血清中乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)錄的檢測(cè)在母嬰垂直傳播中的臨床意義

趙薇

[摘要] 目的 探究血清中乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)錄的檢測(cè)在母嬰垂直傳播中的臨床意義。 方法 選擇解放軍第三〇二醫(yī)院2014年10月～2016年10月收治的HBV表面抗原（HBsAg）為陽(yáng)性的40例產(chǎn)婦及其新生兒作為研究對(duì)象，按照HBeAg陰性/陽(yáng)性分為HBeAg陽(yáng)性組（21例）和HBeAg陰性組（19例），分別抽取2 mL母親外周血和新生兒臍靜脈血，提取RNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄及RT-PCR擴(kuò)增，得到乙肝病毒DNA（HBx DNA），全長(zhǎng)型病毒轉(zhuǎn)錄體（fRNA），頓挫型病毒轉(zhuǎn)錄體（trRNA），利用瓊脂糖凝膠電泳顯示出產(chǎn)物。 結(jié)果 HBeAg陽(yáng)性組中母體HBx DNA陽(yáng)性率和fRNA陽(yáng)性率明顯高于HBeAg陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。根據(jù)母體HBx DNA表型分為HBx DNA陽(yáng)性組和HBx DNA陰性組。HBx DNA陽(yáng)性組中母體fRNA陽(yáng)性率、trRNA陽(yáng)性率和新生兒trRNA陽(yáng)性率高于HBx DNA陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 與fRNA、HBx DNA相比，trRNA更早出現(xiàn)在HBV母嬰傳播過程中，有利于確定新生兒HBV感染情況，具有一定的輔助診斷價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 乙型肝炎病毒；垂直傳播；全長(zhǎng)型病毒轉(zhuǎn)錄體；頓挫型病毒轉(zhuǎn)錄體

[中圖分類號(hào)] R512.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）05（c）-0117-04

[Abstract] Objective To explore the clinical significance of the test of serum hepatitis B virus transcription in maternal-infant vertical transmission. Methods From October 2014 to October 2016， 40 maternity patients with positive-HBV surface antigen （HBsAg） and their newborns in 302th Hospital of PLA were selected. All the patients divided into HBeAg positive group （21 cases） and HBeAg negative group （19 cases） according to the HBeAg negative/positive. 2 mL maternal peripheral blood and newborn navel blood were collected， the RNA was extracted， then the HBx DNA， fRNA， trRNA were got through reverse transcription and RT-PCR amplification， the products were showed by agarose gel electrophoresis. Results The positive rates of HBx DNA and fRNA of maternity patients in the HBeAg positive group were higher than those in the HBeAg negative groups， with statistically significant difference （P < 0.05）. Then the cases were divided into HBx DNA positive group and HBx DNA negative group according to the HBx DNA negative/positive. The positive rates of fRNA and trRNA of maternity patients and trRNA of newborns in the HBx DNA positive group were higher than those in the HBx DNA negative groups， with statistically significant difference （P < 0.05）. Conclusion TrRNA appeared in the process of mother-to-child transmission of HBV is earlier than fRNA， HBx DNA， which is helpful to determine neonatal HBV infection status， and has a certain auxiliary diagnostic value.

[Key words] Hepatitis B virus； Vertical transmission； fRNA； trRNA

乙型肝炎病毒（HBV）在發(fā)生慢性感染后可引起患者出現(xiàn)不同程度的肝實(shí)質(zhì)損傷，且絕大多數(shù)成年人慢性感染者均為嬰幼兒時(shí)期感染所致。母嬰傳播是目前臨床上最為常見的最重要的嬰幼兒HBV感染途徑，母體感染HBV的性質(zhì)、血清學(xué)狀態(tài)以及HBV病毒載量均于母嬰傳播的發(fā)生密切相關(guān)，合并HBV感染陽(yáng)性的母體可通過宮內(nèi)感染、產(chǎn)時(shí)傳播以及產(chǎn)后傳播等多種方式造成胎兒以及新生兒的HBV表面抗原（HBsAg）。目前臨床上主要以孕晚期感染HBV引起的新生兒感染作為常見，但HBV的母嬰傳播機(jī)制尚未研究清楚[1-2]。由于HBsAg和乙肝病毒DNA（HBx DNA）在新生兒感染早期的檢出率較低，且有研究顯示，HBV病毒的RNA檢出率要明顯高于相應(yīng)的DNA檢出率，但僅有部分臨床樣本中能檢測(cè)到RNA，在一定程度上限制了RNA在疾病早期輔助診斷中的應(yīng)用。為了進(jìn)一步制訂有效方法從而阻斷HBV母嬰傳播的途徑，本研究針對(duì)乙肝病毒轉(zhuǎn)錄體中全長(zhǎng)型病毒轉(zhuǎn)錄體（fRNA），頓挫型病毒轉(zhuǎn)錄體（trRNA）在母嬰傳播中的血清水平進(jìn)行檢測(cè)展開研究，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇解放軍第三〇二醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）在2014年10月～2016年10月收治的40例HBsAg陽(yáng)性的產(chǎn)婦及其新生兒作為研究對(duì)象，入院分娩的孕婦全部在初檢時(shí)接受了HBV病毒學(xué)檢測(cè)，HBeAg陰性/陽(yáng)性分為HBeAg陽(yáng)性組（21例）和HBeAg陰性組（19例）。新生兒中，男26例，女14例；HBeAg陽(yáng)性組中，男11例，女10例；HbeAg陰性組中，男15例，女4例。本次試驗(yàn)符合我院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)的審核，全部患者均簽署了關(guān)于本次試驗(yàn)的知情權(quán)同意書。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 方法

