，表明CcLf-2的揮發(fā)性成分中含有桃醛、紫羅蘭酮等重要的香料物質(zhì)(表1)。

表1 Bacillus sp. CcLf-2的揮發(fā)性成分分析Table 1 The volatile organic compounds ofBacillus sp. CcLf-2

分支點(diǎn)上的數(shù)字表示構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)時(shí)1 000次計(jì)算時(shí)形成該節(jié)點(diǎn)的百分比

圖1 CcLf-2的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

Figure 1 Phylogenetic tree of CcLf-2 16S rRNA gene sequences

值得注意的是，不同季節(jié)CcLf-2的分離率(圖2)與香茅草內(nèi)生細(xì)菌的總分離率(圖3)的變化趨勢(shì)相反，即具有產(chǎn)香能力的優(yōu)勢(shì)菌CcLf-2析出頻率高的時(shí)候，并不對(duì)應(yīng)著內(nèi)生細(xì)菌在宿主植物香茅草中分布最豐富的季節(jié)。而香茅草揮發(fā)性物質(zhì)的組成及比例隨季節(jié)發(fā)生變化，因此懷疑這一變化是否與產(chǎn)香內(nèi)生細(xì)菌的特殊分布存在關(guān)聯(lián)。為了驗(yàn)證這一猜測(cè)，通過(guò)HS-GC-MS對(duì)不同季節(jié)香茅草VOCs進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 不同季節(jié)香茅草VOCs分析

利用HS-GC-MS，鑒定出香茅草中9個(gè)揮發(fā)性成分(表2)。主要包含檸檬醛(以橙花醛和香葉醛兩種幾何異構(gòu)體的形式存在)和α-蒎烯，這兩種物質(zhì)均廣泛應(yīng)用于香料生產(chǎn)中。有研究報(bào)道香茅草精油中含有30多種揮發(fā)性物質(zhì)[31]，本研究只分離鑒定到9種，其原因可能有以下兩點(diǎn)：① 不同于傳統(tǒng)提煉精油的方法，本研究直接用石英砂來(lái)研磨新鮮的香茅草樣品，可能會(huì)導(dǎo)致一些含量很少的成分損失；② 本研究通過(guò)頂空自動(dòng)進(jìn)樣器來(lái)收集樣品，在此過(guò)程中，一些高沸點(diǎn)的化合物難以自然擴(kuò)散到進(jìn)樣器中。但本方法快速便捷，能滿足獲得主要VOCs的需要。由表2可知，不同季節(jié)香茅草VOCs的比例發(fā)生了明顯的變化，其中橙花醛和香葉醛的比例在春季和夏季明顯高于秋冬季節(jié)，與之前提到的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌CcLf-2在不同季節(jié)的分布規(guī)律的變化趨勢(shì)一致(圖2)。因此，寄生于香茅草內(nèi)的產(chǎn)香內(nèi)生細(xì)菌可能會(huì)對(duì)其VOCs，尤其是主要成分檸檬醛的含量有一定的影響。

圖2 不同季節(jié)優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌Bacillus sp. CcLf-2的分離率Figure 2 The isolation rate of dominant endophytic bacteriaBacillus sp. CcLf-2 in different seasons

圖3 香茅草內(nèi)生細(xì)菌的總分離率Figure 3 General endophytic bacteria from C. citratusin different seasons表2 不同季節(jié)香茅草揮發(fā)性成分分析Table 2 Volatile organic compounds obtained fromC. citratus in different seasons

物質(zhì)分子式相對(duì)峰面積/%春季夏季秋季冬季α-蒎烯C10H1662.7168.4989.3393.57β-羅勒烯C10H161.360.371.370.66馬鞭草烯醇C10H16O0.800.490.190.272,2-二甲基-3,4-辛二烯C10H16O—0.850.090.15橙花醛C10H16O13.9815.164.703.89香葉醛C10H16O19.8211.163.610.51α-蓽澄茄油烯C15H240.620.820.320.37β-欖香烯C15H240.381.920.150.16石竹烯C15H240.330.730.240.42

