版納微型豬近交系SLA-DOA基因克隆、mRNA表達(dá)及蛋白質(zhì)功能生物信息學(xué)分析①

王 配 王淑燕 霍金龍 李羅剛 張永云 李衛(wèi)真 朱宏濤 姚茂東

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省版納微型豬近交系重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650201)

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·

版納微型豬近交系SLA-DOA基因克隆、mRNA表達(dá)及蛋白質(zhì)功能生物信息學(xué)分析①

王 配 王淑燕②霍金龍 李羅剛 張永云③李衛(wèi)真④朱宏濤④姚茂東④

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省版納微型豬近交系重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650201)

目的：克隆版納微型豬近交系(Banna mini-pig inbred line,BMI)白細(xì)胞抗原DO座位alpha亞基(SLA-DOA)的編碼序列，并對(duì)其19個(gè)重要組織mRNA表達(dá)作半定量分析。方法：RT-PCR方法獲得SLA-DOA的全長(zhǎng)cDNA序列；半定量RT-PCR方法分析其在BMI重要組織的mRNA表達(dá)譜，并運(yùn)用生物信息學(xué)對(duì)其核酸及蛋白序列進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果：BMISLA-DOAcDNA長(zhǎng)度為1 079 bp，編碼250個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為27.81 kD，等電點(diǎn)為6.48；位于豬7號(hào)染色體，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成；其mRNA高表達(dá)于淋巴結(jié)和胃，低表達(dá)于心臟、皮膚和十二指腸，在其他14種組織中不表達(dá)；SLA-DOA蛋白存在1個(gè)信號(hào)肽，1個(gè)跨膜螺旋，3個(gè)保守域，4個(gè)O連接的糖基化位點(diǎn)，18個(gè)磷酸化位點(diǎn)，位于細(xì)胞質(zhì)的概率是94.1%；系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，在所選擇的6個(gè)物種中，BMI(豬)與牛的親緣關(guān)系最近。結(jié)論：本研究成功克隆了版納微型豬近交系SLA-DOA基因并進(jìn)行了生物信息學(xué)功能分析和多種組織表達(dá)分析，為版納微型豬近交系的異種器官移植研究奠定基礎(chǔ)。

豬白細(xì)胞抗原DO座位alpha亞基；版納微型豬近交系；組織表達(dá)；生物信息學(xué)

MHC是主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex)的英文簡(jiǎn)稱，位于脊椎動(dòng)物有核細(xì)胞表面，由MHC基因家族(MHC Ⅰ類基因、Ⅱ類基因和Ⅲ類基因)編碼而成，含有多個(gè)基因座位，這些基因座位集中分布在脊椎動(dòng)物染色體的特定區(qū)域，主要生物學(xué)功能包括5個(gè)方面：向T細(xì)胞提呈蛋白質(zhì)抗原、參與個(gè)體T細(xì)胞庫的塑造、參與對(duì)免疫應(yīng)答的遺傳控制、誘導(dǎo)自身或同種淋巴細(xì)胞反應(yīng)和參與T細(xì)胞分化過程等[1,2]。

豬在消化生理、營(yíng)養(yǎng)代謝和解剖結(jié)構(gòu)等方面與人體極其相似，是生物醫(yī)學(xué)研究的理想動(dòng)物模型，更是異種器官移植的首選供體。豬的MHC又被稱為SLA(Swine leukocyte antigen)，即豬的白細(xì)胞抗原，也可分成Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類基因，是引發(fā)豬→人異種器官移植過程中急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)(Acute cellular rejection，ACR)的主要遺傳因素[3]。SLA-DOA基因編碼豬MHCⅡ類的非經(jīng)典分子DO的alpha亞基，DO是MHCⅡ類經(jīng)典分子的分子伴侶，參與MHCⅡ類分子的折疊及空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定；通過作為DM分子的抑制劑參與抗原提呈過程[4]。

