煙草內生真菌多樣性及其細胞毒活性初步研究

李盼盼，袁曉龍，鄭 璇，高 林，劉新民，張忠鋒，張 鵬，申國明*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，北京 100081）

煙草內生真菌多樣性及其細胞毒活性初步研究

李盼盼1,2，袁曉龍1，鄭 璇1,2，高 林1，劉新民1，張忠鋒1，張 鵬1，申國明1*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，北京 100081）

為研究煙草內生真菌的生物多樣性，揭示其在煙草中的分布規(guī)律及種群結構，對煙草栽培種的內生真菌進行了系統(tǒng)的分離和鑒定，并對其發(fā)酵粗提物進行了初步的細胞毒活性篩選。結果發(fā)現(xiàn)，采用組織分離法從健康煙株的根、莖、葉中共分離純化到62株內生真菌，形態(tài)學和分子生物學鑒定為4目7科9屬。發(fā)現(xiàn)葉部內生真菌的分離率最高，其次為莖，根部最少。采用CCK-8法對內生真菌的體外細胞毒活性進行篩選，發(fā)現(xiàn)多數(shù)菌株對人腎癌Caki-1細胞和人肝癌HepG2細胞均具有不同程度的抑制活性，菌株TE-6L的PDB發(fā)酵液及大米發(fā)酵物對Caki-1細胞48 h內的IC50分別為13.28和0.36 μg/mL。結合形態(tài)學特征和分子生物學鑒定TE-6L菌株為Fusarium sambucinum。研究表明，煙草中蘊含豐富的具有細胞毒活性的內生真菌資源，為尋找細胞毒活性物質新來源、開發(fā)新型抗腫瘤藥物提供了新的途徑。

煙草；內生真菌；種群分布；代謝產(chǎn)物；細胞毒活性

植物內生真菌（endophytic fungi）是指生活于健康植物組織或器官內，并與宿主植物建立了互利共生關系的真菌，是植物體微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[1]。其普遍分布于各種陸生和水生植物中，如禾草植物[2-4]、藥用植物[5-7]、經(jīng)濟林木[8]、海洋植物[9-10]等。研究證明，內生真菌在宿主植物的生長發(fā)育中起著積極作用，能促進植物生長、誘導植物產(chǎn)生抗病性、提高植物對重金屬的耐性等[11-13]。更為重要的是，在與宿主的協(xié)同進化過程中，內生真菌可以代謝產(chǎn)生具有生理活性的物質，如抑菌[14-15]、氧化[16-17]、促生長因子[18-19]、細胞毒[20-21]活性物質等。如STIERLE等[22]從藥用植物短葉紅豆杉樹皮中分離得到一株內生真菌安德氏紫杉霉Taxomycesandreanae，從該菌的發(fā)酵產(chǎn)物中分離獲得抗癌藥物紫杉醇（taxol）。隨后，從多種植物中陸續(xù)分離到產(chǎn)紫杉醇或其類似物的內生真菌菌株[23-25]。因此，尋找和發(fā)掘具有潛在的、高效的細胞毒活性物質的內生真菌資源，為抗腫瘤藥物的研究和開發(fā)提供了新的途徑。

煙草（NicotianatabacumL.）作為一種歷史悠久的藥用植物，蘊含著豐富的內生真菌資源。目前關于煙草內生真菌的研究主要集中在促進煙草生長、提高煙株抗重金屬能力、生防抑菌等方面[26-28]，而對其代謝產(chǎn)物生物活性的研究尚未見報道。本試驗在分離鑒定煙草內生真菌的基礎上，首次對其代謝產(chǎn)物的細胞毒活性進行研究，為煙草內生真菌資源的有效利用、開發(fā)新型細胞毒活性先導化合物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料

健康煙草植株，品種為中煙102和云煙97，于2016年6月采于安徽皖南煙草示范園。

1.2試劑與儀器

乙酸乙酯、二甲基亞砜（DMSO）均為分析純，國藥；CCK-8（Sigma 公司），胎牛血清（杭州四季青公司）。

超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱（Heal Force公司），生化培養(yǎng)箱（上海新苗公司），光學顯微鏡（Nikon公司），酶聯(lián)免疫測定儀（Thermo公司），立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅）。