2.3 內(nèi)生菌CcLf-2對(duì)香茅草VOCs的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證內(nèi)生細(xì)菌對(duì)香茅草VOCs的影響，首先通過(guò)植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲得了香茅草無(wú)菌苗(圖4)，以排除其他微生物的干擾。將內(nèi)生細(xì)菌CcLf-2接種到香茅草無(wú)菌苗培養(yǎng)基中，CcLf-2可以通過(guò)香茅草的根部滲入香茅草。通過(guò)重分離試驗(yàn)，從香茅草組培苗的葉片和鞘中分離出了CcLf-2(圖5)，證明其的確可以成功定殖在香茅草中。通過(guò)HS-GC-MS檢測(cè)接種了CcLf-2(E +)和未接種CcLf-2(E-)的香茅草無(wú)菌苗以及野生香茅草幼苗(W)的VOCs，發(fā)現(xiàn)接種CcLf-2后，香茅草VOCs中橙花醛和香葉醛的比例明顯增加(表3)，說(shuō)明內(nèi)生細(xì)菌CcLf-2可以誘導(dǎo)香茅草主要揮發(fā)性物質(zhì)檸檬醛的產(chǎn)生。值得注意的是，生長(zhǎng)同期，大小一致的野生香茅草幼苗，其檸檬醛的含量明顯高于CcLf-2處理后的香茅草組培苗，表明內(nèi)生菌誘導(dǎo)香茅草VOCs中檸檬醛比例的增加可能不只依賴單個(gè)菌種，而是依賴整個(gè)微生物菌群。

2.4 CcLf-2對(duì)香茅草中萜類化合物生物合成基因表達(dá)的調(diào)控

為了進(jìn)一步探討內(nèi)生細(xì)菌誘導(dǎo)宿主香茅草中檸檬醛合成的分子機(jī)制，通過(guò)qRT-PCR分析香茅草中檸檬醛代謝途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。異戊烯二磷酸酯(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)是萜類化合物生物合成的兩種前體物質(zhì)[32]。植物體主要通過(guò)甲羥戊酸(MVA)途徑和2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)途徑來(lái)合成IPP和DMAPP[33-34]。本研究對(duì)MVA途徑中的3個(gè)基因[甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)、甲羥戊酸激酶(MK)、甲羥戊酸二磷酸脫羧酶(MDC)]和MEP途徑中的5個(gè)基因[1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合成酶(DXS)、1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)、5-二磷酸-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶(CMK)、2,4-環(huán)磷酸合酶(MCS)、(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸合酶(HDS)]進(jìn)行了檢測(cè)。這些基因都是萜類物質(zhì)合成途徑中的關(guān)鍵基因[26]。由圖6可知，與未處理的香茅草無(wú)菌苗相比，用CcLf-2處理過(guò)的香茅草組培苗中除MCS以外，所有檢測(cè)基因的表達(dá)量均顯著性上調(diào)(P<0.01)，特別是MVA途徑中的基因。植物揮發(fā)性萜類化合物的合成涉及到一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)過(guò)程，是多種基因相互作用的結(jié)果。由于香茅草基因組信息有限，雖然只檢測(cè)了部分基因的mRNA水平，但已有結(jié)果仍表明內(nèi)生細(xì)菌CcLf-2在香茅草中的定殖可以通過(guò)調(diào)控與萜類物質(zhì)合成相關(guān)的基因的表達(dá)水平來(lái)提高檸檬醛的合成。

A. 香茅草外植體在NB培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周后形成的愈傷組織 B. 香茅草愈傷組織在MS分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d形成的芽 C. MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)2個(gè)月的香茅草無(wú)菌苗

圖4 香茅草組織培養(yǎng)

Figure 4 The tissue culture ofC.citratus

圖5 從未接種CcLf-2(E-)和接種CcLf-2(E +)的 香茅草組培苗中重分離CcLf-2

Figure 5 The bacteria CcLf-2 reisolation result from CcLf-2-free (E-) and CcLf-2-inoculated (E+)C.citratusaseptic seedlings

