克羅恩病CNTNAP3基因拷貝數(shù)變異及其意義*

黃美蘭 喬宇琪 沈 駿 蔡晨雯 徐錫濤 陳勝良 冉志華&

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院南院消化內(nèi)科1(201112) 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院消化內(nèi)科 上海市消化疾病研究所 上海市炎癥性腸病研究中心2

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·論 著·

克羅恩病CNTNAP3基因拷貝數(shù)變異及其意義*

黃美蘭1#喬宇琪2沈 駿2蔡晨雯2徐錫濤2陳勝良1冉志華2&

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院南院消化內(nèi)科1(201112) 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院消化內(nèi)科 上海市消化疾病研究所 上海市炎癥性腸病研究中心2

背景：DNA拷貝數(shù)變異是人類疾病的重要致病因素，可能參與了炎癥性腸病(IBD)的發(fā)病機制和病理過程。目的：探討CNTNAP3基因在克羅恩病(CD)中的拷貝數(shù)變異情況及其意義。方法：納入2009年7月—2010年12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院收治的活動期CD患者101例，同期80例健康體檢者作為正常對照。采集CD患者外周血或腸黏膜標本，以比較基因組雜交芯片(aCGH,n=8)和熒光定量PCR(n=93)篩選、驗證CNTNAP3基因拷貝數(shù)變異，ELISA法(n=55)檢測CNTNAP3編碼蛋白表達。結(jié)果：aCGH檢測顯示初發(fā)CD患者染色體9p13區(qū)域(含CNTNAP3基因)存在大片段拷貝數(shù)擴增；熒光定量PCR驗證并確認CD組外周血CNTNAP3基因拷貝數(shù)顯著高于正常對照組，非激素治療組差異更為明顯(208 616.4±126 984.7和233 453.3±113 520.8對161 750.2±53 940.3,P<0.05和P<0.01)。在各項CD臨床參數(shù)中，僅吸煙史與CNTNAP3基因拷貝數(shù)擴增顯著相關(guān)(P<0.05)，但拷貝數(shù)明顯擴增者的血漿CNTNAP3水平與正常對照組無明顯差異(P>0.05)，與簡化CD內(nèi)鏡評分無相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論：CNTNAP3基因拷貝數(shù)擴增可能參與了中國CD人群的發(fā)病，激素治療和吸煙可能是影響該基因拷貝數(shù)變異的因素；血漿CNTNAP3水平不能用于區(qū)分CD患者與健康人。本研究結(jié)論有待進一步驗證。

炎癥性腸??； Crohn??； DNA拷貝數(shù)變異； CNTNAP3基因； 比較基因組學(xué)

Background: DNA copy number variation is an important pathogenic factor of human diseases and might be involved in the pathogenesis and pathological process of inflammatory bowel disease (IBD). Aims: To investigate the copy number variation of CNTNAP3 gene and its significance in Crohn’s disease (CD). Methods: A total of 101 active CD patients admitted from Jul. 2009 to Dec. 2010 at Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University were enrolled. Eighty healthy subjects were served as controls. Peripheral blood or intestinal mucosa samples of CD patients were collected, and the copy number variation of CNTNAP3 gene was screened and validated by array-based comparative genomic hybridization (aCGH,n=8) and real-time PCR (n=93); expression of CNTNAP3 encoding protein was determined by ELISA (n=55). Results: A large fragment copy number amplification was revealed by aCGH at chromosome 9p13 region (including CNTNAP3 gene) in untreated CD patients. Real-time PCR confirmed that the copy number of CNTNAP3 gene was amplified in peripheral blood of CD patients, especially steroid-naive patients as compared with the normal controls (208 616.4±126 984.7 and 233 453.3±113 520.8vs. 161 750.2 ±53 940.3,P<0.05 andP<0.01). In the clinical parameters analyzed in this study, only smoking was significantly correlated with CNTNAP3 copy number amplification (P<0.05). However, there was no significant difference in plasma CNTNAP3 level between CD patients with amplified copy number and normal controls (P>0.05). Furthermore, the plasma CNTNAP3 level in CD patients with amplified copy number was not correlated with the simplified endoscopic score for CD (P>0.05). Conclusions: Copy number amplification of CNTNAP3 gene might be involved in the pathogenesis of CD in Chinese population. Glucocorticoid treatment and smoking might affect the copy number variation of CNTNAP3 gene. Plasma CNTNAP3 level cannot discriminate CD patients from healthy subjects. Conclusions of this study needs to be further demonstrated and discussed.

