高糖引起H9C2心肌細(xì)胞增殖并高表達(dá)GATA4及β-MHC

阮駱陽，田小華，潘鳳娟，楊彩蘭，徐小紅

（廣東省農(nóng)墾中心醫(yī)院兒科，廣東湛江524002）

高糖引起H9C2心肌細(xì)胞增殖并高表達(dá)GATA4及β-MHC

阮駱陽，田小華，潘鳳娟，楊彩蘭，徐小紅*

（廣東省農(nóng)墾中心醫(yī)院兒科，廣東湛江524002）

目的：探討不同高糖濃度培養(yǎng)H9C2細(xì)胞導(dǎo)致心肌細(xì)胞增殖改變及可能機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)H9C2大鼠心肌細(xì)胞分為6組，A-C組分別為：5mmol/L、25mmol/L、50mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基，各培養(yǎng)48 h；D-F組分別為：5mmol/L、25mmol/L、50mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基，各培養(yǎng)72 h。MTT法檢測H9C2細(xì)胞增殖；qPCR法及Western blot法檢測β-重鏈肌球蛋白（β-MHC）、GATA4的mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果：OD值分別在培養(yǎng)48 h的A、B、C組及72 h的D、E、F組呈階梯上升，C、F組達(dá)到各自時(shí)段的最高點(diǎn)；同一葡萄糖濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h.和72 h后發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)時(shí)長為72 h的OD值高于48 h。A、B、C組GATA4、β-MHC的mRNA及蛋白表達(dá)逐步升高，C組達(dá)最高；D、E、F組GATA4、β-MHC的mRNA及蛋白表達(dá)逐步升高，F(xiàn)組達(dá)最高。結(jié)論：高糖引起H9C2心肌細(xì)胞增殖并高表達(dá)GATA4、β-MHC。

心肌細(xì)胞；鋅指轉(zhuǎn)錄因子GATA4；β-重鏈肌球蛋白

代謝性疾病，如肥胖、胰島素抵抗和2型糖尿病都與心血管疾病如心肌肥厚和心力衰竭相關(guān)，糖尿病性心肌病的特點(diǎn)是心肌結(jié)構(gòu)和功能的改變最終導(dǎo)致心力衰竭。多種機(jī)制參與了糖尿病性心肌病的發(fā)病，如心肌能量代謝和鈣信號的改變等。代謝障礙在糖尿病性心肌病的特點(diǎn)是脂質(zhì)過氧化的增加，心肌內(nèi)甘油三酯的積累，葡萄糖的利用降低，氧化應(yīng)激增強(qiáng)等從而導(dǎo)致線粒體功能障礙與心肌細(xì)胞凋亡［1］。鋅指轉(zhuǎn)錄因子GATA4和β-重鏈肌球蛋白（β-MHC）與此高度相關(guān)，我們嘗試用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)H9C2大鼠心肌細(xì)胞，探索GATA4、β-MHC與代謝性心肌病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9C2購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；胎牛血清購自Hyclone；DMEM-high glucose、DMEM-low glucose培養(yǎng)基均購自Gibco公司；PBS磷酸鉀緩沖液購自Hyclone；DNase I（RNase-free）（全式金）、Trizol試劑盒（Invitrogen，USA）、real-time PCR試劑盒（Vazyme）；GATA4、β-MHC一抗購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組A組：含10%胎牛血清的DMEM-常規(guī)培養(yǎng)基（糖濃度5mmol/L）培養(yǎng)48 h；B組：DMEM-高糖培養(yǎng)基（糖濃度25mmol/L）培養(yǎng)48 h；C組：DMEM-高糖培養(yǎng)基（糖濃度50mmol/L）培養(yǎng)48 h；D-F組：培養(yǎng)基成分分別與A、B、C組相同，培養(yǎng)時(shí)長均為72 h。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期細(xì)胞，EDTA胰蛋白酶溶液消化，800 r/min離心3 min，重懸，計(jì)數(shù)，稀釋細(xì)胞至數(shù)量為104～105個(gè)/ml左右，每孔加入100μl。根據(jù)細(xì)胞接種密度以及生長狀況，培養(yǎng)1～2 d。加入配好的含藥培養(yǎng)基100μl，每個(gè)濃度加注3個(gè)復(fù)孔，分別在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h、72 h后進(jìn)行下一個(gè)步驟。吸去藥物，加入MTT溶液20μl，無血清培養(yǎng)基100μl，37℃孵育4 h，吸去上清，加150μl DMSO，振蕩10min，溶解結(jié)晶。測定492 nm波長處吸光度值。

