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    淺談甲基化抑制劑5-Aza-CdR對(duì)肺癌A549細(xì)胞株DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1及c-myc、MKi-67、p53基因表達(dá)的影響*

    2017-07-05 03:32:04彭奕華張宏華
    黑龍江醫(yī)藥 2017年1期
    關(guān)鍵詞:癌基因基轉(zhuǎn)移酶細(xì)胞株

    彭 峰,彭奕華,張宏華

    (韶關(guān)市粵北人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科,廣東 韶關(guān) 512026)

    近年來(lái),肺癌的發(fā)病率逐年上升,嚴(yán)重地威脅到了人們的健康生活,作為一種常見(jiàn)的惡性腫瘤,其中的病因還沒(méi)有完全明確,其中的發(fā)展變化涉及的是一個(gè)多階段的復(fù)雜過(guò)程[1]。在肺癌發(fā)生的過(guò)程中,只要涉及的環(huán)節(jié)有抑癌基因的活性降低、癌基因的表達(dá)變得活躍、DNA的修復(fù)基因缺失,任何一個(gè)環(huán)節(jié)都有可能造成肺癌的發(fā)生,研究發(fā)現(xiàn)[2]:發(fā)生腫瘤的主要的原因是基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化過(guò)程發(fā)生了異常的變化,甲基化修飾出現(xiàn)異常的情況時(shí),基因的表達(dá)、細(xì)胞的分化及繁殖都會(huì)出現(xiàn)異常,嚴(yán)重的威脅到了人們的正常生活。

    本文主要研究了甲基化抑制劑5-氮雜-2'脫氧胞苷 (5-Aza-CdR)對(duì)肺癌A549細(xì)胞株DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)及c-myc、MKi-67、p53基因表達(dá)的影響,其中采用的是分組對(duì)比的研究方式,通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)采用甲基化抑制劑5-Aza-CdR可以降低肺癌A549細(xì)胞中的DNMT1及c-myc、MKi-67、p53基因表達(dá)量,升高p53基因的表達(dá)量,其中具體的數(shù)據(jù)分析如下。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    在進(jìn)行研究的過(guò)程中選取肺癌A549細(xì)胞株作為主要的研究對(duì)象,所用到的材料有甲基化抑制劑5-Aza-CdR,采用的培養(yǎng)基為1640,采用的引物主要有:

    DNMT1:上游5’ ATCTAGCTGCCAAACGGAGG-3’

    下游5’ CTGAATGCACTTGGGGAGGGT-3’,191 bp;c-myc:上游5’ TACAACACCCGAGCAAGGAC-3’

    下游5’ TTCTCCTCCTCGT-CGCAGTA-3’,259 bp;MKi-67:上游5’ ACACTCCACCTGTCCTGAAG-3’

    下游5’ AG-GCAGGTTGCCACTC-TTTC-3’,251 bp;p53:上游5’ TCTTGTTCCCCACTGACAGC-3’

    下游 5’ GTGCAG-GCCAACTTGTTCAG-3’,159 bp;β-action:上游5’ TGGCACCCAGCACAATGAA-3’

    下游5’CTAAGT-CATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’,186bp;SYBR Premix Ex TaqTMⅡ,DNMT1 及 c-myc、MKi-67、p53 單克隆抗體及二抗。

    1.2 方法

    1.2.1 A549細(xì)胞株的培養(yǎng)及傳代:在對(duì)A549細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)的過(guò)程中,選取的培養(yǎng)液為濃度是10%的胎牛的血清1640培養(yǎng)溶液,放入適宜的環(huán)境中對(duì)肺癌A549細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)的細(xì)胞群中選擇細(xì)胞的匯合率達(dá)到了75%左右的細(xì)胞,對(duì)與貼壁緊密并且牢固的細(xì)胞優(yōu)先選擇,保證細(xì)胞處于一個(gè)良好的生長(zhǎng)狀態(tài),這樣可極大的保證傳代細(xì)胞的質(zhì)量,傳代的過(guò)程中,結(jié)合實(shí)際的情況選擇的時(shí)間為3d左右,將最終操作完成的傳代細(xì)胞進(jìn)行收集,一部分為觀察組使用,另一部分為對(duì)照組,在觀察組中加入5-Aza-CdR,其中的濃度為5μmol/L,對(duì)照組不加入任何藥物。

    1.2.2 采用FQ-PCR對(duì)mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè):將合成的cDNA作為模板,并且按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說(shuō)明書上的內(nèi)容進(jìn)行操作,其中引物上游為0.8 μL,下游為ROX Reference Dye(50×)0.40 μL,其中 cDNA 模板 2 μL,ddH2O 6 μL,擴(kuò)增參數(shù)為 95℃ 30 min;95℃ 5 s;60℃ 30 s,在循環(huán)結(jié)束之后進(jìn)行熒光采集檢測(cè)。