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一類慢性復(fù)發(fā)性腸道炎癥性疾病，主要包括克羅恩病(Crohn’s disease, CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcer-ative colitis, UC)，其病因和發(fā)病機制與遺傳、環(huán)境、微生物、免疫因素間復(fù)雜的相互作用有關(guān)[1]，但確切病因仍未完全闡明。IBD各年齡段均可發(fā)病，但以年輕成人居多。西方國家如歐洲、北美、澳洲等地區(qū)IBD發(fā)病率較高，為10～70/10萬[2]。CD是一種可累及全消化道各層次的節(jié)段性非特異性炎癥性疾病[3]，既往因在我國較罕見而未得到充分重視。近年來，隨著生活方式、環(huán)境因素的改變以及診斷水平的提高，我國CD患病率逐年上升[2]，已成為主要腸道疾病之一。

研究發(fā)現(xiàn)DNA拷貝數(shù)變異(copy number vari-ations, CNVs)是人類疾病的重要致病因素，其相關(guān)病因?qū)W研究近年廣泛開展[4-5]。CD作為一種遺傳因素參與發(fā)病的疾病，CNVs在其發(fā)病機制中作用的研究尚處于探索階段。目前已發(fā)現(xiàn)的與CD發(fā)病有關(guān) 的CNVs有染色體8p23編碼β-防御素2的DEFB2基因拷貝數(shù)下調(diào)和編碼α-防御素1-3的DEFA1A3基因拷貝數(shù)上調(diào)、染色體6p21中樞主要組織相容性復(fù)合體區(qū)域補體C4基因變異體C4S拷貝數(shù)上調(diào)和C4L拷貝數(shù)下調(diào)等[6-8]。本研究通過分析中國CD人群的CNVs及其變異情況，以期篩選新的與CD發(fā)病相關(guān)的CNVs區(qū)域以及相關(guān)基因。

材料與方法

一、研究對象

納入2009年9月—2010年3月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院收治的CD患者8例，以比較基因組雜交芯片(array-based comparative genomic hybridization, aCGH)技術(shù)篩選CNVs。另納入2009年7月—2010年12月收治的CD患者93例用于篩選結(jié)果的驗證。入組患者臨床、實驗室、內(nèi)鏡、影像學(xué)和病理學(xué)表現(xiàn)符合我國IBD共識中的CD診斷標準，簡化CD活動指數(shù)(CDAI)≥5分，均為活動期[9]。收集同期仁濟醫(yī)院健康體檢中心健康人80例作為正常對照，入選者體檢顯示無特殊疾病(自身免疫性疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、心肺肝腎功能異常、近期消化道炎癥性疾病、IBD家族史、闌尾切除術(shù)史、腫瘤史等)。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準，受檢者留取標本前均簽署知情同意書。

二、方法

1. 臨床資料采集：錄入所有受檢者的人口學(xué)資料，包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、城郊居住情況、學(xué)歷、吸煙史等；錄入CD患者相關(guān)臨床資料，包括實驗室、內(nèi)鏡、影像學(xué)、病理學(xué)檢查報告、蒙特利爾分型(確診年齡：≤16歲、17～40歲、>40歲；病變部位：末端回腸、結(jié)腸、回結(jié)腸、累及上消化道；疾病行為：非狹窄非穿透、狹窄、穿透、肛周病變)[9]、治療方式(激素、免疫抑制劑、生物制劑、無上述治療)等。