版納微型豬近交系(Banna mini-pig inbred line，BMI)是全球第一個(gè)培育成功的大型哺乳動(dòng)物近交系，因其基因高度純合、遺傳背景清楚，生理學(xué)、疾病發(fā)生機(jī)理和解剖學(xué)等方面與人類極為相似，從而可為新藥臨床前安全性評(píng)價(jià)、豬基因組計(jì)劃中的功能基因研究、人類疾病動(dòng)物模型制作和人類異種器官移植等眾多領(lǐng)域提供實(shí)驗(yàn)材料和器官供體，具有重要的科研價(jià)值和科學(xué)意義[5,6]。SLA是由一系列相連鎖的基因(單倍體)構(gòu)成，位于豬的第七號(hào)染色體著絲粒的兩側(cè)，控制組織器官移植中的排異反應(yīng)，具有免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)等功能[3,7]。隨著版納微型豬近交系克隆豬“福?！?、轉(zhuǎn)基因克隆豬(綠色熒光蛋白及l(fā)eptin瘦蛋白抗肥胖因子)、雙基因敲除克隆豬(α 1,3-半乳糖苷酶基因)相繼出生，版納微型豬近交系豬→人移植排斥反應(yīng)的基礎(chǔ)研究是亟待開展的重要研究方向[8-11]。本研究克隆BMISLA-DOA基因，分析其核酸序列特征；通過mRNA的多組織表達(dá)譜確定其發(fā)揮功能的重要組織；通過功能生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)的功能，為今后進(jìn)一步深入研究SLA-DOA基因在BMI異種器官移植方面的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 屠宰10月齡健康版納微型豬近交系公豬一頭，取大腦、小腦、下丘腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、皮膚、肌肉、十二指腸、直腸、淋巴結(jié)、胃、睪丸、附睪、前列腺、精囊腺和尿道球腺等19種重要組織樣品，液氮速凍，轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存。

1.1.2試劑 主要試劑包括RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis、Ex Taq酶和DL2000 Marker等購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司。PCR引物由昆明碩擎生物科技有限公司合成。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1RNA提取和cDNA合成 利用RNAiso Plus分別提取組織RNA，用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)所提RNA的濃度及純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，合格樣品按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2設(shè)計(jì)并合成PCR引物 根據(jù)GenBank下載的豬SLA-DOAmRNA序列(NM_001185143.1)，利用Oligo 7軟件設(shè)計(jì)F/R特異引物(F:TTAAAACACCAGAGGGCCATG，R:CCGGCAAAATGCATAC AGT)來擴(kuò)增SLA-DOA基因全長(zhǎng)編碼區(qū)及部分側(cè)翼序列，長(zhǎng)度為1 079 bp。

1.2.3PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及程序 PCR反應(yīng)總體系20 μl，包括：13.8 μl ddH2O，2 μl 10×Ex Taq buffer，1.6 μl dNTPs(2.5 mmol/L)、各0.4 μl上下游引物(10 μmol/L)，1.6 μl 淋巴結(jié)cDNA模板(50 ng/μl)，0.2 μl 5 U/μl Ex Taq酶。PCR運(yùn)行程序：98℃ 90 s；94℃ 40 s，57℃ 45 s，72℃ 65 s，共循環(huán)35次；最后72℃后延伸10 min；擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送昆明碩擎生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.4多組織半定量表達(dá)分析 以管家基因18SrRNA作為內(nèi)參，利用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)SLA-DOA基因在版納微型豬近交系公豬的生殖系統(tǒng)(睪丸、附睪、尿道球腺、精囊腺和前列腺)、神經(jīng)系統(tǒng)(大腦、小腦和下丘腦)、消化系統(tǒng)(胃、十二指腸和直腸)、心臟、皮膚、肝臟、脾臟、肌肉、肺臟、腎臟和淋巴結(jié)共19種重要組織的表達(dá)情況。擴(kuò)增18SrRNA基因用到的引物為F：GGACATCTAAGGGCATCACAG，R：AATTCCGATAACGAACGA-GACT；SLA-DOA基因引物使用前面進(jìn)行基因克隆的引物。PCR反應(yīng)條件、體系同前，但為了確保PCR處于平臺(tái)期前的線性擴(kuò)增范圍內(nèi)，對(duì)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，之后取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中穩(wěn)壓130 V電泳40 min，電泳結(jié)束后利用凝膠成像儀拍照，使用Quantity one v4.62軟件處理膠圖。