1.2.3 熒光定量PCR法檢測各組心肌細(xì)胞GATA4、β-MHC的mRNA表達(dá)Trizol試劑盒提取RNA；使用RNase-free的DNase I配置反應(yīng)液，37℃消化30min，65℃滅活10min去除DNA；取模板RNA（1.5μg）及引物混合物42℃反轉(zhuǎn)錄1 h，冰上2 min；cDNA稀釋10倍后，作為qPCR模板，加入引物反應(yīng)體系，95℃1 s，60℃34 s；40個(gè)循環(huán)，在溫度60℃、95℃行融解曲線分析。GATA-4的上游引物序列為：CCTTGTCCAACACTCCCCTT，下游引物序列為GCCTTCTCCTCACCTAAACCC；ratβ-MHC的上游引物序列為AATGAACACCGGA GCAAGG，下游引物序列為CGGGTCAGCTGAGA GATAAGAGC；rat-GAPDH的上游引物序列為CATCAACGACC CCTTCATTG，下游引物序列為GAAGATGGTGA TGGGTTTCC。

1.2.4 Western-blot法檢測各組心肌細(xì)胞GATA4、β-MHC蛋白的表達(dá)培養(yǎng)孔板中的H9C2細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，收集到Ep管中，再用PBS沖洗后立即放入預(yù)冷的裂解緩沖液中30min，10 000 r/min離心裂解產(chǎn)物20min，取上清。吸取2μl上清液用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按序制備10ml 10%SDS-PAGE分離膠，5%濃縮膠5ml灌滿剩余空間，上樣50μg/孔。濃縮膠100 V恒壓電泳20min，分離膠140 V恒壓電泳40min。轉(zhuǎn)移已電分離的PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)至PVDF膜上，TBS洗滌3次后加封閉液置搖床室溫封閉2 h；膜放入封閉液稀釋的一抗中室溫反應(yīng)4 h后4℃過夜，PVDF膜用大量PBST洗滌3次后放入二抗中室溫?fù)u床2 h，取出，PBS洗5次，每次15min?；瘜W(xué)發(fā)光法（ECL）顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 5軟件行統(tǒng)計(jì)分析，多組均數(shù)間的比較采用方差分析，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)取雙側(cè)P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果各組細(xì)胞分別培養(yǎng)48 h、72 h后，培養(yǎng)時(shí)長相同的各組OD值呈階梯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C、F組達(dá)到最高。同一葡萄糖濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h和72 h后發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)72 h者OD值均高于48 h，見圖1。

圖1 各組培養(yǎng)48 h、72 h MTT測定OD值

2.2 各組H9C2細(xì)胞GATA4、β-MHCmRNA的表達(dá)變化qRT-PCR檢測mRNA的表達(dá)，培養(yǎng)48 h后，B、C組GATA4和β-MHC的mRNA表達(dá)均較A組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；C組GATA4和β-MHC的mRNA表達(dá)較B組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；培養(yǎng)72 h后，E、F組GATA4和β-MHC的mRNA表達(dá)均較D組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。培養(yǎng)時(shí)長72 h較48 h相同糖濃度培養(yǎng)組GATA-4、β-MHCmRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。2.3 Western blot檢測各組H9C2細(xì)胞GATA4、β-MHC蛋白的表達(dá)培養(yǎng)48 h后，各組GATA4和β-MHC的蛋白表達(dá)均較A組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；GATA4和β-MHC的蛋白表達(dá)在A、B、C組逐步上升，C組達(dá)到最高點(diǎn)。分別培養(yǎng)72 h后，E、F組GATA4和β-MHC的蛋白表達(dá)均較D組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。培養(yǎng)時(shí)長72 h較48 h之間比較而言，相同糖濃度培養(yǎng)組GATA-4、β-MHC蛋白表達(dá)在兩時(shí)間點(diǎn)之間變化均不明顯見圖3。

