煙草病程相關(guān)蛋白NtPR10基因克隆與表達(dá)分析

張 玉，張?jiān)隽?，蔣彩虹，常愛霞，楊愛國，羅成剛，王紹美，王元英*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

煙草病程相關(guān)蛋白NtPR10基因克隆與表達(dá)分析

張 玉1,2，張?jiān)隽?，蔣彩虹1，常愛霞1，楊愛國1，羅成剛1，王紹美1，王元英1*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

為鑒定煙草病程相關(guān)蛋白PR10的生物學(xué)功能，從普通煙草G28中克隆得到了NtPR10基因，基因全長483 bp，編碼160個(gè)氨基酸。基因結(jié)構(gòu)分析表明，該基因編碼的蛋白包含病程相關(guān)蛋白家族Bet_v_I保守域，具有與核酸酶活性相關(guān)的“P-Loop”結(jié)構(gòu)。利用TMHMM、SignalP、PrositeScan等軟件分析發(fā)現(xiàn)，NtPR10不含跨膜區(qū)，無信號肽，有胞內(nèi)定位特征。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別分析了TMV誘導(dǎo)下該基因在抗、感品種枯斑三生和G28中的表達(dá)模式。結(jié)果表明，在TMV誘導(dǎo)下，NtPR10基因在感病品種G28中顯著上調(diào)表達(dá)；而在抗病品種枯斑三生中，TMV侵染后6 h，NtPR10基因顯著上調(diào)表達(dá)，第12小時(shí)至第8天顯著下調(diào)表達(dá)，而后至第16天逐漸升高至侵染前水平。綜合以上結(jié)果，NtPR10應(yīng)答了TMV侵染過程，并且在抗、感品種中整體呈現(xiàn)出相反的表達(dá)趨勢，暗示了NtPR10在TMV侵染過程中具有重要功能，為深入分析NtPR10的抗病生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

煙草；病程相關(guān)蛋白；PR10；基因克??；表達(dá)

病程相關(guān)蛋白（Pathogenesis-Related Proteins, PRP）是植物體內(nèi)的一類蛋白質(zhì)，受病原體或其他外界因子的脅迫而誘導(dǎo)表達(dá)，在植物抵御疾病、響應(yīng)外界壓力以及適應(yīng)不良環(huán)境方面發(fā)揮著重要作用[1-2]。對于病程相關(guān)蛋白的深入研究，不僅能揭示植物抗病、抗逆反應(yīng)的分子機(jī)制，還能為植物抗病分子育種以及病害防治奠定理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。

根據(jù)病程相關(guān)蛋白家族成員的氨基酸組成、結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能等特點(diǎn)，將其分為17類，即PR1-PR17。其中，病程相關(guān)蛋白10（PR10）包括較大的一個(gè)基因家族，其編碼的蛋白分子量在15～19 kD，等電點(diǎn)偏酸性，無信號肽序列、屬胞內(nèi)蛋白（intracellular pathogenesis-related proteins，IPR）[3]。目前，在辣椒[4]、花生[5]、水稻[6]、刺茄[7]和小麥[8]等20多種植物中，已有PR10基因相關(guān)序列和PR10蛋白相關(guān)功能的報(bào)道?；蛐蛄蟹治霰砻?，大部分PR10基因開放讀碼框編碼的氨基酸中都具有一個(gè)高度保守的“P-Loop”結(jié)構(gòu)域(GXGGXG)[9]。“P-Loop”是一類廣泛存在于磷酸化激酶和核酸結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域的磷酸化可能與其核酸酶活性相關(guān)[10-11]。PARK等[4]研究證實(shí)，辣椒PR10蛋白（CaPR10）比非磷酸化的CaPR10具有更高的核酸酶活性，并發(fā)現(xiàn)這種核酸酶活性在抗病毒途徑中能降解病毒RNA，且可以抑制辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）的菌絲生長；HE[12]等發(fā)現(xiàn)，從葡萄中分離的PR10蛋白（VpPR10.2）同時(shí)具有DNA酶活性和RNA酶活性；CHADHA等[5]從花生中克隆的AhPR10基因原核表達(dá)的融合蛋白具有抗尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和立枯絲核菌（R. solani）活性；WU等[13]研究表明，PR10蛋白超表達(dá)可增強(qiáng)水稻對生物脅迫和非生物脅迫的抗性。因此，近年來因其具有的體外核酸酶活性[14-16]和抗菌活性[4,7,17-19]，PR10蛋白逐漸成為了研究熱點(diǎn)。另外，PR10蛋白還直接參與植物的防衛(wèi)反應(yīng)，除了與植物的生物及非生物脅迫密切相關(guān)，還在植物的生長發(fā)育、次級代謝等過程中起著重要作用。