2. 標本采集：行aCGH檢測的CD患者中6例留取病變處腸黏膜標本4塊，0.9% NaCl溶液清洗后速轉(zhuǎn)至液氮中保存；另2例留取外周靜脈血 6 mL于EDTA真空抗凝管中，速轉(zhuǎn)至深低溫冰箱保存。8例標本于短期內(nèi)送上?？党缮锕こ逃邢薰拘衋CGH檢測。所有留取外周靜脈血標本的受試者均為空腹12 h后次日清晨肘正中靜脈采血，儲存于EDTA真空抗凝管。

3. 樣品DNA抽提：采集的標本于2 h內(nèi)使用QIAamp DNA Mini Kit或QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN)行DNA抽提，操作步驟參照試劑盒說明書。所得DNA以200 μL AE緩沖液或pH 7.0蒸餾水溶解，置于1.5 mL EP管中，-20 ℃保存。

4. aCGH檢測：使用NimbleGen 2.1M比較基因組雜交芯片(Roche 公司)，主要步驟：樣品DNA抽提；DNA樣品提純和質(zhì)控；超聲裂解DNA；樣品標記；準備雜交樣品；Nimble芯片混合器混合樣品；上樣和樣品雜交；洗滌雜交芯片；雙色芯片掃描；數(shù)據(jù)提取分析。以標準化正常男性外周血基因組DNA(6人混合，Promega Corporation)作為正常對照。

5. 相對標準曲線法熒光定量PCR檢測外周血CNTNAP3 DNA拷貝數(shù)：此步驟納入CD患者93例和正常對照者80例。

采用Primer Express 3.0軟件設(shè)計TaqMan探針。CNTNAP3: F 5’-TGC CGT AGC TCA GTG CTG TT-3’, R 5’-AAG GGC ACA CCA AGT GTA GGA-3’, FAM-TTC TTC ACA CAC AGG GCA CGC ACA-TAMRA，擴增片段大小141 bp；β-actin(內(nèi)參): F 5’-GGA AAT CGT GCG TGA CAT TAA G-3’, R 5’-GCT CAT TGC CAA TGG TGA TG-3’, FAM-TAC GTC GCC CTG GAC TTC GAG CA-TAMRA。

標準品標準曲線制備：選取高質(zhì)量人外周血樣品 為模板，以不加模板者作為陰性對照，進行目的基 因片段熒光定量PCR擴增。PCR循環(huán)條件(Applied Biosystems 9700 PCR儀)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)40次；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。擴增片段行瓊脂糖凝膠電泳。對PCR樣品進行割膠純化，連接，轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒提取，制備標準曲線。

使用目的基因探針和內(nèi)參β-actin探針同時進行樣品熒光定量PCR擴增，每板實驗中均制備一條標準曲線。PCR循環(huán)條件(Applied Biosystems 9700 PCR儀)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)40次；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

6. ELISA法檢測血漿CNTNAP3水平：此步驟納入外周血CNTNAP3基因拷貝數(shù)明顯擴增的CD患者55例(將93例患者按拷貝數(shù)檢測值從高到低排序，取前55例)和正常對照者62例。外周血樣品3 000 r/min 離心10 min，分離血漿，-80 ℃保存。使用CNTNAP3血漿蛋白ELISA試劑盒(Adlitteram Diagnostic Laboratories)，按說明書進行操作，于酶標儀450 nm波長處讀取吸光度(A)值，根據(jù)標準品0、0.625、1.25、2.5、5、10 ng/mL的A值繪制標準曲線，計算CNTNAP3水平。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般資料

行aCGH檢測的8例CD患者中6例為初發(fā)，未使用過激素、免疫抑制劑、生物制劑；2例已確診數(shù)年，曾接受激素治療，但未使用過免疫抑制劑和生物 制劑。8例患者男女比例為1∶7，平均年齡(30.62±15.19)歲；病變部位：末端回腸2例，結(jié)腸3例，回結(jié)腸3例；疾病行為：有狹窄無穿透3例，肛周病變2例；best CDAI 223～369，平均 292.42±69.89。8例患者均無吸煙史。