3 討論

高血糖致心肌病的特點(diǎn)是心肌結(jié)構(gòu)和功能的改變，最終導(dǎo)致心力衰竭。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)高糖可導(dǎo)致H9C2細(xì)胞平均單個(gè)細(xì)胞體積增加，提示高糖培養(yǎng)可能通過激活Ca2+-CaN-NFAT3信號通路而導(dǎo)致H9C2細(xì)胞肥大［2］，同時(shí)也有研究證實(shí)GATA-4參與心肌肥厚的信號傳導(dǎo)［3］。為進(jìn)一步研究其可能的信號通路，所以我們使用不同高糖濃度培養(yǎng)H9C2細(xì)胞不同時(shí)長來研究GATA-4通過何種機(jī)制產(chǎn)生對心肌肥厚的影響。

圖2 qRT-PCR檢測各組H9C2細(xì)胞GATA-4、β-MHCmRNA的表達(dá)

圖3 Western blot檢測各組H9C2細(xì)胞GATA-4、β-MHC蛋白的表達(dá)

MTT法是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法，主要用來測定細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性。不同條件對H9C2細(xì)胞增殖的影響不同。Bi等［4］研究發(fā)現(xiàn)暴露于先低糖后高糖環(huán)境的H9C2細(xì)胞增殖下降。Gao等［5］研究發(fā)現(xiàn)法舒地爾可逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞增殖。Pang等［6］發(fā)現(xiàn)絲氨酸蛋白酶Corin表達(dá)可致高糖培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞增殖明顯下降。Huang等［7］研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸B通過抑制高血糖合并缺氧條件下H9C2細(xì)胞凋亡達(dá)到保護(hù)效應(yīng)。我們的研究則發(fā)現(xiàn)不同葡萄糖濃度下分別培養(yǎng)48 h、72 h后，相同時(shí)長各組細(xì)胞OD值隨糖濃度升高而呈階梯上升，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，OD值在50mmol/L濃度組達(dá)到最高點(diǎn)。提示隨培養(yǎng)液糖濃度增加，細(xì)胞數(shù)目增加，與糖濃度呈正相關(guān)。同一糖濃度培養(yǎng)48 h和72 h后，時(shí)長為72 h者OD值均高于48 h，提示培養(yǎng)時(shí)長也是影響細(xì)胞增殖或活性的影響因素，培養(yǎng)時(shí)間越長，細(xì)胞利用轉(zhuǎn)化的能量物質(zhì)越多，增殖越多，活性也相對增加。