1.3腫瘤細胞株來源與培養(yǎng)基

人腎癌Caki-1細胞、人肝癌HepG2細胞購于中國科學院細胞庫。腫瘤細胞株采用RPMI 1640及MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，使用前均加入10%胎牛血清。

1.4煙草內生真菌的分離純化

煙草內生真菌的分離采用組織分離法[29]。取健康煙株的根、莖、葉，自來水沖洗后采用75%酒精浸泡消毒2~4 min。將不同組織剪切成0.5 cm×0.5 cm大小的片段，將切口插入PDA培養(yǎng)基上（為抑制細菌的生長，需預先加入質量分數(shù)為0.5%的氯霉素），28 ℃培養(yǎng)。在另一平板設置未經(jīng)過表面消毒的組織作為對照。待培養(yǎng)基中組織切口處長出菌絲后，用滅菌的接種環(huán)挑取孢子或菌絲體至新的PDA培養(yǎng)基上，劃線稀釋分離，直至獲得純培養(yǎng)。

1.5內生真菌的形態(tài)觀察及分類鑒定

將純化的菌株點植于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)，注意觀察菌株的生長速度、菌落大小、質地、邊緣等形態(tài)特征，同時觀察分生孢子或菌絲體的顯微結構特征。采用CTAB法提取純化菌株的基因組DNA[30]，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶完整性，利用nanodrop檢測DNA的純度和濃度，以ITS1和ITS4通用引物進行PCR擴增[31]，然后將PCR產(chǎn)物送青島擎科生物工程有限公司利用Sanger測序平臺進行測序。通過BLAST序列比對，最終確定菌株的分類地位[32]。

1.6內生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)及粗提物浸膏的制備

將不同種屬的20株內生真菌分別接種于PDB液體培養(yǎng)基和大米固體培養(yǎng)基上，室溫靜置發(fā)酵30 d。發(fā)酵結束后，分別向PDB及大米培養(yǎng)基中加入等積體的乙酸乙酯萃取。萃取3次后過濾，減壓濃縮獲得粗提物浸膏作為活性待測樣品。

1.7細胞毒活性測定

采用CCK-8（Cell Counting Kit-8）法[33]，常規(guī)胰酶消化收集對數(shù)生長期的人腎癌Caki-1細胞和人肝癌HepG2細胞，按1×105細胞/孔的量分別接種于96孔培養(yǎng)板中，于5% CO2，37 ℃的條件下培養(yǎng)過夜。次日使用100 μL含有不同濃度待測樣品的培養(yǎng)液進行全換液后，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)。24、48 h后，加入10

μL的CCK-8溶液，培養(yǎng)4 h后，用酶標儀在450 nm下進行吸光度（A）測定，以生長抑制率表示腫瘤細胞的增殖抑制活性。

生長抑制率=（1-A1/A2）×100%

其中，A1為樣品組吸光值，A2為對照組吸光值。

1.8數(shù)據(jù)分析

所有試驗均重復3次，細胞毒活性測試數(shù)據(jù)均使用均值±標準差（x±s）表示，各組數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗分析。

2 結 果

2.1煙草內生真菌多樣性及菌群組成

從安徽皖南采集的健康煙草的根、莖、葉中共分離得到內生真菌62株，發(fā)現(xiàn)不同的組織中內生真菌的種群數(shù)量存在差異性。其中，從葉部分離29株，占菌株總數(shù)的46.8%；莖部分離24株，占菌株總數(shù)38.7%；根部分離9株，占菌株總數(shù)14.5%（圖1）。