煙草作為植物病理學(xué)研究的模式植物，迄今未見關(guān)于PR10蛋白基因及功能的研究報(bào)道。本研究首次克隆得到了煙草病程相關(guān)蛋白NtPR10基因序列，對其基因結(jié)構(gòu)及編碼蛋白特征進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并在TMV誘導(dǎo)下，分析了NtPR10基因在抗、感煙草品種中的表達(dá)差異，為深入研究植物PR10蛋白功能及參與的抗病相關(guān)分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

供試烤煙品種G28為感TMV品種，枯斑三生（SumsunNN）含有抗TMV基因N，為抗TMV品種，均由中國煙草種質(zhì)資源平臺提供；煙草花葉病菌為普通小種（TMV-C），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所植物保護(hù)研究中心提供。在煙苗長至六葉期時(shí)利用摩擦法接種TMV病毒，每個(gè)品種接種20株，每株接種第3、第4片葉，以無菌水接種作為對照，接種后0 h、6 h、12 h、1 d、2 d、4 d、8 d、16 d取第5、第6片葉，用液氮速凍后于-80 ℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)，在接種后2 d和16 d參照煙草病蟲害分級及調(diào)查方法（GB/T23222—2008）調(diào)查TMV發(fā)病情況，并按照下列公式計(jì)算病情指數(shù)：

病情指數(shù)（disease index）=100×∑（各級病葉數(shù)×各級代表值）/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級代表值)。

1.2方法

1.2.1 樣品總RNA提取與cDNA合成 采用RNApure Plant Kit試劑盒提取葉片總RNA，SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA，用于NtPR10基因的RT-PCR克隆和熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。兩個(gè)試劑盒均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2.2NtPR10基因的電子克隆 以茄科作物辣椒的CaPR10基因mRNA序列（Accession No.：AF244121）為“種子”序列，在從NCBI下載的煙草EST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blastn比對，利用SeqMan軟件進(jìn)行EST的拼接和校對，利用NCBI站點(diǎn)的ORF finder程序進(jìn)一步篩選。

1.2.3NtPR10基因的PCR擴(kuò)增與克隆 以電子克隆得到的序列為基礎(chǔ)，利用Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異引物，用于擴(kuò)增NtPR10基因開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）。（FP：5'-ATGGGTGTCACAA CCTATACTC-3'；RP：5'-TTAGGCATAGACGGTAG AATTGG-3'）。以TMV接種后2 d的的感病品種G28煙草葉片cDNA 為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的條帶并克隆、測序。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃4 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物回收后連接至pMD?18-T Simple Vector載體（購自寶生物工程生物公司），由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4NtPR10基因序列及編碼蛋白序列分析 利用生物信息學(xué)網(wǎng)站或軟件對NtPR10基因序列及編碼蛋白序列進(jìn)行分析。采用NCBI的ORF finder (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)預(yù)測開放閱讀框；用Blastp進(jìn)行蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域分析；使用ExPAsy網(wǎng)站的Compute pI/MW tool（http：// www.expasy.org/tools/pi_tool.html）計(jì)算蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)及分子量；利用TargetP（http：//www. cbs.dtu.dk/ services/SignalP/）預(yù)測蛋白質(zhì)信號肽；利用TMpred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_for m.html）進(jìn)行氨基酸跨膜預(yù)測；利用PrositeScan（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/pattern_prosite.pl）分析蛋白motifs。利用MEGA 6.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[20]。

1.2.5 熒光定量PCR試驗(yàn) 根據(jù)NtPR10序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物（F：CCTATACTCATGAGGCAT CAACCA；R：AACACCACCATCACCTTCGAC AG），選擇煙草肌動(dòng)蛋白基因（Actin gene，Accession NO.U60495）作為內(nèi)參基因（F：GCAGCATGAAG ATTAAGGTTGTTG；R：GTGCTAAGGGATGCGA GGAT）。應(yīng)用Applied Biosystems公司的StepOne PLUS熒光定量PCR儀，以8個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系見表1。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，56 ℃ 20 s， 72 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線和融解曲線。用Prizm4統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