鋅指轉(zhuǎn)錄因子GATA-4調(diào)節(jié)心臟形態(tài)發(fā)生和心肌細(xì)胞增殖，與先天性心臟病相關(guān)［8］。心肌細(xì)胞GATA-4調(diào)控著包括α-重鏈肌球蛋白（α-MHC）、β-MHC、心臟肌鈣蛋白-C、心房尿鈉因子（ANF）、腦尿鈉肽（BNP）、心臟肌鈣蛋白-I、A1腺苷受體、M2毒蕈堿性受體等多種基因和蛋白的表達(dá)。Ku等［9］發(fā)現(xiàn)高血糖通過誘導(dǎo)GATA-4磷酸化并在細(xì)胞核中的蓄積引起心臟收縮功能障礙。Pu等［10］也發(fā)現(xiàn)心臟發(fā)育對GATA-4的濃度非常敏感，濃度輕微改變就會引起顯著的下游信號波動(dòng)，GATA-4負(fù)責(zé)監(jiān)管心臟形態(tài)發(fā)生，GATA-4劑量和分級減少導(dǎo)致心臟發(fā)育異常如共同房室管、右心室雙出口的心室心肌發(fā)育不全，在正常情況下能指導(dǎo)心臟發(fā)育，在異常情況下則引起心臟發(fā)育畸形。目前的研究大多關(guān)注GATA-4對心肌細(xì)胞的分化、增殖的影響，也已有研究發(fā)現(xiàn)GATA-4是啟動(dòng)心肌肥厚的重要轉(zhuǎn)錄因子［11］。但在對于高糖致心肌細(xì)胞肥大方面研究不多，因此我們觀察了GATA-4在高糖培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞中表達(dá)變化并推測其可能的信號通路。我們的研究發(fā)現(xiàn)各組不同條件分別培養(yǎng)48 h、72 h后，5mmol/L、25mmol/ L、50mmol/L糖濃度培養(yǎng)組GATA-4mRNA、蛋白表達(dá)呈階梯式上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與細(xì)胞活性測定及細(xì)胞大小變化一致，提示GATA-4可能在高糖培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞增殖、肥大中發(fā)揮作用。5 mmol/L、25 mmol/L、50 mmol/L糖濃度培養(yǎng)組在兩時(shí)間點(diǎn)72 h和48 h之間GATAmRNA、蛋白表達(dá)變化不明顯。表明時(shí)間對GATA水平變化影響不大，可能在早期即發(fā)揮作用，隨時(shí)間延長作用未同步增加，在一定程度上印證了GATA為胎心發(fā)育早期的調(diào)控因子之一。

β-MHC基因是心肌肥大標(biāo)記基因之一，β-MHC的mRNA和蛋白表達(dá)在一定程度上反映右心室肥大的改變［12］，被多項(xiàng)研究用來作為心肌肥大的指標(biāo)［13-15］。我們的檢測結(jié)果顯示不同糖濃度培養(yǎng)48 h、72 h后，25mmol/L、50mmol/L糖濃度培養(yǎng)組β-MHCmRNA和蛋白表達(dá)均較5mmol/L糖濃度組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；50 mmol/L糖濃度培養(yǎng)組β-MHCmRNA和蛋白表達(dá)較25mmol/L糖濃度培養(yǎng)組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示高糖條件可導(dǎo)致心肌細(xì)胞增殖并可能致心肌肥大，隨糖濃度增高，心肌細(xì)胞增殖也明顯增強(qiáng)，推測高糖可導(dǎo)致心肌肥厚。相同糖濃度培養(yǎng)組在不同培養(yǎng)時(shí)長條件下心肌細(xì)胞增殖比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明培養(yǎng)時(shí)長對高糖培養(yǎng)的心肌細(xì)胞增殖影響不大。

［1］Palomer X，SalvadóL，Barroso E，et al.An overview of the crosstalk between inflammatory processes and metabolic dysregulation during diabetic cardiomyopathy［J］.Int JCardiol，2013，168（4）：3160-3172.

［2］徐小紅，阮駱陽，田小華，等.高糖激活Ca2+-CaN-NFAT3信號通路致H9C2細(xì)胞肥大［J］.中國病理生理雜志，2015，11（31）：2016-2020.

［3］Vega RB，Bassel-Duby R，Olson EN.Control of cardiac growth and function by calcineurin signaling［J］.Biol Chem，2003，278（39）：36981-36984.

［4］Bi Y，Wang G，Liu X，et al.Low-after-high glucose downregulated Cx43 in H9C2 cells by autophagy activation via crossregulation by the PI3K/Akt/mTOR and MEK/ERK1/2 signal pathways［J］.Endocrine，2017.doi：10.1007/s12020-017-1251-3

［5］GaoH，Hou F，DongR，etal.Rho-Kinase inhibitor fasudilsuppr esseshigh glucose-induced H9c2 cellapoptosis through activation ofautophagy［J］.Cardiovasc Ther，2016，34（5）：352-359.

［6］Pang A，Hu Y，Zhou P，etal.Corin isdown-regulated and exerts cardioprotective action via activating pro-atrialnatriuretic peptide pathway in diabetic cardiomyopathy［J］.Cardiovasc Diabetol，2015，14：134-147.