通過形態(tài)觀察，結合分子生物學鑒定，將分離到的內生真菌鑒定為4目7科9屬。如表1所示，格孢菌目為優(yōu)勢菌群，占分離總菌株數(shù)的61.3%。在屬水平上，莖點霉屬Phoma和鐮刀菌屬Fusarium為優(yōu)勢屬，分離率分別為32.3%和29.0%。其在不同的組織中存在專化性。葉部Fusarium和Phoma為優(yōu)勢屬；莖部優(yōu)勢屬也為Fusarium和Phoma；根部Phoma為優(yōu)勢屬。附球菌屬Epicoccum、小球腔菌屬Leptosphaeria以及毛霉屬Mucor只分布于葉中（圖1）。由此可見，煙草內生真菌具有豐富的多樣性，其種群結構和數(shù)量分布具有一定的組織偏好性和組織?；浴?/p>

2.2細胞毒活性測試結果

對分離獲得的20株不同種屬的內生真菌進行細胞毒活性測試。為充分發(fā)掘其活性潛力，獲得高活性發(fā)酵產(chǎn)物，采用液態(tài)培養(yǎng)基（PDB培養(yǎng)基）和固體培養(yǎng)基（大米培養(yǎng)基）兩種培養(yǎng)方式。其中菌株TE-1S、TE-6L、TE-14L的PDB發(fā)酵粗提物，TE-6L、TE-8L、TE-20R的大米發(fā)酵粗提物在48 h內的IC50＜40 μg/mL（表2）。其對人肝癌HepG2細胞的抑制率也呈濃度-時間依賴性，但具有抑制效果的菌株數(shù)量較少，且48 h內IC50均高于40 μg/mL（表2）。以上研究表明，煙草內生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物具有一定程度的細胞毒活性，特別是對人腎癌Caki-1細胞表現(xiàn)出更加顯著的活性，且大米發(fā)酵物的抑制效果明顯優(yōu)于PDB發(fā)酵液，表明固體培養(yǎng)基更有利于細胞毒活性代謝產(chǎn)物的生成。

2.3活性菌株的形態(tài)鑒定

在上述細胞毒活性篩選中，發(fā)現(xiàn)一株來源于葉部的菌株TE-6L，其PDB發(fā)酵液及大米發(fā)酵物對Caki-1均具有顯著的抑制活性，48 h內IC50分別為13.28和0.36 μg/mL，提示該菌株在不同培養(yǎng)條件下均有產(chǎn)細胞毒活性代謝產(chǎn)物的能力。該菌株在CYA、MEA和YES平板上為淡粉色菌落，菌絲體為絨毛狀，分生孢子為鐮刀狀（圖2），初步鑒定為鐮刀菌屬Fusarium真菌。利用通用引物ITS1和ITS4經(jīng)PCR反應從該菌基因組DNA中擴增出長度為507 bp的單一DNA條帶，將該序列進行BLAST檢索，發(fā)現(xiàn)該菌株與接骨木鐮刀菌Fusariumsambucinum（序列號：KM231813.1）具有較高的同源性，其相似度為99%，因此將該菌株初步鑒定為F. sambucinum。該發(fā)現(xiàn)為發(fā)掘新型抗腫瘤先導藥物提供了新來源。

圖1不同屬的內生真菌在根莖葉中的分布及數(shù)量Fig. 1 Numbers and distribution of isolates of different genera

表1煙草內生真菌種群組成Table 1 The composition of endophytic fungi isolated fromN. tabacum

表2煙草內生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對腎癌Caki-1細胞和肝癌HepG2細胞的IC50值Table 2 The IC50s of the crude extracts from the endophytic fungi inN. tabacumto Caki-1 and HepG2 cell lines μg/mL

圖2菌株TE-6L形態(tài)特征：(A)CYA平板；(B)MEA平板；(C)YES平板；(D-F)鐮刀狀分生孢子及有隔菌絲Fig. 2 Morphological characteristics of the fungal strain TE-6L. Colonies on agar media (A) CYA; (B) MEA; (C) YES; (D-F) Conidiophores and septahypha. Bar, 100 μm.

