柱后衍生-HPLC測(cè)定與分析沉香中黃曲霉毒素

唐健新 區(qū)桂姍 蘇章軒 徐萬(wàn)幫 梁生旺

1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510000；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東 廣州 510180； 3.廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510180

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柱后衍生-HPLC測(cè)定與分析沉香中黃曲霉毒素

唐健新1,2區(qū)桂姍1,2蘇章軒3徐萬(wàn)幫3梁生旺1*

1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510000；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東 廣州 510180； 3.廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510180

目的：對(duì)沉香中黃曲霉毒素進(jìn)行測(cè)定。方法：采用柱后衍生-HPLC聯(lián)用技術(shù)，測(cè)定沉香中黃曲霉毒素的含量，了解所獲沉香中黃曲霉毒素污染情況。結(jié)果：按照《中國(guó)藥典》2015版的要求與指導(dǎo)原則， 69批次沉香樣品均未檢出黃曲霉毒素。結(jié)論：柱后衍生-HPLC聯(lián)用技術(shù)測(cè)定沉香中黃曲霉毒素方法可行，我國(guó)沉香黃曲霉毒素未受到黃曲霉毒素污染。

沉香；黃曲霉；柱后衍生-HPLC

黃曲霉毒素是真菌毒素中毒性最強(qiáng)的一種真菌毒素，具有極強(qiáng)的毒性和致癌性。在自然界中，無(wú)論是土壤、腐爛有機(jī)質(zhì)物品與植物纖維、農(nóng)產(chǎn)品或者其他食品上都有黃曲霉毒素存在。黃曲霉最適宜生存在相對(duì)濕度 85%左右的熱帶、亞熱帶地區(qū)并產(chǎn)生黃曲霉毒素。我國(guó)地域十分遼闊以及氣候的多樣性和復(fù)雜性導(dǎo)致我國(guó)中藥材和中藥飲片在加工、貯藏、運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中，很容易發(fā)生霉變而導(dǎo)致被黃曲霉毒素污染。因此，檢測(cè)中藥材中黃曲霉毒素具有極其重要的意義[1-4]。

目前2015版《中國(guó)藥典》僅僅對(duì)少數(shù)幾種中藥材規(guī)定有關(guān)黃曲霉毒素含量的限度標(biāo)準(zhǔn)，如陳皮，胖大海等。沉香是我國(guó)的名貴中藥材之一，2016年廣東省通過(guò)立法保護(hù)廣東八種道地中藥材，沉香為其中之一。由于沉香主產(chǎn)越南、海南和廣東等熱帶和亞熱帶地區(qū)，該地區(qū)的環(huán)境條件極易被黃曲霉等真菌類污染而產(chǎn)生黃曲霉毒素。因此，筆者擬采用柱后衍生與高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)[5-8]，通過(guò)對(duì)沉香進(jìn)行黃曲霉毒素測(cè)定，建立沉香中黃曲霉毒素含量測(cè)定的方法，為監(jiān)管部門(mén)提供技術(shù)支持。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters 2695/2475高效液相色譜儀及柱后衍生系統(tǒng)；色譜柱：Shim-pack CLC-ODS C18(150mm×6mm，5μm)、phenomenex gemini C18(250mm×4.6mm，5μm)、Thermo ODS-2 HYERSIL(200mm×4.6mm，5μm)、Agilent Zorbax SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)； 離心機(jī)：Thermo Scientific Multifuge X1R1.2 材料 黃曲霉素混合對(duì)照品(批號(hào):46304-U LB8422，B1、B2、G1、G2純度分別為99.0%、99.0%、99.7%、99.5% ，Supelco Analitical)。甲醇、乙腈均為色譜純；水為試驗(yàn)室自制去離子水。0.05%碘溶液：取0.5g碘，溶解在100mL甲醇中，用水稀釋至1000mL(現(xiàn)配現(xiàn)用)。樣品：69批沉香樣品，來(lái)源于國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn),所有樣品均經(jīng)過(guò)本單位教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 以甲醇-乙腈-水(22∶18∶60)為流動(dòng)相，流速為1.0mL/min；衍生溶液為0.05%的碘溶液，衍生化泵流速0.3mL/min，衍生化溫度70℃。熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm。供試品溶液進(jìn)樣量50μL。

2.2 樣品的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密量取黃曲霉素混合對(duì)照品(B1、B2、G1、G2濃度分別為1.0μg/mL、0.3μg/mL、1.0μg/mL、0.3μg/mL)0.5mL，用甲醇定容至10mL，作為儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液1mL，用70%甲醇定容至25mL，搖勻，即得。2.2.2 供試品溶液的制備 取沉香藥材粉末2份，每份10g，于錐形瓶中，精密稱定，加入氯化鈉3g，精密加入70%甲醇75mL，超聲20min，離心5min(10000rpm)，精密量取上清液15mL，于50mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。離心5min(10000rpm)，用0.45μm孔徑的濾膜過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液20mL，通過(guò)免疫親和層析柱，流速2d/s，用20mL水分2次洗脫，棄去洗脫液，并通過(guò)約2mL空氣。用1.5mL甲醇分次洗脫，收集洗脫液，置2mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。