①孕26周時(shí)采集孕婦空腹肘部靜脈血2 mL，待新生兒分娩后24 h后采集2 mL的股靜脈血，靜置0.5 h后采用給予低溫離心處理，4℃，4000 r/min，離心20 min，將血清分離，按照高純度病毒核酸提取試劑盒上的操作說明提取核酸。將其中poly（A）RNA替換成為tRNA，作為載體RNA[3]。②對(duì)目的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)置特異性引物，擴(kuò)增病毒DNA采用50 μL反應(yīng)體系，循環(huán)條件：93℃ 100 s，90℃ 40 s，58℃ 50 s，70℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)，72℃ 15 min。trRNA、fRNA的RT-PCR系統(tǒng)在逆轉(zhuǎn)錄后采用半巢式PCR。PCR產(chǎn)物采用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果。試驗(yàn)所需儀器及試劑盒均由寶生物工程有限公司提供。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以 P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBsAg陽(yáng)性母體及新生兒血清HBx DNA及RNA檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

HBeAg陽(yáng)性組中，母體HBx DNA陽(yáng)性率和fRNA陽(yáng)性率均明顯高于HBeAg陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。兩組母體及新生兒trRNA陽(yáng)性率、新生兒HBx DNA陽(yáng)性率、fRNA陽(yáng)性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 不同HBx DNA表型母體與新生兒血清轉(zhuǎn)錄體檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

根據(jù)母體HBx DNA表型分為HBx DNA陽(yáng)性組和HBx DNA陰性組。HBx DNA陽(yáng)性組中母體fRNA陽(yáng)性率、trRNA陽(yáng)性率和新生兒trRNA陽(yáng)性率高于HBx DNA陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。兩組新生兒fRNA陽(yáng)性率和HBx DNA陽(yáng)性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。

3 討論

乙型肝炎作為臨床上一類較為常見的疾病，具有較高的發(fā)病率，據(jù)大量資料顯示，HBN在母嬰傳播中具有較高的比例，所謂母嬰傳播是指HBsAg陽(yáng)性的母親，尤其是伴有HBeAg陽(yáng)性母親將HBV傳播給胎兒及嬰兒，多通過宮內(nèi)傳播、產(chǎn)時(shí)傳播及產(chǎn)后傳播等途徑為主，對(duì)新生兒造成較大影響，合并HBV感染的孕婦早產(chǎn)率可明顯增加，其凝血功能也出現(xiàn)不同程度減退，嚴(yán)重時(shí)還可繼發(fā)胎盤絨毛間隙微血栓形成，使胎盤功能大大減退，明顯增加新生兒的窒息率、死胎率以及死亡率，但目前關(guān)于HBV母嬰傳播機(jī)制尚未明確[4-5]。隨著病毒學(xué)以及分子生物學(xué)研究的不斷深入以及相關(guān)科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，HBV母嬰垂直傳播的具體作用機(jī)制正在不斷明確中。早在20世紀(jì)80年代國(guó)外就有學(xué)者在HBsAg陽(yáng)性孕婦的流產(chǎn)死胎肝細(xì)胞中檢測(cè)到病毒相關(guān)抗原的表達(dá)以及DNA，提示宮內(nèi)感染與妊娠結(jié)局具有一定的相關(guān)關(guān)系。有報(bào)道指出，通過對(duì)新生兒HBV進(jìn)行早期診斷及檢測(cè)仍可作為影響及治療HBV感染的關(guān)鍵與難題，分析其原因是HBsAg及HBx DNA在新生兒感染中具有較低的早期檢出率，未能達(dá)到令臨床工作者滿意的目的[6-7]。另有研究資料顯示，病毒RNA的檢出率相比于對(duì)應(yīng)的DNA檢出率較高，主要是指部分樣本中僅可診斷出病毒RNA，這表明當(dāng)機(jī)體發(fā)生HBV感染后，病毒RNA的檢測(cè)更加的準(zhǔn)確，同時(shí)具有更高的靈敏度，可全面地反映出HBV感染狀態(tài)[8-10]。結(jié)合本次試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生HBV感染后的新生兒血液循環(huán)中可出現(xiàn)大量的HBV轉(zhuǎn)錄體，作為病毒感染早期的病毒代謝產(chǎn)物，將其作為診斷HBV的早期指標(biāo)具有重要的意義[11-13]。