3 討 論

煙草中蘊含著豐富的內生真菌資源，同時，也有部分煙草內生細菌的報道，如彭細橋等[34]篩選獲得了對煙草青枯菌有拮抗作用的煙草內生細菌；雷麗萍等[35]發(fā)現(xiàn)煙草內生細菌具有還原硝酸鹽和亞硝酸鹽的能力。本研究通過對煙草內生真菌的分離和鑒定，發(fā)現(xiàn)煙草內生真菌的分布具有一定的組織偏好性，原因可能與根、莖、葉所處生態(tài)位不同有關。已有文獻證明，環(huán)境及生態(tài)因素是內生真菌分布差異的主要原因。李文君[36]發(fā)現(xiàn)煙草不同生長時期、不同部位及不同海拔樣地對煙草內生真菌的豐富度和多樣性均有影響。由于環(huán)境因素對內生真菌的分布具有重要影響，因此不同產(chǎn)區(qū)煙草內生真菌可能的地域?；灾档眠M一步探究。

植物內生真菌是一類活性代謝產(chǎn)物豐富、應用廣泛的潛在資源，目前已從青蒿[17]、水仙[29]、喜樹[37]、雷公藤[38]等分離篩選出了具有抗腫瘤活性的內生真菌，為新型抗腫瘤先導藥物的發(fā)現(xiàn)提供了新的途徑。煙草作為一種歷史悠久的藥用植物，其內生真菌抗腫瘤活性的研究尚未見報道。本研究首次對煙草內生真菌的代謝產(chǎn)物進行了細胞毒活性測試，為開發(fā)新型抗腫瘤藥物奠定基礎。

4 結 論

本研究從皖南采集的栽培種煙草分離得到內生真菌62株，鑒定為4目7科9屬，其中莖點霉屬Phomasp.和鐮刀菌屬Fusariumsp.為優(yōu)勢屬?？偨Y了煙草內生真菌在煙草不同組織中的分布規(guī)律及菌群變化，其種類和數(shù)量分布存在組織偏好性和組織?；?，葉部內生真菌的分離率最高，其次為莖，根部最少。發(fā)現(xiàn)了一株具有潛在應用價值的菌株F. sambucinumTE-6L，其PDB發(fā)酵液及大米發(fā)酵物對Caki-1細胞48 h內IC50分別為13.28和0.36 μg/mL。煙草中蘊含豐富的具有細胞毒活性的內生真菌資源，為進一步尋找抗腫瘤活性物質新來源、開發(fā)新型抗腫瘤藥物提供了新的途徑。

[1] STONE J K, BACON C W, WHITE J F Jr. An overview of endophytic microbes： endophytismdefined[M]//Bacon C W, White J F Jr. Microbial Endophytes. New York：Marcel Dekker, 2000： 3-29.

[2] 張傳博，陳榮林，殷幼平，等. 金蕎麥和苦蕎麥抗菌活性內生真菌的篩選及鑒定[J]. 微生物學通報，2011，38（1）：70-77.

[3] 李秀璋，姚祥，李春杰，等. 禾草內生真菌作為生防因子的潛力分析[J]. 植物生態(tài)學報，2015，39（6）：621-634.

[4] 金文進，李春杰，王正鳳. 禾草內生真菌的多樣性及意義[J]. 草業(yè)學報，2015，24（1）：168-175.

[5] WARDECKI T, BR?TZ E, DE FORD C, et al. EndophyticStreptomycesin the traditional medicinal plantArnica MontanaL.： secondary metabolites and biological activity[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 2015, 108(2)： 391-402.

[6] 李瑾，張慧茹，劉諾陽，等. 金銀花內生真菌的分離鑒定及抑菌活性研究[J]. 中國抗生素雜志，2010，35（3）：236-237.

[7] 畢江濤，李萍，馬飛，等. 瀕危藥用植物沙冬青內生真菌分離及其抑菌活性初步研究[J]. 中國農(nóng)學通報，2012，28（30）：40-48.

[8] 周雅琴，譚小明，陳娟，等. 南方紅豆杉內生真菌的分離及抗菌活性篩選研究[J]. 中國藥學雜志，2015，50（1）：19-22.