1.2.5序列確定和生物信息學(xué)分析 測(cè)序結(jié)果利用DNAStar軟件中的SeqMan程序進(jìn)行組裝，并進(jìn)行BLAST在線比較(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，預(yù)測(cè)其CDS等結(jié)構(gòu)，并根據(jù)所獲得的cDNA序列利用DNAStar軟件中的EditSeq程序推導(dǎo)出氨基酸序列，并進(jìn)而預(yù)測(cè)推導(dǎo)蛋白的分子量(Mw)和等電點(diǎn)(pI)；使用PSortⅡ(http://psort.hgc.jp/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位；通過SIM4(http://doua.prabi.fr/software/sim4)和GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn)程序分析基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)[12，13]；NCBI上BLAST程序搜索得到家豬(NP_001172072.1)、黃牛(NP_001192849.1)、人(NP_002110.1)、普通獼猴(NP_001181623.1)、大鼠(NP_898874.2)和小鼠(NP_032232.2)的SLA-DOA氨基酸序列，利用DNAStar軟件中的MegAlign程序和Clustal X軟件與BMI的SLA-DOA的氨基酸序列(AOC89062.1)進(jìn)行多物種完全比對(duì)，參數(shù)取默認(rèn)值，之后利用GeneDoc軟件輸出；基于多物種同源性比對(duì)結(jié)果，進(jìn)一步利用MEGA7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用NCBI服務(wù)器上的Conserved Domain Architecture Retrieval Tool(CDART)工具在線預(yù)測(cè)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，跨膜螺旋和信號(hào)肽分別使用TMHMM和SignalP 4.1 server進(jìn)行分析；磷酸化和O-糖基化位點(diǎn)分別使用NetPhos 3.1和NetOGlyc 4.0在線服務(wù)器進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1BMISLA-DOA基因分離和序列分析 以BMI淋巴結(jié)cDNA為模板，采用特異性引物F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度為1 079 bp，與預(yù)期相符，見圖1A。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序，得到BMI的SLA-DOAmRNA序列，與參考序列比較，發(fā)現(xiàn)2個(gè)無義突變位點(diǎn)，1個(gè)有義突變位點(diǎn)和2個(gè)3′UTR區(qū)突變位點(diǎn)，見圖1B。有義突變發(fā)生在編碼區(qū)的第662位，造成第221位氨基酸從半胱氨酸(普通豬)突變?yōu)槔野彼?BMI)。BMISLA-DOAcDNA長(zhǎng)度為1 079 bp，已提交GenBank，登錄號(hào)為KU705644，含有18 bp的5′UTR區(qū)、308 bp的3′UTR區(qū)和753 bp的開放閱讀框，推測(cè)編碼250個(gè)氨基酸(圖1B)，有94.1%概率定位于細(xì)胞質(zhì)中。

2.2BMISLA-DOA基因座基因組結(jié)構(gòu)分析 以BMISLA-DOAcDNA序列作為種子序列，在家豬基因組數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=OGP_9823_10718)中進(jìn)行BLAST搜索，找到含有該cDNA全長(zhǎng)的細(xì)菌人工染色體序列：Sus scrofa chromosome 7 clone CH242-254M4(GenBank登錄號(hào)：CU618315.9)，表明該基因位于豬7號(hào)染色體上。隨后，利用在線的SIM4和GSDS程序分析其外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明該基因長(zhǎng)2 946 bp，含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，外顯子-內(nèi)含子剪接均符合GT-AG規(guī)則(圖2)。

圖1 BMI SLA-DOA基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜(A)和序列(B)Fig.1 RT-PCR product (A) and sequence of (B) BMI SLA-DOA geneNote:ATG.Start codon;*.Stop codon;The English letters of upper line,nucleotide sequence;The English letters of lower line,a mino acid sequences;Underlines.primer sequence;frame box indicates mutation nucleotide (compared with NM_001185143.1).