［7］Huang CY，Chen SY，F(xiàn)u RH，etal.Differentiation ofembryonic stem cells into cardiomyocytes used to investigate the cardioprotective effect of salvianolic acid B through BNIP3 involved pathway［J］.Cell Transplant，2015，24（3）：561-571.

［8］Peterkin T，Gibson A，Loose M，etal.The rolesofGATA-4，-5 and-6 in vertebrate heart development［J］.Semin Cell Dev Biol，2005，16（1）：83-94.

［9］Ku PM，Chen LJ，Liang JR，et al.Molecular role of GATA binding protein 4（GATA-4）in hyperglycemia-induced reduction of cardiac contractility［J］.Cardiovasc Diabetol，2011，10：57-72.

［10］Pu WT，Ishiwata T，Juraszek AL，et al.GATA4 is a dosage-sensitive regulator of cardiac morphogenesis［J］.Dev Biol，2004，275（1）：235-244.

［11］Vega RB，Bassel-Duby R，Olson EN.Control of cardiac growth and function by calcineurin signaling［J］.JBiol Chem，2003，278（39）：36981-36984.

［12］Hashimoto T，Sugiyama A，Taguchi S.Myosin heavy chain isoforms expression and cyclic AMP concentrations in hypoxiainduced hypertrophied right ventricle in rats［J］.Comp Biochem PhysiolBBiochem Mol Biol，2004，138（4）：365-370.

［13］Chang W，Zhang M，Meng Z，et al.Berberine treatment prevents cardiac dysfunction and remodeling through activation of 5'-adenosinemonophosphate-activated protein kinase in type 2 diabetic ratsand in palmitate-induced hypertrophic H9c2 cells［J］.Eur JPharmacol，2015，769：55-63.

［14］Han SS，Wang G，Jin Y，etal.Investigating themechanism of hyperglycemia-induced fetal cardiac hypertrophy［J］.PLOS One，2015，10（9）：e0139141.

［15］Raut SK，Kumar A，Singh GB，et al.miR-30c mediates upregulation of Cdc42 and Pak1 in diabetic cardiomyopathy［J］.Cardiovasc Ther，2015，33（3）：89-97.

HighG lucose InducesH 9C2Cardiom yocyteProliferationbyRegulating theExpressionofGATA4andβ-MHC

RUAN Luoyang，TIANXiaohua，PAN Fengjuan，YANGCailan，XUXiaohong*
（DepartmentofPediatrics，The HospitalofGuangdong AgriculturalReclamation，Zhanjiang524002，China）

Objective：To inveatigate the effectofhigh glucose on H9C2 cardiomyocyte proliferation and its possiblemechanism. Methods thods：RatH9C2 cellswere divided into 6 groups.H9C2 cellswere incubated with 5mmol/L，25mmol/L，50mmol/L glucose for 48 h respectively in group A-Cand H9C2 cellswere incubated with 5mmo l/L，25mmo l/L，50mmo l/L glucose for 72 h in group DF.MTT assay was used to detect the proliferation of H9C2 cells.ThemRNA expression of GATA4 andβ-MHC in H9C2 cellswere detected by qRT-PCR and the protein levels of GATA4 andβ-MHC were detected by Western blot.Results sults：The OD values increased in the A-C group（A＜B＜C）for 48 h and in the D-F group for 72 h（D＜E＜F）（P＜0.05）.For the same glucose concentration，the OD valueswere significanthigher in cells cultured for 72 h than those in cells cultured for 48 h（B＜E，C＜F）. ThemRNA and protein expression ofGATA4 andβ-MHC also increased gradually in both groups（A＜B＜C，D＜E＜F），while there was no statistical difference between the two groups（P＞0.05）.Conclusion usion：High glucose can induce H9C2 cardiomyocyte proliferation by increasing theexpression ofGATA4 andβ-MHC.

cardiomyocyte；GATA4；β-MHC

R363

A

1008-2344（2017）03-0208-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.03.007

2016-12-01

（吳迪編輯）

徐小紅（1977—），女（漢），副主任醫(yī)師，研究方向：兒童代謝免疫系統(tǒng)疾病.E-mail：276798575@qq.com.