表1熒光定量PCR反應(yīng)體系Table 1 Fluorescence quantitative PCR reaction system

2 結(jié) 果

2.1接種TMV后試驗(yàn)材料感病情況

分別于接種TMV后2 d和16 d調(diào)查感病品種G28和抗病品種枯斑三生的發(fā)病情況，并計(jì)算病情指數(shù)（圖1）。接種后2 d發(fā)現(xiàn)枯斑三生的接種葉片均表現(xiàn)出了過敏性壞死反應(yīng)，出現(xiàn)了壞死斑點(diǎn)。接種16 d后G28接種葉片和大部分非接種葉片均表現(xiàn)出了花葉癥狀，病情指數(shù)為42.22，而枯斑三生除接種葉片殘留部分枯死斑外，沒有出現(xiàn)花葉癥狀，表現(xiàn)出了較好的抗病性。

圖1接種后16 d G28和枯斑三生病情指數(shù)Fig. 1 The disease index of G28 andSumsunNN 16 days postinoculation

2.2NtPR10基因克隆

以辣椒序列為種子序列，以煙草EST數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，利用Blastn和SeqMan進(jìn)行序列比對和拼接，得到一條長度為864 bp的序列，利用NCBI網(wǎng)站的ORF finder程序預(yù)測，這條序列含有一個(gè)長度為483 bp，編碼160個(gè)氨基酸的完整的開放閱讀框（圖2），與辣椒CaPR10開放閱讀框一致性超過了70%，將這條序列命名為NtPR10。以NtPR10開放閱讀框序列設(shè)計(jì)特異引物，以感病品種G28接種2 d的樣品cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到一條與NtPR10電子克隆序列ORF完全一致的核苷酸序列（圖3）。目前，該基因已提交到GenBank，注冊號為JQ041907。

圖2NtPR10序列及其編碼的蛋白序列Fig. 2 The sequence ofNtPR10and its encoded protein

圖3NtPR10基因PCR擴(kuò)增Fig. 3 The PCR amplification ofNtPR10gene

2.3NtPR10基因序列及其編碼蛋白特征分析

NtPR10基因序列預(yù)測編碼蛋白經(jīng)ComputepI/MW軟件預(yù)測，其等電點(diǎn)為5.56，分子量為17.77 kDa。InterProScan結(jié)構(gòu)域分析表明該編碼蛋白2～155位氨基酸為病程相關(guān)蛋白Bet_v_I家族保守域，該結(jié)構(gòu)域?qū)ν鈦砩锶肭志哂蟹烙δ?；TMHMM-2.0預(yù)測該蛋白不含跨膜區(qū)；SignalP 4.0預(yù)測該蛋白無信號肽，不屬于分泌蛋白；PrositeScan分析將該蛋白定位在胞內(nèi)。

將煙草（Nicotiana tabacum）NtPR10編碼的蛋白序列與辣椒（Capsicum annuum）、馬鈴薯（Solanum tuberosum，Accession Number：P17642）、番茄（Solanum lycopersicum，Accession Number： NM_001247423）的PR10蛋白序列進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)其序列較為保守（圖4）。其中，煙草與番茄的序列一致性最高，達(dá)到了80%，與馬鈴薯的一致性為74.38%，與辣椒的一致性為65%。進(jìn)一步分析可知，煙草和辣椒的蛋白序列具有與核酸酶活性相關(guān)的“P-Loop”結(jié)構(gòu)（GXGGXG），而馬鈴薯和番茄PR10蛋白則不具有。已有的研究證明，辣椒PR10蛋白具有體外核酸酶活性[4]，而馬鈴薯PR10蛋白沒有[21]，由此推測煙草PR10蛋白可能具有核酸酶活性。

2.4系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖4 PR10蛋白同源性分析Fig. 4 The homologous Analysis of PR10 proteins