表3 內(nèi)生細(xì)菌CcLf-2處理(E+)和未處理的香茅草組培苗(E-)以及香茅草野生幼苗(W)的揮發(fā)性成分分析

Table 3 Volatile organic compounds obtained from endop-hyte CcLf-2-inoculated (E+), CcLf-2-free (E-)C.citratusaseptic seedlings and wildC.citratusseedlings (W)

物質(zhì)分子式相對(duì)峰面積/%E-E+Wα-蒎烯C10H1689.9785.1680.75β-羅勒烯C10H16——2.10馬鞭草烯醇C10H16O1.372.630.06橙花醛C10H16O0.831.963.98香葉醛C10H16O3.406.1011.04α-蓽澄茄油烯C15H242.232.181.49β-欖香烯C15H240.850.740.46石竹烯C15H241.341.230.18

E-：香茅草無(wú)菌苗；E +：CcLf-2處理10 d的香茅草組培苗；星號(hào)表示與香茅草無(wú)菌苗的顯著差異， * P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001圖6 香茅草中與MVA和MEP合成途徑相關(guān)的基因表達(dá)水平分析Figure 6 The expression levels of genes responsible for MVA pathway and MEP pathway (n=3)

3 結(jié)論

本研究探究了內(nèi)生細(xì)菌對(duì)香茅草VOCs的影響。結(jié)果表明，分離出的香茅草優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌CcLf-2可以成功定殖在香茅草無(wú)菌苗中，通過(guò)調(diào)控其與萜類化合物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)水平可提高檸檬醛的合成；初步揭示了內(nèi)生菌誘導(dǎo)香茅草檸檬醛合成的分子機(jī)制，證明內(nèi)生菌作為提高一些高商業(yè)價(jià)值天然產(chǎn)物產(chǎn)量的誘導(dǎo)子，具有很大的開(kāi)發(fā)潛力。然而，內(nèi)生菌誘導(dǎo)宿主香茅草產(chǎn)檸檬醛的詳細(xì)分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究；如何通過(guò)控制內(nèi)生菌的接種方法和接種量，使香茅草檸檬醛的產(chǎn)量達(dá)到最大，從而應(yīng)用于實(shí)踐生產(chǎn)當(dāng)中仍需要進(jìn)一步摸索。

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Effects of endophytic bacteria on citral production inCymbopogoncitratus(DC.) Stapf

LIUQian1,2

YANJin-dong1,2

XUTing1,2

LIYan1,2

ZHUYong-hua1,2

(1.CollegeofBiology,HunanUniversity,Changsha,Hunan410082,China; 2.HunanProvinceKeyLaboratoryofPlantFunctionalGenomicsandDevelopmentalRegulation,Changsha,Hunan410082,China)

The existence of endophytes significantly contributes to plant health and metabolism, however, the effects of endophytes on the volatile organic compounds (VOCs) metabolism of aromatic plantCymbopogoncitratusare still unclear. In this study, the endophytic bacteria fromC.citratusgrown at different seasons were isolated, and a dominant endophytic bacteriumBacillussp. CcLf-2 was identified, with a fragrance-producing property. After seasonal analysis of the VOCs ofC.citratusby headspace gas chromatography-mass spectrometry, found that the abundance pattern of CcLf-2 had a similar trend with the emission profile of citral, the primary and valuable composition of VOCs, inC.citratus. By inoculating CcLf-2 intoC.citratusaseptic seedlings obtained by tissue culture, endophyte reisolation test verified the colonization of CcLf-2 in plants and the presence of CcLf-2, which can increased the citral proportion, obviously. Moreover, quantitative real-time PCR analysis of relevant genes in the citral biosynthesis pathway revealed that they were significantly up-regulated (at least P <0.05) with the existence of CcLf-2. The endophytic bacteria may enhance the citral production by modulating the expression of genes related to biosynthesis. And implies the possibility of using endophytic bacteria as a regulator to improving yields of some important VOCs in its host.

Endophytic bacteria;Cymbopogoncitratus; metabolism regulation; citral production; gene expression

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：31672093)

柳倩，女，湖南大學(xué)在讀碩士研究生。

朱詠華(1968—)，女，湖南大學(xué)教授，博士。 E-mail:yonghuaz@outlook.com

2017—04—03

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.05.002