[9] DEVI P, RODRIGUES C, NAIK C G, et al. Isolation and characterization of antibacterial compound from a mangrove-endophytic fungus,PenicilliumchrysogenumMTCC 5108[J]. India Journal of Microbiology, 2012, 52(4)： 617-623.

[10] 陳亮亮，王佩，王昊，等. 角果木內生真菌Coriolopsissp. J5代謝產(chǎn)物及活性研究[J]. 中國海洋藥物，2016，35（2）：7-12.

[11] MORITA S, AZUMA M, AOBA T, et al. Induced systemic resistance of Chinese cabbage to bacterial leaf spot andAlternarialeaf spot by the root endophytic fungus,Heteroconiumchaetospira[J]. Journal of General Plant Pathology, 2003, 69(1)： 71-75.

[12] BAN Y, TANG M, CHEN H, et al. The response of dark septate endophytes (DSE) to heavy metals in pure culture[J]. PLoS One, 2012, 7(10)： e47968.

[13] ?ELMULLER R, SHERAMETI I, TRIPATHI S, et al.Piriformosporaindica, a cultivable root endophyte with multiple biotechnological applications[J]. Symbiosis, 2009, 49(1)： 1-17.

[14] 李玲玲，羅合春，張先淑. 柴胡內生真菌鑒定與抑菌活性篩選[J]. 生物技術通報，2015，31（10）：165-170.

[15] PATIL M P, PATIL R H, MAHESHWARI V L. Biological activities and identification of bioactive metabolite from endophyticAspergillus flavusL7 isolated fromAegle marmelos[J]. Current Microbiology, 2015, 71(1)： 39-48.

[16] 史佳琴，周松林，王梅霞，等. 槐樹內生真菌抗氧化活性的初步研究[J]. 食品科學，2007，28（8）：250-253.

[17] 錢一鑫，康冀川，耿坤，等. 青蒿內生真菌的抗腫瘤抗氧化活性[J]. 菌物研究，2014，12（1）：44-50.

[18] 侯曉強，郭順星. 鐵皮石斛促生長內生真菌的篩選與鑒定[J]. 中國中藥雜志，2014，39（17）：3232-3237.

[19] 王雅俊，孟志霞，于雪梅，等. 促進金線蓮生長發(fā)育的內生真菌篩選研究[J]. 中國藥學雜志，2009，44（13）：976-979.

[20] PATHANIA A S, GURU S K, UI ASHRAF N, et al. A novel stereo bioactive metabolite isolated from an endophytic fungus induces caspase dependent apoptosis and STAT-3 inhibition in human leukemia cells[J]. European Journal of Pharmacology, 2015, 765(15)：75-85.

[21] 武文斌，劉雅莉，岳高超，等. 蒺藜內生真菌發(fā)酵液抗菌及抗腫瘤活性初步研究[J]. 微生物學通報，2013，40（12）：2280-2287.

[22] STIERLE A, STROBEL G, STIERLE D. Taxol and taxane production byTaxomycetesandreanae, an endophytic fungus of Pacific Yew[J]. Science, 1993, 260(5105)： 214-216.

[23] LI J Y, SIDHU R S, BOLLON A, et al. Stimulation of taxol production in liquid cultures ofPestalotiopsismicrospora[J].Mycol Res, 102(4)：461-464.

[24] STROBEL G, YANG X S, SEARS J, et al. Taxol fromPestalotiopsismicrospora, an endophytic fungus ofTaxuswallachiana[J]. Microbiology, 142： 435-440.

[25] Noh M J, Yang J G, Kim K S, et al. Isolation of a novel microorganism,Pestalotiaheterocornis, producing paclitaxel[J]. Biotechnology and Bioengineering, 64(5)：620-623.

[26] 劉宏玉. 煙草內生真菌多樣性及促生和抗重金屬菌株的篩選[D]. 杭州：浙江大學，2014.

[27] 金慧清，程昌合，徐清泉，等. 煙草內生真菌對煙草生長和煙葉重金屬含量的影響[J/OL]. 菌物學報，http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.5180.Q.20160317.10 51.005.html

[28] 裴洲洋. 煙草內生真菌種群多樣性及煙草赤星病生防內生菌的篩選[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學，2009.