從NCBI數(shù)據(jù)庫中選取了B. pendula（CAA54696）、C. sativa（CAD10374）、P. persica（ABB78006）、M. domestica（CAK93672）、F. sylvatica（CAA10235）、V. vinifera（XP_002274108）、D. glomerata（CAD33532）、P. dulcis（ACE80949）、M. truncatula（XP_003609710）、C. annuum（AAX20045）、S. tuberosum（P17642）、S. virginianum（AAU00066）、S. lycopersicum（NP_001234122）、N. tabacum（JQ041907）、F. chiloensis（ADN05762）、P. domestica（ADN05762）、O. sativa（XP_015631105）、T. aestivum（ACG68733）等18個(gè)來自不同植物PR10基因編碼的氨基酸序列，用鄰接法（neighbor-joining）建立了一個(gè)無根的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5）。系統(tǒng)進(jìn)化分析將18個(gè)不同植物的PR10蛋白劃分為4組，辣椒（C. annuum）、黃果茄（S. virginianum）、馬鈴薯（S. tuberosum）、番茄（S. lycopersicum）、煙草(N.tabacum)等5種茄科植物的PR10蛋白共同形成了一個(gè)進(jìn)化分枝，親緣關(guān)系較近，也說明PR10蛋白在不同植物中結(jié)構(gòu)較為保守。

2.5 TMV誘導(dǎo)下的NtPR10表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示（圖6），以各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的對照樣品為對照，感病品種G28在接種TMV病毒后6 h、12 h、1 d、2 d、4 d、8 d，NtPR10的表達(dá)量分別升高5.41、5.56、2.13、3.74、8.81、6.62倍，差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），TMV侵染4 d時(shí)NtPR10達(dá)到表達(dá)高峰，然后呈現(xiàn)下降趨勢，侵染后16 d其表達(dá)量降低到對照的44.9%；在抗病品種枯斑三生中，NtPR10基因在TMV侵染后6 h表達(dá)量顯著上調(diào)，達(dá)到了高峰，自第12小時(shí)至第16天顯著低于對照，并于第2天表達(dá)量達(dá)到最低值，而后至第16天逐漸升高。分析結(jié)果可以得知，NtPR10應(yīng)答了TMV的侵染過程，且其在感病品種和抗病品種中的響應(yīng)模式存在差異。

圖5 PR10蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 5 The phylogenetic tree of PR10 proteins

圖6 TMV誘導(dǎo)后不同時(shí)期NtPR10在感病品種G28和抗病品種枯斑三生中的表達(dá)Fig. 6 The expression pattern ofNtPR10in different periods after TMV induction

3 討 論

普通煙草是異源四倍體，基因組龐大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，給一些重要功能基因的克隆帶來不便。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，數(shù)據(jù)庫的逐漸擴(kuò)大，以及電子克隆技術(shù)日趨成熟，從根本上改變了人們對基因克隆的看法，改變了基因克隆長久以來沿用的策略，極大地提高了基因克隆效率，使研究人員的研究焦點(diǎn)更多地轉(zhuǎn)向基因表達(dá)與功能的研究。迄今為止，研究人員已經(jīng)利用電子克隆技術(shù)開展了許多重要功能基因的研究[22-24]。張崗等[8]利用電子克隆技術(shù)在小麥上成功克隆了病程相關(guān)蛋白基因TaPR10，本研究采用電子克隆結(jié)合RT-PCR技術(shù)成功克隆了煙草NtPR10基因，快捷、高效地獲得了目的基因。

煙草NtPR10基因ORF全長483 bp，編碼160個(gè)氨基酸組成的蛋白序列，其蛋白序列在不同植物中非常保守，不含跨膜區(qū)、無信號肽、具有胞內(nèi)蛋白特征，與前人對于其他植物PR10蛋白的研究結(jié)果一致[9]，符合PR10的基本特征。已有研究表明，植物PR10蛋白具有體外核酸酶活性和抗菌活性。然而，并非所有的植物PR10蛋白都具有核酸酶活性，從辣椒[4]、刺茄[7]和花生[5]中分離純化的PR10蛋白均被證實(shí)具有體外核酸酶活性，而從馬鈴薯[21]和苜蓿[25]中分離純化的PR10蛋白卻無體外核酸酶活性，這可能與不同植物PR10蛋白的結(jié)構(gòu)差異相關(guān)。本文通過分析得出，煙草PR10蛋白具有與核酸酶活性相關(guān)的“P-Loop”結(jié)構(gòu)，而馬鈴薯PR10蛋白不具有，進(jìn)一步證明了“P-Loop”結(jié)構(gòu)與核酸酶活性的相關(guān)性，推測煙草PR10蛋白具有核酸酶活性，參與煙草抗病生物過程。

