CXCR1、CXCR2及CXCL8在乙肝相關(guān)肝癌中的表達(dá)及臨床意義①

畢惠娟 陳建民 陳靜靜 王 健

(安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥230000)

CXCR1、CXCR2及CXCL8在乙肝相關(guān)肝癌中的表達(dá)及臨床意義①

畢惠娟 陳建民 陳靜靜 王 ?、?/p>

(安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥230000)

目的：探討乙肝相關(guān)肝癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞及肝活檢組織CXCR1、CXCR2及CXCL8表達(dá)及其臨床意義。方法：用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)36例乙肝相關(guān)肝癌患者外周血PBMCs中CXCR1、CXCR2及CXCL8 mRNA水平；SP法檢測(cè)肝活檢組織CXCR1、CXCR2及CXCL8蛋白表達(dá)水平；化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)血清CRP水平，并對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果：乙肝相關(guān)肝癌患者PBMCs中CXCR1、CXCR2及CXCL8 mRNA水平分別為(0.952 7±0.197 2)、(0.896 9±0.173 0)、(1.771 9±0.248 9)，較正常對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。SP結(jié)果提示，CXCR1、CXCR2及CXCL8的蛋白水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)。乙肝相關(guān)肝癌患者血清CRP水平與PBMC內(nèi)CXCR1(r=0.54,P<0.01)、CXCR2(r=0.49,P<0.01)及CXCL8(r=0.63,P<0.01)呈正相關(guān)。結(jié)論：乙肝相關(guān)肝癌患者外周血PBMCs及肝活檢組織CXCR1、CXCR2及CXCL8表達(dá)明顯升高，且與血清CRP呈正相關(guān)，推測(cè)CXCR1、CXCR2及CXCL8介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程可能在乙肝相關(guān)肝癌發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，為肝癌免疫干擾治療提供新的靶點(diǎn)。

肝癌；CXCR1；CXCR2；CXCL8;mRNA；單個(gè)核細(xì)胞；肝活檢組織

肝細(xì)胞癌是嚴(yán)重危害人類健康的全球性腫瘤，我國(guó)高發(fā)，每年發(fā)病率為28.71/105，占所有惡性腫瘤第4位(10.04%)，死亡率為26.04/105，占所有癌癥死亡率第2位(14.42%)。眾多流行病學(xué)資料顯示，慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是肝細(xì)胞癌的主要病因，但其具體機(jī)制不清。目前肝癌的防治仍面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)的放、化療早期療效不明顯，毒副作用大，手術(shù)切除率低，復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率高。因此，闡明乙肝相關(guān)肝癌發(fā)病的分子機(jī)制，研發(fā)針對(duì)肝癌組織局部的分子靶向治療是肝癌治療的新方向[1]。近年來，趨化因子受體及其配體在腫瘤中的作用引起了人們的關(guān)注。它們廣泛參與了細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡、組織損傷、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等各種疾病的病理生理過程[2]。多數(shù)腫瘤細(xì)胞均可表達(dá)廣泛的趨化因子受體，并受趨化因子受體及其配體主導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。CXCR1、CXCR2作為CXC趨化因子受體家族最重要的兩個(gè)成員，分別由Holmes等[3]和Murphy等[4]先后成功克隆獲得，均定位于染色體2q35，二者同源性高達(dá)77%，擁有共同配體CXCL8，在多種腫瘤性疾病中均表達(dá)升高，在腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥及血管新生等方面發(fā)揮著極其重要的作用。為了探討CXCR1、CXCR2及其配體CXCL8在肝癌的增殖生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移中扮演何種作用，本文通過篩選典型的乙肝相關(guān)性肝癌患者，檢測(cè)其外周血PBMCs及肝活檢組織中CXCR1、CXCR2及CXCL8的表達(dá)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床資料 乙肝相關(guān)肝癌患者：篩選我院2014年10月至2015年9月收治的36例乙肝相關(guān)肝癌患者，其中男21例，女15例，年齡37～70歲。臨床診斷均符合原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011年版)[5]。另選28例本市中心血站體檢正常的獻(xiàn)血者為正常對(duì)照，其中男16例，女12例，年齡28～69歲。肝活檢組織：收集安徽醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2013年8月至2015年10月收治的乙肝相關(guān)肝癌患者肝穿與肝外傷手術(shù)切除病理標(biāo)本30例(男18例，女12例)，年齡29～73歲。入選病例病理分級(jí)均符合2015年原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南[6]。正常對(duì)照：同期醫(yī)院收治的肝移植供肝者，經(jīng)病理診斷證實(shí)肝細(xì)胞正常患者12例(男9例，女3例)，年齡28～53歲。