行外周血CNTNAP3基因拷貝數(shù)檢測的93例CD患者中，男性57例，女性36例，男女比例為1.6∶1，年齡14～58歲，平均(30.96±10.81)歲；發(fā)病年齡13～56歲，平均(28.68±10.69)歲，平均病程27個月；BMI (20.11±2.42) kg/m2，血紅蛋白(118±26) g/L，18例(19.4%)有吸煙史。病變部位：末端回腸33例(35.5%)，結(jié)腸22例(23.7%)，回結(jié)腸37例(39.8%)，累及上消化道6例(6.5%，其中5例為回結(jié)腸型)；疾病行為：非狹窄非穿透45例(48.4%)，狹窄38例(40.9%)，穿透10例(10.8%)，肛周病變10例(10.8%)。治療情況：激素62例(66.7%)，免疫抑制劑(硫唑嘌呤、甲氨蝶呤等)45例(48.4%)，生物制劑(英夫利昔單抗)6例(6.5%)，無上述治療31例(33.3%)。

行外周血CNTNAP3基因拷貝數(shù)檢測的80例正常對照者中，男性55例，女性25例，男女比例為2.2∶1，年齡18～59歲，平均(34.57±12.19)歲，BMI (22.89±1.90) kg/m2，血紅蛋白(145±13) g/L，23例(28.8%)有吸煙史。

二、aCGH檢測結(jié)果

以log2 ratio≥0.2為篩選標準分析aCGH檢測結(jié)果，CD患者差異DNA片段大小為6 kb～31.6 Mb，log2 ratio范圍為-1.1～0.84。送檢標本DNA拷貝數(shù)增加或減少片段的個數(shù)和變異程度有一定差異。最大的CNV片段位于染色體9p13區(qū)域(log2 ratio≥0.4)，為拷貝數(shù)擴增，片段大小約31.6 Mb，存在于7例標本中(圖1)，僅1例曾接受激素、5-氨基水楊酸、中藥治療的女性患者未檢出此CNV。該片段包含61個基因，經(jīng)分析篩選出其中相關(guān)研究甚少的CNTNAP3基因作進一步驗證和分析。

A～F為6例腸黏膜標本，G、H為2例外周血標本，標本F無9p13區(qū)域CNV

圖1 CD患者染色體9p13區(qū)域CNV情況

三、外周血CNTNAP3基因拷貝數(shù)

Real-time PCR檢測顯示，CD組外周血CNTNAP3基因拷貝數(shù)為208 616.4±126 984.7，顯著高于正常對照組的 161 750.2±53 940.3(P<0.05)。按是否接受激素、免疫抑制劑或生物制劑治療進行分層分析(各亞組外周血CNTNAP3基因拷貝數(shù)見表1)，結(jié)果顯示非激素治療組與正常對照組間差異更為顯著(P<0.01)，激素治療組與正常對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖2)；免疫抑制劑治療組和非免疫抑制劑治療組與正常對照組相比、生物制劑治療組和非生物制劑治療組與正常對照組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 各組外周血CNTNAP3基因拷貝數(shù)比較

四、 CNTNAP3基因拷貝數(shù)與CD臨床參數(shù)的關(guān)系

單因素分析顯示，CD患者外周血CNTNAP3基因拷貝數(shù)僅與吸煙史有關(guān)(P<0.05)，與性別、確診年齡、病程、病變部位、疾病行為、貧血情況以及激素、免疫抑制劑、生物制劑治療均無相關(guān)性(P>0.05)(表1)。由于僅吸煙史P<0.1，故未進一步行Logistic回歸分析。盡管本次分析未發(fā)現(xiàn)不同病變部位CD間的CNTNAP3基因拷貝數(shù)存在顯著差異，但可觀察到病變累及范圍越廣、CNTNAP3基因拷貝數(shù)越多的趨勢。