有專家學(xué)者指出，fRNA與HBx DNA具有密切的相關(guān)性，并呈現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系，可將其作為病毒復(fù)制的一個(gè)重要指標(biāo)，其中trRNA可用于標(biāo)記病毒的持續(xù)感染狀態(tài)，這與本次研究結(jié)果基本一致[14-15]。另外，新生兒血清中病毒轉(zhuǎn)錄體中幾乎均以trRNA存在，這與母體血清中病毒轉(zhuǎn)錄體的情況完全不同，說明fRNA的轉(zhuǎn)錄以及HBxDNA的復(fù)制仍處于未被激活的狀態(tài)，或正處于某種抑制狀態(tài)下，隨著疾病的進(jìn)展及感染時(shí)間的延長(zhǎng)，這些陽(yáng)性病例即可慢慢進(jìn)展為顯性感染，而另一類的病例則不會(huì)出現(xiàn)顯性感染，但卻可以長(zhǎng)時(shí)間攜帶trRNA，并逐年進(jìn)展成為隱匿性的HBV感染，此時(shí)仍需要大量時(shí)間進(jìn)行觀察，并引足夠的重視[16-18]。對(duì)于隱匿性HBV感染患者，患兒體內(nèi)病毒可能已經(jīng)全部或大部分被清除，或者僅攜帶微量的有復(fù)制功能缺陷的HBV病毒，從而成為隱匿性感染患者。研究指出，隱匿性感染的發(fā)生可能與HBV基因的DNA序列變異以及HBV DNA在宿主細(xì)胞染色體中整合作用有關(guān)，同時(shí)與HBV的外周血單核細(xì)胞感染以及相關(guān)HBV免疫復(fù)合物的形成也具有一定的相關(guān)關(guān)系。隱匿性感染者的存在具有重要的臨床意義，其在免疫抑制的狀態(tài)下可重新進(jìn)去疾病的活動(dòng)期，進(jìn)展為典型的乙型肝炎，現(xiàn)已成為熱議的公眾健康問題。

另外，研究中發(fā)現(xiàn)，母體自身的免疫功能狀態(tài)及其血液循環(huán)中的HBV病毒載量與HBV的母嬰垂直傳播的而發(fā)生具有影響的相關(guān)關(guān)系，合并HBV陽(yáng)性的孕婦，其臍帶血的HBx DNA陽(yáng)性率明顯偏高。本研究結(jié)果顯示，母體為trRNA陽(yáng)性的新生兒中trRNA的檢出率要明顯高于母體為trRNA陰性的新生兒，說明母體與新生兒血中trRNA的檢出關(guān)系更加密切，也一定程度表明受感染的新生兒血中出現(xiàn)的標(biāo)志物可出現(xiàn)在不同時(shí)相中，但仍值得進(jìn)一步研究與證實(shí)[19]。另外，當(dāng)新生兒血清中存在HBsAg時(shí)通常被認(rèn)為處于一種具有保護(hù)作用的狀態(tài)下，而非完全的非感染狀態(tài)，結(jié)合本次研究結(jié)果，可見HBsAg陽(yáng)性的新生兒中HBxDNA及fRNA檢出率要明顯低于trRNA[20]。為此，可認(rèn)為trRNA相比于fRNA、HBxDNA相比，更早出現(xiàn)在HBV母嬰傳播過程中，有利于確定新生兒HBV感染情況，具有一定的輔助診斷價(jià)值。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 李韋杰，李伯安，趙景民，等.564例慢性乙型肝炎患者肝組織乙型肝炎病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA與血清HbsAg定量檢測(cè)結(jié)果分析[J].中華肝臟病雜志，2011，11（19）：815-817.