[29] 楊明俊，李娟，薛鴻燕，等. 水仙內生真菌的分離及抑菌和抗腫瘤活性研究[J]. 中草藥，2014，45（6）：819-824.

[30] HUANG J, GE X, SUN M. Modified CTAB protocol using a silica matrix for isolation of plant genomic DNA[J]. Biotechniques, 2000, 28(3)： 432-434.

[31] WHITE T J, BRUNS T, LEE S, et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[J]. PCR protocols： a guide to methods and applications, 1990, 18(1)： 315-322.

[32] 布芳芳，余仲東，侯姣姣，等. 古側柏鱗葉內生真菌分離及其抑菌活性研究[J]. 中國森林病蟲，2016，35（3）：12-16.

[33] 萬文婷，李寧，劉靜，等. CCK-8法與MTT法檢測人前列腺癌PC3細胞活性的比較研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2010，21（12）：3046-3048.

[34] 彭細橋，劉紅艷，羅寬，等. 煙草內生青枯病拮抗細菌的篩選和初步鑒定[J]. 中國煙草科學，2007，28（2）：38-40.

[35] 雷麗萍，夏振遠，郭榮君，等. 非硝酸鹽還原細菌K18降低TSNA機理的初步研究[J]. 中國煙草科學，2009，30（5）：54-57.

[36] 李文君. 云南大理不同煙草產(chǎn)區(qū)煙葉內生菌群及其動態(tài)差異研究[D]. 昆明：云南大學，2011.

[37] 陸榮，劉小娟，樊美珍，等. 喜樹內生真菌的分離及其抗腫瘤活性菌株的篩選[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學學報，2008，35（1）：76-79.

[38] 宋萍，洪偉，吳承禎，等. 雷公藤內生真菌的分離及抗腫瘤活性研究[J]. 北華大學學報（自然科學版），2009，10（4）：310-313.

The Biodiversity of Endophytic Fungi in NicotianaTabacum and Their Cytotoxicity

LI Panpan1,2, YUAN Xiaolong1, ZHENG Xuan1,2, GAO Lin1, LIU Xinmin1, ZHANG Zhongfeng1, ZHANG Peng1, SHEN Guoming1*
(1. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of CAAS, Beijing 100081, China)

To investigate the biodiversity, distribution, and the microbial community structure of the endophytic fungi inNicotiana tabacum, the endophytic fungi in different cultispecies were systematically isolated and identified. The preliminary screening of the cytotoxic activities was also performed. As a result, a total of 62 strains of the endophytic fungi were isolated and purified from the healthy tissues (roots, stems, and leaves) of tobacco using the tissue isolation method. The isolated strains were identified to belong to 4 orders, 7 families, and 9 genera based on their morphological and molecular characteristics. More species and strains were isolated from the leaves, followed by the stems, and those in the roots were the least. The cytotoxicity of the crude extracts was determined by CCK-8 assay. The results indicated that most of the strains were found to have some inhibitory activities on Caki-1 and HepG2 cell lines. The IC50s of the strain TE-6L to Caki-1 at 24 h and 48 h were 13.28 and 0.36 μg/mL, respectively. Combined with morphological characteristics and molecular analysis, this strain was identified asFusarium sambucinum. The results from this study indicated that the tobacco possess abundant endophytic fungi, which provides a new path for searching for novel antitumor resources.

tobacco; endophytic fungi; community distribution; secondary metabolites; cytotoxicity

S476.12

1007-5119（2017）03-0074-06 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.03.013

中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-TRIC05）；中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所青年科學基金項目“野生煙草Nicotianaalata化學成分多樣性及抗植物病原菌活性研究”（2016A02）

李盼盼（1990-），女，在讀碩士研究生，主要研究方向為植物內生真菌及其活性。E-mail：931449115@qq.com

*通信作者，E-mail：shenguoming@caas.cn

2016-09-12

2016-12-30