圖2 BMI SLA-DOA基因組、mRNA和蛋白保守域結(jié)構(gòu)Fig.2 Genomic organization,mRNA and protein domain structure of BMI SLA-DOA gene

2.3BMI SLA-DOA蛋白功能位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)域分析 推測(cè)BMI SLA-DOA蛋白質(zhì)的分子量約27.81 kD，理論等電點(diǎn)為6.48；其中包括4個(gè)O-glycosylation位點(diǎn)(Ser103和Thr106、109、116)，9個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)(Ser19、59、103、121、170、182、246、247、248)和9個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)(Thr16、49、109、153、155、161、178、202、241)(圖3)。第1～25位氨基酸為信號(hào)肽，第18～240位為跨膜螺旋；第31～110位氨基酸為MHCⅡ alpha功能區(qū)，第112～205位為IgC-MHCⅡ alpha區(qū)，第203～250位為C1-set C-terminal區(qū)(圖2和圖4)。

2.4SLA-DOA基因同源性比較 用BMI的SLA-DOA氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行同源性搜索，獲得了普通豬、黃牛、人、普通獼猴、大鼠和小鼠等動(dòng)物的該蛋白的氨基酸序列，序列比對(duì)表明，BMI與這些物種的相似性依次為99.6%、80.4%、78.8%、78.0%、70.4%和70.0%；這些哺乳動(dòng)物SLA-DOA蛋白質(zhì)均含有250個(gè)氨基酸，相對(duì)于氨基端和羧基末端，中間區(qū)域相對(duì)保守；構(gòu)建的這些哺乳動(dòng)物SLA-DOA蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，同為靈長(zhǎng)目的人類和普通獼猴聚為一支，同為偶蹄目的BMI、普通豬和黃牛聚為一支，同為嚙齒目大鼠和小鼠聚為另一支，符合系統(tǒng)進(jìn)化的分類標(biāo)準(zhǔn)(圖5、6)。

圖3 推測(cè)的BMI SLA-DOA蛋白的O-糖基化位點(diǎn)(A)與磷酸化位點(diǎn)(B)Fig.3 Predicted O-glycosylation (A) and phosphor-ylation sites (B) of BMI SLA-DOA protein

2.5多組織半定量表達(dá)分析 以18SrRNA為內(nèi)參基因，利用RT-PCR方法檢測(cè)SLA-DOA基因在成年版納微型豬近交系公豬的生殖系統(tǒng)(睪丸、附睪、尿道球腺、精囊腺和前列腺)、神經(jīng)系統(tǒng)(大腦、小腦和下丘腦)、消化系統(tǒng)(胃、十二指腸和直腸)、心臟、皮膚、肝臟、脾臟、肌肉、肺臟、腎臟和淋巴結(jié)共19種組織的轉(zhuǎn)錄水平，根據(jù)獲得的瓊脂糖凝膠電泳圖，利用Quantity One軟件分析條帶的灰度值，再利用Excel 2007繪制出柱狀圖，結(jié)果表明SLA-DOA基因mRNA在BMI淋巴結(jié)和胃中高表達(dá)；在心臟、皮膚和十二指腸中低表達(dá)；在其他14種組織中幾乎不表達(dá)，見圖7。

圖4 推測(cè)的BMI SLA-DOA蛋白的信號(hào)肽(A)、跨膜螺旋(B)與保守結(jié)構(gòu)域(C)Fig.4 Predicted signal peptide (A),transmembrane structure (B) and conversed domain (C) of BMI SLA-DOA protein