植物中PR10蛋白基因的誘導(dǎo)激發(fā)因子很多，在不同植物中，PR10蛋白編碼基因的誘導(dǎo)表達(dá)既有共同的激發(fā)因子也存在特異的激發(fā)因子，這可能是植物對多樣化的逆境脅迫的一種適應(yīng)。本研究中，在TMV的誘導(dǎo)下，NtPR10基因出現(xiàn)了應(yīng)答反應(yīng)，說明TMV是NtPR10基因誘導(dǎo)表達(dá)的激發(fā)因子。而對于NtPR10基因在感病品種和抗病品種中的表達(dá)差異原因，可能是由于抗病品種“枯斑三生”基因組內(nèi)含有N基因，介導(dǎo)對Ob小種以外的TMV發(fā)生免疫反應(yīng)[26]。在TMV侵染初期NtPR10和N基因共同應(yīng)答病原菌的侵染，啟動(dòng)防御機(jī)制，所以NtPR10基因的表達(dá)量有所升高，伴隨著TMV的侵染，“枯斑三生”自身的防御機(jī)制發(fā)生了變化，N基因主導(dǎo)了對TMV的抗性，介導(dǎo)發(fā)生了過敏性壞死反應(yīng)，將TMV病毒限制在枯斑范圍內(nèi)，從而使NtPR10基因表達(dá)量有所降低，但枯斑反應(yīng)發(fā)生后，煙株逐漸恢復(fù)正常，NtPR10基因的表達(dá)量又逐漸恢復(fù)到對照水平。因此，分析病原菌誘導(dǎo)下NtPR10基因在抗、感品種中的差異表達(dá)機(jī)制，以及其與抗病基因的互作將是未來研究的重點(diǎn)。

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Cloning and Expression Analysis of a Pathogenesis Related Protein Gene NtPR10 in Tobacco (Nicotiana tabacum)

ZHANG Yu1,2, ZHANG Zenglin1, JIANG Caihong1, CHANG Aixia1, YANG Aiguo1, LUO Chenggang1, WANG Shaomei1, WANG Yuanying1*
(1. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

In order to investigate the biological function of the tobacco pathogenesis-related protein PR10,NtPR10gene was obtained from the tobacco variety G28, which is 483 bp in length, encoding 160 amino acids. The NtPR10 protein belongs to the pathogenesis related protein family containing the “Bet_v_I” domain and the “P-loop” domain which is related to nuclease activities. The bioinformatics analysis indicated that NtPR10 did not contain transmembrane region, no signal peptide, and exhibited intracellular localization features by TMHMM, SignalP and PrositeScan. The expression pattern of the gene in the resistant and susceptible cultivars was studied by RT-qPCR. The results showed that theNtPR10gene was significantly up-regulated in the susceptible cultivar G28 after TMV treatment. While in resistant cultivarSumsunNN,NtPR10was up-regulated at 6 hours after TMV infection, and down-regulated between 12 hours and 8thday, and then increased gradually to the pre-infection level after 16thday. From above analysis,NtPR10responses to TMV infection, and the expression trend is opposite in resistant and susceptible cultivars, suggesting that theNtPR10might have an important function in the process of TMV infection. Results from this study provide the foundation for further analysis of the biological function ofNtPR10.

tobacco; pathogenesis-related protein; PR10; gene clone; expression

S572.03

1007-5119（2017）03-0001-07 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.03.001

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“煙草病程相關(guān)蛋白PR10抗病分子機(jī)理研究”（31240013）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所青年科學(xué)基金項(xiàng)目“對煙草赤星病不同抗性品種蛋白質(zhì)組差異分析及抗性蛋白挖掘”（2016B04）；中國煙草總公司四川省公司科技項(xiàng)目“優(yōu)質(zhì)適產(chǎn)烤煙新品種選育與推廣”（SCYC201501）

張 玉（1982-），男，助理研究員，在讀博士，主要從事煙草遺傳育種研究。E-mail：zhangyu@caas.cn。*通信作者，E-mail：wangyuanying@caas.cn

2016-12-22

2017-03-23