1.1.2試劑與儀器 ABI7900熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；實(shí)時(shí)聚合酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒(TaKaRa公司)；鼠抗人hCXCR1單克隆抗體(sc-7303，SANTA公司)；鼠抗人hCXCR2單克隆抗體(sc-7304，SANTA公司)；鼠抗人hCXCL8單克隆抗體(MAB208，R&D公司)。

1.2方法

1.2.1PBMC標(biāo)本收集 抽取乙肝相關(guān)肝癌患者及健康對(duì)照者早晨空腹肝素抗凝全血5 ml，加入等體積Hank′s液稀釋后置含2 ml Ficoll-Hypaque分離液試管中，2 500 r/min密度梯度離心20 min，收集云霧狀單個(gè)核細(xì)胞層，用RPMI1640完全培養(yǎng)液1 500 r/min離心10 min洗滌細(xì)胞2次，收集沉淀細(xì)胞，以RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整懸浮細(xì)胞至1×106ml-1。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) 采用SYBR Green染料法，以cDNA為模板，在ABI7900熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。根據(jù)GenBank中人CXCR1、CXCR2及IL-8 mRNA序列，以Primer Express軟件設(shè)計(jì)基因的特異性引物和探針，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(見表1)。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束讀取循環(huán)閾值(Ct)。根據(jù)公式ΔCt= Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因和ΔΔCt=ΔCt肝癌組-ΔCt對(duì)照組，計(jì)算2-ΔΔCt對(duì)目的基因的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量。

1.2.3CXCR1、CXCR2及CXCL8蛋白檢測(cè) 常規(guī)切取3～4 μm厚的切片， 60℃烤片1 h，置于新鮮二甲苯中脫蠟后過2次蒸餾水，將切片置于3%雙氧水中，微波低熱3 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復(fù)抗原，滴加50 μl CXCR1/CXCR2/CXCL8(1∶200 稀釋)單克隆抗體，置濕盒中4℃過夜(陰性對(duì)照以PBS代替一抗)，滴加50 μl HRP二抗，孵30.0%(9/30)和56.7%(17/30)；CXCR2表達(dá)陽(yáng)性率為76.7%(23/30)，其中弱表達(dá)和強(qiáng)表達(dá)占總病例數(shù)的比例分別為26.7%(8/30)和50.0%(15/30)；CXCL8表達(dá)陽(yáng)性率為93.3%(28/30)，其中弱表達(dá)和強(qiáng)表達(dá)占總病例數(shù)的比例分別為33.3%(10/30)和60.0%(18/30)；12例正常肝組織中CXCR1、CXCR2及CXCL8表達(dá)陽(yáng)性率分別為33.3%(4/12)、25.0%(3/12)、41.6%(5/12)，陽(yáng)性染色強(qiáng)度均較HCC組弱(見圖4)。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)HCC患者肝活檢組織CXCR1、CXCR2及IL-8蛋白表達(dá)較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見表2)。

表1 CXCR1、CXCR2和GAPDH引物和探針序列

圖3 CXCR1、CXCR2及CXCL8 mRNA與血清CRP相關(guān)性Fig.3 Relation between serum CRP and CXCR1,CXCR2,CXCL8 mRNA

表2 CXCR1、CXCR2及CXCL8在肝癌組織中的表達(dá)

圖4 肝癌患者肝活檢組織CXCR1、CXCR2及CXCL8蛋白表達(dá)Fig.4 Protein expression of CXCR1,CXCR2 and CXCL8 in liver biopsy of liver cancerNote:A-C.The protein expression of CXCR1,CXCR2 and CXCL8 in normal liver;D-F.The protein expression of CXCR1,CXCR2 and CXCL8 in liver cancer tissues.