3 討論

當(dāng)前器官移植治療疾病面臨的最大問題是供體器官嚴(yán)重缺乏，器官衰竭患者多因無法及時(shí)得到供體器官而死亡。異種器官移植已成為目前科學(xué)界和醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的解決供體器官短缺的有效途徑，豬已被認(rèn)為是最適合的非靈長(zhǎng)類異種器官移植供體[7，8]。版納微型豬近交系是由曾養(yǎng)志教授和其團(tuán)隊(duì)30年來堅(jiān)持采用連續(xù)高度近交加嚴(yán)格選擇的科研思路，克服了早期階段嚴(yán)重近交衰退引起的眾多困難，培育成的我國首例哺乳動(dòng)物(豬)近交系，被譽(yù)為豬→人異種器官移植的良好供體[9,14]。為了早日實(shí)現(xiàn)BMI→人異種器官移植的臨床應(yīng)用，對(duì)其免疫排斥反應(yīng)機(jī)理的研究尤為重要。隨著基因敲除技術(shù)日益成熟，已基本上可以克服超急性免疫排斥反應(yīng)，下一關(guān)鍵環(huán)節(jié)就是解決豬-人異種器官移植急性細(xì)胞性排斥ACR。SLA是豬的主要組織相容性復(fù)合體，包含三類基因(Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類)，是引起ACR的關(guān)鍵遺傳因素[15]。SLAⅡ類基因又稱免疫應(yīng)答基因，位于D區(qū)，包含DQ、DR和DO等座位，每個(gè)座位分為A基因和B基因，A基因編碼座位的alpha鏈，B基因編碼座位的beta鏈，alpha鏈和beta鏈形成的異源二聚體或多聚體可以將外源分子呈遞給CD4+T或CD8+T細(xì)胞，參與細(xì)胞免疫過程[16]。前面我們已進(jìn)行了BMI的DQ和DR座位的研究[5,17]，本研究首先以BMI淋巴結(jié)組織總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)的特異引物對(duì)SLA-DOA基因進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了1 079 bp的片段。通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序并拼接，獲得BMISLA-DOA基因的cDNA序列(GenBank登錄號(hào)：KU705644)，CDS區(qū)長(zhǎng)753 bp，與GenBank數(shù)據(jù)庫中普通豬的SLA-DOA序列(登錄號(hào)：NM_001185143.1)比較，共發(fā)現(xiàn)5個(gè)堿基差異位點(diǎn)，2個(gè)無義突變位點(diǎn)，1個(gè)有義突變位點(diǎn)和2個(gè)3′UTR區(qū)突變位點(diǎn)。有義突變發(fā)生在DOA編碼區(qū)的第662位，造成第221位氨基酸從半胱氨酸Cys突變?yōu)槔野彼酺yr。兩個(gè)Cys通過它們側(cè)鏈上的-SH基氧化形成二硫鍵，二硫鍵是蛋白質(zhì)形成特定空間結(jié)構(gòu)的重要化學(xué)鍵，可以將肽鏈折疊成特定的空間結(jié)構(gòu)。通過多物種氨基酸比對(duì)發(fā)現(xiàn)普通豬、人、獼猴、黃牛、大鼠和小鼠在第221位氨基酸均為Cys，且221位氨基酸位于跨膜螺旋和C1-SETC末端保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)，推測(cè)此氨基酸的突變可能會(huì)影響SLA-DOA蛋白在BMI正常功能，但還需要進(jìn)一步研究才能確定。