    1.2.3 檢測(cè)蛋白表達(dá):對(duì)蛋白的濃度進(jìn)行檢測(cè),主要采用的是蛋白裂解液,并且進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜,需要的時(shí)間大約為1h左右,封閉放入溫室后進(jìn)行孵育工作,并進(jìn)行顯色及曝光的處理。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    各個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行獨(dú)立重復(fù)的三次操作,統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16.0分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料利用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較行t檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 A549細(xì)胞株的培養(yǎng)及傳代

    對(duì)兩組的細(xì)胞進(jìn)行藥物處理3d之后,觀察兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,研究發(fā)現(xiàn)觀察組的細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯的抑制,具體的數(shù)據(jù)分析如表1。

    表1 兩組DNMT1及c-myc、MKi-67、p53表達(dá)量對(duì)比(±s)

    表1 兩組DNMT1及c-myc、MKi-67、p53表達(dá)量對(duì)比(±s)

    項(xiàng)目mRNA組別觀察組對(duì)照組tP--DNMT1 0.32±0.01 1.03±0.05 82.377 c-myc 0.32±0.02 1.01±0.02 144.324 p53 1.56±0.03 0.85±0.07 22.528<0.05 MKi-67 0.25±0.01 0.97±0.02 190.494

    2.2 兩組細(xì)胞DNMT1及c-myc、MKi-67、p53蛋白表達(dá)

    通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)觀察組的DNMT1及c-myc、MKi-67的蛋白表達(dá)量明顯的低于對(duì)照組,p53蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組,具體的數(shù)據(jù)分析如表2。

    表2 兩組細(xì)胞DNMT1及c-myc、MKi-67、p53蛋白表達(dá)(±s)

    表2 兩組細(xì)胞DNMT1及c-myc、MKi-67、p53蛋白表達(dá)(±s)

    項(xiàng)目蛋白組別觀察組對(duì)照組t P--DNMT1 0.42±0.02 1.20±0.05 85.689 c-myc 0.43±0.02 1.30±0.10 4.678 p53 1.90±0.05 0.71±0.01 138.068<0.05 MKi-67 0.32±0.02 0.50±0.08 12.917

    3 討論

    作為一種DNA的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑,5-Aza-CdR能夠迅速的與DNA的甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行結(jié)合,使得酶的活性降低,通過(guò)降低甲基化的水平來(lái)對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)整,因此在由于啟動(dòng)子甲基化造成的基因表達(dá)的不充分甚至缺失的疾病中,經(jīng)常采用5-Aza-CdR來(lái)進(jìn)行治療[3]。c-myc是一種可異位基因,同時(shí)也是myc基因家族中的核心組成部分,它是一種可調(diào)節(jié)的基因,主要作用使細(xì)胞進(jìn)行不斷的生長(zhǎng)、繁殖,并且可以促使細(xì)胞分裂,與腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系,該基因在正常的細(xì)胞轉(zhuǎn)為癌細(xì)胞的過(guò)程中起著重要的作用[4]。MKi-67作為一種核抗原與增殖細(xì)胞有著密切的關(guān)系,如細(xì)胞的有絲分裂,在繁殖的過(guò)程中必不可少,該細(xì)胞的表達(dá)范圍除了G0期以外的各個(gè)周期的細(xì)胞,成為了判斷細(xì)胞增殖活性的重要的指標(biāo),該蛋白是唯一一個(gè)與細(xì)胞的周期及增殖活動(dòng)相關(guān)的蛋白。大量的臨床試驗(yàn)研究表明[5],DNMTI在癌細(xì)胞中起著很重要的作用,DNMT1作為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的主要的部分,可以對(duì)DNA進(jìn)行復(fù)制及修復(fù),它不僅對(duì)DNA甲基化的關(guān)鍵酶起著催化的作用,而且還有很好的維持DNA甲基化的作用。一般發(fā)生癌變腫瘤的原因是,DNMTI的表達(dá)增強(qiáng),致使患者體內(nèi)的抑癌基因CpG導(dǎo)致DNA異常甲基化,使其不能正常的表達(dá),最終發(fā)生癌變。一般在胃癌、肺癌以及卵巢癌中DNMTI的表達(dá)最高,并且可以作為癌變基因的一個(gè)重要診斷依據(jù)[6]。P53也屬于人體中的抑癌基因,它有著轉(zhuǎn)靈激活的作用,這種基因如果失活很可能會(huì)形成腫瘤,并且它是目前臨床上公認(rèn)的抑癌基因之一,應(yīng)該引起關(guān)注[7]。