3 討論

CXCR1和CXCR2是CXC趨化因子受體(CXC chemokine receptor,CXCR)家族中的兩個(gè)重要成員，二者同源性高達(dá)77%，主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞、淋巴單核細(xì)胞等各種炎癥細(xì)胞表面，它們擁有共同配體CXCL8，當(dāng)CXCR1/2與CXCL8特異性結(jié)合，可誘導(dǎo)大量炎癥細(xì)胞遷移至特定感染部位，產(chǎn)生局部炎癥免疫應(yīng)答，是一類重要的非可控炎癥因素[7]。機(jī)體非可控性炎癥在腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中扮演著重要角色，如慢性胃炎與胃癌、乙型肝炎與肝癌等[8]，CXCR1/2作為腫瘤相關(guān)炎癥重要參與者，在腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移、血管新生等方面發(fā)揮不可忽視的作用[9]。大量研究發(fā)現(xiàn)，CXCR1/2在惡性黑色素瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤的發(fā)生、增殖、生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移、血管新生等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用[10-12]。

肝癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高、預(yù)后差，其中，HBV的慢性感染一直被認(rèn)為是肝癌發(fā)生的高危因素之一，但是其具體的分子生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。本課題旨在研究CXCR1、CXCR2及CXCL8在乙肝相關(guān)性肝癌中的表達(dá)情況和臨床意義，初步闡明其在乙肝相關(guān)性肝癌發(fā)生中的作用，為乙肝相關(guān)性肝癌的防治提供可靠的理論依據(jù)和新的治療靶點(diǎn)。

在本研究中，通過實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)36例乙肝相關(guān)性肝癌患者PBMCs內(nèi)CXCR1/2及CXCL8 mRNA水平，發(fā)現(xiàn)肝癌患者PBMCs內(nèi)CXCR1、CXCR2及CXCL8 mRNA均較正常對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Welling等[13]比較了90例肝癌和180例肝硬化患者血清多種細(xì)胞因子表達(dá)，發(fā)現(xiàn)只有IL-8表達(dá)水平有顯著差異，并且IL-8水平越高，疾病進(jìn)展越快，預(yù)后越差，這說明高水平的IL-8可能促進(jìn)肝硬化向肝癌的發(fā)展。Ren等通過ELISA法檢測(cè)59例肝癌患者和15例體檢健康者血清IL-8濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清IL-8水平與腫瘤大小，疾病分期呈明顯正相關(guān)，綜上所述，推測(cè)高水平CXCL8可能通過上調(diào)其受體CXCR1/2表達(dá)，調(diào)控肝癌患者局部及全身炎癥免疫反應(yīng)，參與乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[14]。

本研究進(jìn)一步通過SP免疫組化法檢測(cè)HCC患者肝活檢組織CXCR1、CXCR2及CXCL8蛋白水平，結(jié)果顯示，肝癌患者肝活檢組織CXCR1、CXCR2及CXCL8蛋白水平較正常對(duì)照均明顯升高(P<0.01)，此與王吉榮等[15]研究結(jié)果一致。Xue等[16]通過對(duì)比觀察四種轉(zhuǎn)移潛能由低到高人肝癌細(xì)胞株(SMMC-7721,MHCC97-L,MHCC97-H,HCCLM6)趨化因子受體譜表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移潛能組HCCLM6表達(dá)譜中CXCR1(P=0.006)表達(dá)明顯高于低轉(zhuǎn)移潛能組SCMMC-7721，提示 CXCR1與HCC侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。以上結(jié)果都進(jìn)一步證實(shí)肝癌細(xì)胞可通過分泌高水平的CXCL8，誘導(dǎo)CXCR1/2高表達(dá)，在肝癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著極其重要的作用。