分析BMI SLA-DOA氨基酸結(jié)構(gòu)和功能表明，該蛋白的氨基酸序列含有1個(gè)跨膜螺旋，多個(gè)絲氨酸、蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)以及O連接糖基化位點(diǎn)結(jié)構(gòu)，含有兩個(gè)alpha區(qū)(MHCⅡ和IgC-MHCⅡ)和1個(gè)C1-set C-terminal區(qū)，這是MHCⅡ類分子alpha亞基的共有結(jié)構(gòu)，與其他哺乳動(dòng)物的結(jié)果類似。與其他動(dòng)物的氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，BMI SLA-DOA與哺乳動(dòng)物對(duì)應(yīng)蛋白的同源性在70%以上，說明該基因在進(jìn)化過程中具有較高的保守性。多物種BMI SLA-DOA氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明同為靈長(zhǎng)目的人類和獼猴聚為一支，同為偶蹄目的BMI、普通豬和黃牛聚為一支，同為嚙齒目大鼠和小鼠聚為另一支，符合系統(tǒng)進(jìn)化的分類標(biāo)準(zhǔn)。以18SrRNA為內(nèi)參對(duì)照校正的多組織表達(dá)譜分析表明SLA-DOA基因在BMI的淋巴結(jié)和胃中高表達(dá)。淋巴結(jié)組織是機(jī)體重要的免疫器官，參與細(xì)胞免疫和體液免疫，間接表明了SLA-DOA基因可能參與了BMI的免疫應(yīng)答過程；胃是重要的消化器官，SLA-DOA基因在BMI胃中高表達(dá)的原因需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，該研究利用RT-PCR方法成功分離了版納微型豬近交系SLA-DOA基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)序列，采用半定量RT-PCR確定了其在BMI 19種組織中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了功能生物信息學(xué)分析，研究結(jié)果將為深入研究SLA-DOA基因在豬中的功能奠定基礎(chǔ)。

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[收稿2016-11-21 修回2016-12-14]

(編輯 倪 鵬)

Cloning,mRNAexpressionandproteinfunctionalbioinformaticsanalysisofSLA-DOAinBannamini-piginbredline

WANGPei,WANGShu-Yan,HUOJin-Long,LILuo-Gang,ZHANGYong-Yun,LIWei-Zhen,ZHUHong-Tao,YAOMao-Dong.KeyLaboratoryofBannaMini-PigInbredLineofYunnanProvince,YunnanAgriculturalUniversity,Kun-ming650201,China

Objective:To clone swine leukocyte antigen,class II,DO alpha (SLA-DOA) gene from Banna mini-pig inbred line (BMI) and detect its mRNA expression level in 19 important tissues.Methods:The complete cDNA sequence ofSLA-DOAgene was cloned by RT-PCR method from BMI and the mRNA expression pattern in BMI important tissues was examined by semi-quantative RT-PCR method.Nucleotide and protein sequences ofSLA-DOAwere used to carry out bioinformatics analysis and construct the phylogenetic tree.Results:The cDNA length of BMISLA-DOAwas 1 079 bp,which encoded a protein of 250 amino acids with molecular weight (Mw) 27.81 kD,and isoelectric point (pI) 6.48.Genome structure analysis showed it localized to Sus scrofa chromosomes 7 and consisted of four exons and three introns.Semi-quantitative expression analysis showed that SLA-DOA gene expressed highly in the lymph nodes and stomach;weakly in the heart,skin and duodenum and none in other 14 tissues.Functional bioinformatics analysis indicated that SLA-DOA protein contained one signal peptide,one transmembrane region,three conserved domains,four O-GlcNAc glycosylation sites,18 potential phosphorylation sites and to be located in the cytoplasm with 94.1% certainty.Phylogenetic analysis demonstrated that BMI (pig) had the closest relationship with cattle.Conclusion:This study have successfully cloned theSLA-DOAgene of Banna mini-pig inbred line,performed bioinformatics analysis and tissue expression profile analysis.It will provide a basis for the studies of BMI xenotransplantation.

SLA-DOA;Banna mini-pig inbred line;Tissue expression;Bioinformatics

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.014

①本文受國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160439,31660650,31660637,31460580)和云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2016FB046，2016FD027)資助。

②共同第一作者。

③云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科專業(yè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，昆明 650201。

④云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201。

王 配(1987年-)，女，博士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事異種移植免疫排斥機(jī)制方面的研究，E-mail：peipei99999@126.com。

及指導(dǎo)教師：霍金龍(1975年-)，男，博士，副教授，主要從事動(dòng)物分子遺傳學(xué)方面的研究,E-mail:jinlonghuo973@163.com。

S852.4

A

1000-484X(2017)06-0873-06