表1 CNTNAP3基因拷貝數(shù)與CD臨床參數(shù)的關(guān)系

五、血漿CNTNAP3水平與CD臨床參數(shù)的關(guān)系

55例CNTNAP3基因拷貝數(shù)明顯擴增的CD患者血漿CNTNAP3水平在1.714～2.169 ng/mL之間，平均(1.914±0.113) ng/mL；62例正常對照者血漿CNTNAP3水平在1.668～2.208 ng/mL之間，平均(1.948±0.129) ng/mL，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.08)(圖3A)。進一步的分層分析顯示，在CNTNAP3基因拷貝數(shù)擴增的CD患者中，血漿CNTNAP3水平與患者年齡、BMI和簡化CD內(nèi)鏡評分(SES-CD)均無相關(guān)性(圖3B-D)。

圖3 CNTNAP3基因拷貝數(shù)擴增CD患者血漿CNTNAP3水平及其與年齡、BMI和SES-CD的關(guān)系

討 論

DNA CNVs是人類疾病的重要致病因素，可能參與了IBD的發(fā)病機制和病理過程。本研究應(yīng)用NimbleGen 2.1M比較基因組雜交芯片對8例活動期CD患者的腸黏膜或外周血標本行aCGH檢測，發(fā)現(xiàn)其中7例染色體9p13區(qū)域有一段31.6 Mb大小的CNV片段，而1例此區(qū)域無大片段CNV的患者既往曾接受包括激素在內(nèi)的多種藥物治療，據(jù)此推測這一大片段CNV在初發(fā)CD患者中可能是一個普遍現(xiàn)象。所發(fā)現(xiàn)的CNV片段中包含61個已知基因和一些基因間非編碼區(qū)域，61個已知基因中僅CNTNAP3和PGM5基因功能明確，前者編碼蛋白屬于細胞識別分子NCP家族，可介導(dǎo)神經(jīng)元與膠質(zhì)細胞間的相互作用，后者則編碼葡萄糖磷酸變位酶，在碳水化合物代謝過程中起關(guān)鍵作用[10]。由于PGM5編碼蛋白的功能主要是在物質(zhì)和能量代謝方面，因此本研究將目標聚焦于目前對其功能研究不多的CNTNAP3基因，探討其CNV情況及其意義。

研究進一步收集93例臨床確診CD患者的外周血標本行CNTNAP3基因拷貝數(shù)檢測，并與同期80例健康人進行比較，結(jié)果證實aCGH檢測結(jié)果可靠，CNTNAP3基因在CD患者外周血標本中確實存在拷貝數(shù)擴增。分層分析顯示該基因拷貝數(shù)擴增在非激素治療組中更為顯著，在激素治療組中則與正常對照組無明顯差異，在免疫抑制劑與非免疫抑制劑、生物制劑與非生物制劑治療者中則未觀察到類似現(xiàn)象。加之a(chǎn)CGH檢測惟一一例無9p13區(qū)域大片段CNV的患者亦有激素使用史，提示糖皮質(zhì)激素可能通過一些目前未知的機制影響CNTNAP3基因拷貝數(shù)，但本研究未發(fā)現(xiàn)硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、英夫利昔單抗對CNTNAP3基因拷貝數(shù)有影響，表明不同臨床用藥治療CD的機制可能存在差異。有研究[11]發(fā)現(xiàn)，在ETV6/RUNX1融合基因陽性急性淋巴細胞白血病患者中，較之初診患者，一些糖皮質(zhì)激素信號途徑相關(guān)基因如BMF、NR3C1以及錯配修復(fù)途徑相關(guān)基因在復(fù)發(fā)病例中存在明顯的拷貝數(shù)下調(diào)變異。至于激素通過何種機制或信號途徑引起CD患者CNTNAP3基因拷貝數(shù)下調(diào)，該基因是否為激素信號途徑中的靶基因，尚需進一步探討。