CRP是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，當(dāng)機(jī)體炎癥、感染或急性組織損傷時(shí)，由肝臟迅速合成，激活補(bǔ)體，活化免疫細(xì)胞，具有調(diào)理素作用。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤患者血清中CRP均有不同程度升高，目前已廣泛應(yīng)用于臨床腫瘤的輔助診斷、病情活動(dòng)評(píng)估與療效判斷[17]。本研究通過相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)HCC患者血清CRP與CXCR1、CXCR2及CXCL8 mRNA呈明顯正相關(guān)，這表明CXCR1/2與CXCL8與肝癌患者肝組織的炎癥活動(dòng)程度和損傷程度密切相關(guān)，隨著肝損傷程度增大和炎癥活動(dòng)程度的增強(qiáng)，CXCR1/2與CXCL8表達(dá)升高，提示CXCR1/2與CXCL8參與肝癌患者疾病進(jìn)程，通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CXCR1/2與CXCL8水平，有助于了解肝細(xì)胞損傷程度，對(duì)早期發(fā)現(xiàn)肝癌、減少肝癌漏診及判斷預(yù)后意義重大。

綜上所述，乙肝相關(guān)性肝癌患者體內(nèi)CXCR1、CXCR2與其配體CXCL8明顯升高，可能通過激活下游信號(hào)通路，誘導(dǎo)機(jī)體局部及全身炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)腫瘤血管新生，在肝癌的發(fā)生、增殖生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用，同時(shí)也為乙肝相關(guān)肝癌的免疫干預(yù)治療提供新的方向。

[1] Chen W,Zheng R,Zeng H,etal.The updated incidences and mortalities of major cancers in China,2011[J].Chin J Cancer,2015,34(11):502-507.

[2] Campbell LM,Maxwell PJ,Waugh DJ.Rationale and means to target pro-inflammatory interleukin-8 (CXCL8) signaling in cancer[J].Pharmaceuticals (Basel),2013,6(8):929-959.

[3] Holmes WE,Lee J,Kuang WJ,etal.Structure and functional expression of a human interleukin-8 receptor.Science.1991.253:1278-1280.[J].J Immunol,2009,183(5):2895-2897.

[4] Murphy PM,Tiffany HL.Cloning of complementary DNA encoding a functional human interleukin-8 receptor.Science.1991.253:1280-1283[J].J Immunol,2009,183(5):2898-2901.

[5] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.原發(fā)性肝癌診療規(guī)范年版[J].中華肝臟病雜志,2012,20(6):419-426.

[6] 中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)肝癌專業(yè)委員會(huì).原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南(2015年版)[J].臨床肝膽病雜志，2015，31(6)：833-839.

[7] Bi HJ,Wang J,Huang HS,etal.Influence of IFN on expression of chemokine receptor CXCR1,CXCR2 and their ligand IL-8 in the patients with chronic hepatitis B[J].Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi,2012,28(4):422-425.

[8] Sandra S,McAllister Robert A,Weinberg.The tumour-induced systemic environment as a critical regulator of cancer progression and metastasis[J].Nature Cell Biology,2014,16(8):717-727.

[9] Li H,Xu F,Li S,etal.The tumor microenvironment:An irreplaceable element of tumor budding and epithelial-mesenchymal transition-mediated cancer metastasis[J].Cell Adh Migr,2016,10(4):434-446.

[10] Sun Q,Sun F,Wang B,etal.Interleukin-8 promotes cell migration through integrin αvβ6 upregulation in colorectal cancer[J].Cancer Lett,2014,354(2):245-253.

[11] Tang KH,Ma S,Lee TK,etal.CD133(+) liver tumor-initiating cells promote tumor angiogenesis,growth and self-renewal through neurotensin IL-8CXCL1 signaling[J].Hepatology,2012,55(3):807-820.

[12] Li Z,Wang Y,Dong S,etal.Association of CXCR1 and 2 expression with gastric cancer metastasis in ex vivo and tumor cell invasion in vitro[J].Cytokine,2014,69(1):6-13.