[2] 楊力，陸倫根. 2012年EASL臨床實(shí)踐指南：慢性乙肝病毒感染的診治簡(jiǎn)介[J].臨床肝膽病雜志，2012，28（6）：405-409.

[3] 施志龍，陳繼梅.1546 例乙型肝炎患者血清 HBV-M、HBV-DNA、肝功能檢測(cè)結(jié)果分析[J].中華全科醫(yī)學(xué)，2011， 9（6）：966-968.

[4] Kim YJ，Cho HC，Choi MS，et al. The change of the quantitative HBsAg level during the natural course of chronic hepatitis B [J]. Liver Int，2011，31（6）：817-823.

[5] Jang JW，Yoo SH，Kwon JH，et al. Serum hepatitis B surface antigen levels in the natural history of chronic hepatitis B infection [J]. Aliment Pharmacol Ther，2011，34（11-12）：1337-1346.

[6] 李明慧，謝堯，邱國(guó)華，等.慢性乙型肝炎HBsAg，HBeAg和DNA變化的相關(guān)性研究[J].中華肝臟病雜志，2011， 25（1）：26-28.

[7] Park H，Lee JM，Seo JH，et al. Predictive values of HBsAg quantification for determining the clinical course of genotype C HBeAg-negative carriers [J]. Liver Int，2012， 32（5）：796-802.

[8] 李慶彥，李慶方，劉春華，等.聯(lián)合免疫后乙型肝炎病毒感染母嬰傳播相關(guān)因素的臨床研究[J].中華醫(yī)學(xué)感染學(xué)雜志，2016，26（2）：424-425.

[9] 尹玉竹，周瑾，張培珍，等.影響阻斷乙型肝炎病毒母嬰傳播的危險(xiǎn)因素分析[J].中華肝臟病雜志，2013，21（2）：105-106.

[10] Fujisaki S，Yokomaku Y，Shiino T，et al. Outbreak of infeetions by hepatitis B virus genotype a and tran？鄄smission of genrtic drug resistance in patients coinfected with HIV-1 in Japan [J]. J Clin Microbiol，2011，49（3）：1017-1018.

[11] Andersson MI，Rajbhandari R，Kew MC，et al. Mother-to-child transmission of hapatitis B virus in sub-Saharan Africa：time to act [J]. Lancet Glob Health，2015，3（7）：358-359.

[12] Bagny A，Bathaix YF，Bangoura D，et al. Evaluation of midwives practice for the prevention of mother-to-child transmission of hepatits B in Abidjan（Ivory Coast）[J]. Med Sante Trop，2015，25（2）：206-209.

[13] 鐘鳳娣.乙型肝炎病毒母嬰傳播相關(guān)因素分析[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012，24（2）：69-70.

[14] Hashemi N，Araya V，Tufail K，et al. An extended treat？鄄ment protocol with pegylated interferon and ribavirin for hepatitis C recurrence after liver transplantation [J]. World J Hepatol，2011，3（7）：198-204.

[15] 覃小梅，譚曉明，秦玉蘭.乙型肝炎患者免疫球蛋白檢驗(yàn)的臨床意義[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，10（9）：702-703.

[16] Lalezari J，Asmuth D，Casirb A，et al. Short-term monotherapy with IDXI84，a liver-targeted nueleotide polymeric inhibitor，in patients with chronic hepatitis C virus infection [J]. Antimierob Agents Chemother，2012， 56（12）：6372-6378.

[17] Qureshi H. The evidence of mother to child transmission of hapatitis B virus infection in Pakistan and the need for hepatitis B immunization policy change [J]. J Park Med Assoc，2014，64（8）：978-979.

[18] Kang W，Ding Z，Shen L，et al. Risk factors associated with immunophylaxis failure against mother to child tra？鄄nsmission of hepatitis B virus and hapatits B vaccination sta？鄄tus in Yunnan province，China [J]. Vaccine，2014，32（27）：3362-3363.

[19] 陳川英，涂相林，程全紅，等.慢性乙型肝炎患者妊娠早期替比夫定抗病毒的療效及母嬰阻斷的臨床觀察[J].中華肝臟病雜志，2015，23（1）：9-12.

[20] 莊權(quán)權(quán)，林志航，蔣燕成，等.慢性乙型肝炎病毒感染患者血清免疫調(diào)節(jié)因子檢測(cè)的臨床意義[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2016，26（1）：1-3.

（收稿日期：2017-02-16 本文編輯：李岳澤）