本研究對外周血CNTNAP3基因拷貝數(shù)與CD患者臨床參數(shù)關(guān)系的分析顯示，該基因CNV與患者性別、確診年齡、病程、病變部位、疾病行為、貧血情況等均無相關(guān)性，但與吸煙史密切相關(guān)，有吸煙史者該基因拷貝數(shù)較無吸煙史者顯著增加。吸煙是目前公認的CD發(fā)病的危險因素[12]，吸煙可抑制腸上皮細胞中的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性、抑制NOD2基因轉(zhuǎn)錄和趨化因子CCL20、白細胞介素-8(IL-8)分泌[13]，導(dǎo)致腸黏膜對致病菌免疫反應(yīng)異常和防御功能減弱，從而加重CD腸道炎癥反應(yīng)，故臨床上建議CD患者必須戒煙。吸煙與CNTNAP3基因拷貝數(shù)擴增之間的確切關(guān)系需后期進一步探索。盡管本研究中外周血CNTNAP3基因拷貝數(shù)在不同病變部位CD間的差異未達統(tǒng)計學(xué)意義，但回結(jié)腸型和累及上消化道型CD的拷貝數(shù)有較單純末端回腸型和單純結(jié)腸型CD上調(diào)的趨勢。本組患者按病變部位分層后各亞組例數(shù)較少，可能影響結(jié)果判斷，CD病變部位與CNTNAP3基因拷貝數(shù)之間的相關(guān)性有待后續(xù)擴大樣本量求證。

本研究對外周血CNTNAP3基因拷貝數(shù)擴增CD患者行血漿CNTNAP3水平檢測，發(fā)現(xiàn)這部分患者的血漿CNTNAP3水平與正常對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。對這部分患者血漿CNTNAP3水平與部分臨床參數(shù)關(guān)系的分析顯示，其與患者年齡、BMI、SES-CD均無相關(guān)性。CNTNAP3主要是一種膜蛋白而非分泌性蛋白，在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的細胞識別中發(fā)揮作用，由此推測可能只有極少部分的CNTNAP3蛋白以血漿游離形式存在，因此無法根據(jù)血漿CNTNAP3水平區(qū)分CD患者與健康人。由于本研究樣本量較小，此結(jié)果有待后續(xù)擴大樣本量進行驗證，并通過分層分析研究CNTNAP3是否在某些特定CD人群的外周血中存在異于一般人群的特殊表達。

對一些復(fù)雜疾病的研究發(fā)現(xiàn)，盡管CNVs不是惟一的致病途徑，但確實可導(dǎo)致不同程度的基因表達差異，在疾病發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[4-5]。本研究利用CNV相關(guān)研究方法發(fā)現(xiàn)，CNTNAP3基因拷貝數(shù)擴增可能參與了中國CD人群的發(fā)病，而激素治療和吸煙可能是影響該基因CNV的因素；血漿CNTNAP3水平不能用于區(qū)分CD患者與健康人。上述發(fā)現(xiàn)為CD發(fā)病機制的研究以及尋求更有效的臨床治療途徑提供了線索。期待未來會有更多研究對這一結(jié)論進行驗證。

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(2017-03-03收稿；2017-04-11修回)

CNTNAP3 Copy Number Variation and its Significance in Crohn’s Disease

HUANGMeilan1,QIAOYuqi2,SHENJun2,CAIChenwen2,XUXitao2,CHENShengliang1,RANZhihua2.

1DivisionofGastroenterologyandHepatology,SouthRenjiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai(201112);2DivisionofGastroenterologyandHepatology,RenjiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaoTongUniversity;ShanghaiInstituteofDigestiveDisease;ShanghaiInflammatoryBowelDiseaseResearchCenter,Shanghai

Correspondence to: RAN Zhihua, Email: ranzhihua1962@163.com

Inflammatory Bowel Disease; Crohn Disease; DNA Copy Number Variations; CNTNAP3 Gene; Comparative Genomics

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.06.002

國家自然科學(xué)基金(81500422)

#Email: melania000@163.com

&本文通信作者，Email: ranzhihua1962@163.com