[13] Welling TH,Fu S,Wan S,etal.Elevated serum IL-8 is associated with the presence of hepatocellular carcinoma and independently predicts survival[J].Cancer Invest,2012,30(10):689-697.

[14] Nojima H,Konishi T,Freeman CM,etal.Chemokine receptors,CXCR1 and CXCR2,differentially regulate exosome release in hepatocytes[J].PLoS One,2016,11(8):e0161443.

[15] 王吉榮,武傳星.IL-8及其受體在原發(fā)性肝癌中表達(dá)及其意義[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2013,7(1):378-379.

[16] Xue TC,Chen RX,Ye SL,etal.Different expressions of chemokine receptors in human hepatocellular carcinoma cell lines with different metastatic potentials[J].Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi,2007,15(4):261-265.

[17] Kinoshita A,Onoda H,Imai N,etal.C-reactive protein as a prognostic marker in patients with hepatocellular carcinoma[J].Hepatogastroenterology,2015,62(140):966-970.

[收稿2016-10-13 修回2016-11-23]

(編輯 張曉舟)

ExpressionsandclinicalsignificanceofCXCchemokinereceptor1and2andCXCL8inhepatitisBrelatedhepatocellularcarcinoma

BIHui-Juan,CHENJian-Min,CHENJing-Jing,WANGJian.DepartmentofClinicalLaboratory,theFourthAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230000,China

Objective:To investigate the expression levels of CXCR1，CXCR2 and their common ligand CXCL8 in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and liver biopsy from the patients with hepatitis B related hepatocellular carcinoma and their clinical significances.Methods:Quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect the mRNA levels of CXCR1,CXCR2,CXCL8 in the peripheral blood mononuclear cells of thirty-six hepatitis B related hepatocellular carcinoma and the protein levels of CXCR1 and CXCR2 and CXCL8 in liver biopsy were detected by SP immunohistochemical method.The level of C-reactive protein in serum was determined by chemiluminescence immunoassay respectively.Then,the correlations between CRP and the mRNA of CXCR1,CXCR2 and CXCL8 were analyzed.Results:The mRNA levels of CXCR1 (0.952 7±0.197 2),CXCR2 (0.896 9±0.173 0),CXCL8 (1.771 9±0.248 9) in the PBMCs of hepatitis B related hepatocellular carcinoma were significantly higher than those in controls (P<0.01).And the protein levels of CXCR1,CXCR2 and CXCL8 were also obviously increased in liver biopsy of hepatitis B related hepatocellular carcinoma (P<0.05).In addition,there was positive correlations between the level of serum C-reactive protein and the mRNA expression of CXCR1(r=0.54,P<0.01),CXCR2(r=0.49,P<0.01),CXCL8(r=0.63,P<0.01).Conclusion:The levels of CXCR1,CXCR2 and CXCL8 significantly increased in hepatitis B related hepatocellular carcinoma patients and positively correlated with serum CRP,suggesting that CXCR1,CXCR2 and their common ligand CXCL8 signal transduction process may play a key role in the pathological process of hepatitis B related hepatocellular carcinoma,which may provide a new direction for the immune intervention therapy of hepatocellular carcinoma.

Hepatocellular carcinoma;CXCR1;CXCR2;CXCL8;mRNA;PBMC;Liver biopsy

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.018

①本文為安徽醫(yī)科大學(xué)校級(jí)基金(2015xkj049)、安徽省自然科學(xué)基金(1308085MH148)和安徽省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2016SD20)。

②安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原學(xué)與免疫學(xué)教研室，淮南232001。

畢惠娟(1987年-)，女，碩士，主管技師，主要從事病毒性肝炎與分子免疫方面的研究。

及指導(dǎo)教師：王 健(1962年-)，男，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事病毒性肝炎與免疫學(xué)方面研究，E-mail:wangjian8237@sina.com。

R392.1

A

1000-484X(2017)06-0895-05