    本文研究的主要內(nèi)容是甲基化抑制劑5-Aza-CdR對(duì)肺癌A549細(xì)胞株DNMT1及c-myc、MKi-67、p53基因表達(dá)的影響,采用分組對(duì)照的方式進(jìn)行研究,觀察組細(xì)胞中采用5-Aza-CdR藥物處理,對(duì)照組中不采用任何藥物處理,通過(guò)一段時(shí)間的處理之后研究發(fā)現(xiàn),觀察組的細(xì)胞生長(zhǎng)受到的明顯的抑制,并且觀察組中的DNMT1及c-myc、MKi-67的蛋白表達(dá)量明顯的低于對(duì)照組,p53蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組,主要的作用機(jī)制大概是5-Aza-CdR一方面是使得細(xì)胞發(fā)生了去甲基化[8],另外一方面可能是甲基化等到了抑制,癌基因的表達(dá)不再活躍,使得抑癌基因的表達(dá)更加充分,加速了腫瘤細(xì)胞的凋亡,并且使得腫瘤細(xì)胞的繁殖率明顯的降低,腫瘤細(xì)胞的負(fù)調(diào)控機(jī)制不斷的加強(qiáng),與此同時(shí)激活了抑癌基因的表達(dá),從而有效控制腫瘤基因的表達(dá)[9]。其中研究還發(fā)現(xiàn)[10],DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1以及c-myc、MKi-67、p53都是肺癌發(fā)生的關(guān)鍵因子,任何一種因子的表達(dá)發(fā)生異常情況時(shí),都有可能促使腫瘤的生長(zhǎng)及繁殖,5-Aza-CdR通過(guò)控制基因啟動(dòng)子區(qū)的過(guò)度甲基化,從而控制腫瘤的進(jìn)一步的惡化[11]。

    綜上所述,甲基化抑制劑5-Aza-CdR明顯的降低了肺癌A549細(xì)胞中的DNMT1及c-myc、MKi-67、p53基因表達(dá)量,使得p53基因表達(dá)量升高,抑制了癌基因的表達(dá),使得腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)得到有效的控制,為采用去甲基化的方式進(jìn)行治療肺癌提供了有力的依據(jù)[12]。

    [1]張博,劉文洲,孫宇,等.甲基化抑制劑5-Aza-CdR對(duì)肺癌A549細(xì)胞株DNMT1及c-myc、MKi-67、p53基因表達(dá)的影響[J].廣東醫(yī)學(xué),2016,2(11):194-196.

    [2]趙瑩,孫麗華,楊振華,等.5-Aza-CdR對(duì)肺癌A549細(xì)胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的影響[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2009,6(13):767-778.

    [3]欒加強(qiáng).非小細(xì)胞肺癌的表觀遺傳學(xué)治療對(duì)DNMT1表達(dá)的影響[D].桂林醫(yī)學(xué)院,2014,6(109):134.

    [4]石懿玉.5-Aza-CdR對(duì)B-ALL細(xì)胞系NALM-6的作用及其對(duì)miRNA影響的研究[D].山西醫(yī)科大學(xué),2014,7(8):156-157.

    [5]李慎,梁平,劉永蘭,等.NDRG2基因啟動(dòng)子甲基化與肺腺癌細(xì)胞中mRNA表達(dá)相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究[J].生物技術(shù)通訊,2010,5(4):614-618.

    [6]余宗濤.腫瘤抑制基因啟動(dòng)子甲基化及轉(zhuǎn)錄表達(dá)與肺癌相關(guān)性研究[D].南華大學(xué),2007,7(3):154-156.

    [7]李慎.基因啟動(dòng)子甲基化與肺癌的相關(guān)性研究[D].第四軍醫(yī)大學(xué),2010,10(2):213-215.

    [8]張志學(xué).非小細(xì)胞肺癌中ASC基因啟動(dòng)子甲基化及甲基化抑制劑5-氮-2’-脫氧胞苷對(duì)肺癌細(xì)胞株增殖抑制的實(shí)驗(yàn)研究[D].中國(guó)醫(yī)科大學(xué),2006,9(6):314-315.

    [9]XIONG H H,QIU H,ZHUANG L,et al.Effects of 5-Aza-CdR on the proliferation of human breast cancer cell line MCF-7 and on the expression of Apaf-1 gene[J].Journal of Huazhong University of Science and Technology[Medical Sciences],2009,294(4):524-525.

    [10]MOMPARLER RICHARD L.Epigenetic therapy of cancer with 5-aza-2'-deoxycytidine(decitabine)[J].Seminars in Oncology,2005,325(12):305-306.

    [11]HURTUBISE ANNIE,MOMPARLER RICHARD L.Evaluation of antineoplastic action of 5-aza-2'-deoxycytidine(Dacogen)and docetaxel(Taxotere)on human breast,lung and prostate carcinoma cell lines[J].Anti-Cancer Drugs,2004,152(9):126-127.

    [12]方漢林,于在誠(chéng),祝會(huì)斌,等.5-氮雜-2'-脫氧胞苷對(duì)肺癌SPC-A細(xì)胞和非細(xì)胞肺癌組織中抑癌基因甲基化的作用[J].中華腫瘤雜志,2012(9):215-216.

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