2.2.3 回收溶液的制備 取沉香藥材粉末6份(批號(hào)：120921YF03)，每份10g，于錐形瓶中，精密稱定，加入0.2mL黃曲霉素混合對(duì)照品儲(chǔ)備液(B1、B2、G1、G2濃度分別為0.0495μg/mL、0.01485μg/mL、0.04985μg/mL、0.014925μg/mL)外，其余同試驗(yàn)供試品溶液的制備方法。2.2.4 空白溶液的制備 精密量取2份經(jīng)檢驗(yàn)無(wú)黃曲霉毒素的沉香樣品，每份10g，于錐形瓶中，其余同試驗(yàn)供試品溶液的制備方法，制備空白溶液。

2.2.5 測(cè)定 按2015版《中國(guó)藥典》四部中，黃曲霉毒素測(cè)定法項(xiàng)下所述內(nèi)容進(jìn)行操作和檢測(cè)。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 加樣回收率試驗(yàn) 根據(jù)《中國(guó)藥典》四部有關(guān)要求可知：

試驗(yàn)將1.3.3中所獲得的回收溶液注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法獲得沉香中黃曲霉毒素加樣回收率。如圖1所示。

分別記錄六次加標(biāo)回收試驗(yàn)色譜峰面積，根據(jù)公式1，計(jì)算相應(yīng)的加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

從表1可知，黃曲霉毒素B1、G1回收率在70%～110%之間，黃曲霉毒素B2、G2回收率在75%～110%之間，符合2015版《中國(guó)藥典》四部中黃曲霉毒素測(cè)定法項(xiàng)下規(guī)定的要求。

2.3.2 精密度 以混合對(duì)照黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2溶液為參照指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行精密度考察，精密吸取對(duì)照品溶液25μL，注入液相色譜儀，重復(fù)測(cè)定6次，即得。結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2可知，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2在上述色譜條件下精密度良好，相關(guān)的RSD為分別為1.01%、0.87%、1.09%和0.92%，符合2015版《中國(guó)藥典》四部中黃曲霉毒素測(cè)定法項(xiàng)下規(guī)定的要求。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 (%)

2.3.3 專屬性考察 以制備的空白溶液為參照指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行專屬性考察，分別精密吸取空白溶液、對(duì)照品溶液和樣品溶液25μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。如圖2～4所示。

從圖2～4可知，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2在上述色譜條件下空白無(wú)干擾，四種有效成分的分離度良好符合2015版《中國(guó)藥典》四部中黃曲霉毒素測(cè)定法項(xiàng)下規(guī)定的要求。

2.3.4 線性關(guān)系采用逐步稀釋法，獲取系列不同濃度的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的混合對(duì)照溶液25μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。根據(jù)色譜峰面積和相應(yīng)的稀釋倍數(shù)(濃度)，根據(jù)waters高效液相色譜儀自帶的處理程序，獲得相應(yīng)的線性關(guān)系。見(jiàn)表3。

表3 方法的線性范圍和相關(guān)系數(shù)

從表3可知，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2在指定的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，符合2015版《中國(guó)藥典》四部中黃曲霉毒素測(cè)定法項(xiàng)下規(guī)定的要求。

2.4 耐用性的考察

2.4.1 不同色譜柱的考察 由于在測(cè)定的沉香樣品中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品，故采用對(duì)照溶液對(duì)不同色譜柱進(jìn)行考察。照含量測(cè)定項(xiàng)下方法操作，采用四根不同規(guī)格的色譜柱測(cè)定對(duì)照溶液中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量，為了更好的體現(xiàn)色譜柱的性能比較，本次試驗(yàn)以黃曲霉毒素B1為代表，分別從測(cè)定的含量、理論塔板數(shù)、分離度以及對(duì)稱因子四個(gè)方面對(duì)色譜柱進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 四根不同色譜柱的考察結(jié)果

從表4可知，四根不同的色譜柱均能有效分離與準(zhǔn)確測(cè)定黃曲霉毒素B1。說(shuō)明該方法的色譜柱要求不高，大部分色譜柱均能滿足對(duì)沉香樣品中黃曲霉毒素的測(cè)定。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取精密吸取黃曲霉毒素B1濃度為0.0198μg/mL的對(duì)照溶液25μL注入液相色譜儀，分別在0、8、13、18、25、30小時(shí)測(cè)定其含量，結(jié)果表明，樣品在30h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 方法檢出限 取對(duì)照品溶液(黃曲霉毒素B1濃度為0.00198μg/mL)，采用逐步稀釋法，并將逐步稀釋后的溶液，精密量取25μL注入色譜儀，記錄色譜圖。如圖5所示。

試驗(yàn)以黃曲霉毒素B1的值為基準(zhǔn)，用儀器自帶的計(jì)算軟件，當(dāng)黃曲霉毒素B1信噪比約3.3：1，以此計(jì)算方法檢出限，符合儀器分析中儀器檢測(cè)限的相關(guān)要求。此時(shí)，以黃曲霉毒素B1計(jì)，沉香中黃曲霉毒素的檢測(cè)限約為0.2μg/kg。

2.5 樣品中黃曲霉毒素含量測(cè)定 采用上述方法，分別對(duì)所有69批次的沉香樣品進(jìn)行黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量測(cè)定，結(jié)果均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)沉香樣品被黃曲霉毒素污染。

3 結(jié)論

建立柱后衍生法測(cè)定沉香中黃曲霉毒素的方法，并對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果該表明方法良好。分別對(duì)所獲得的69批沉香樣品進(jìn)行黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量測(cè)定，均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)沉香樣品被黃曲霉毒素污染，說(shuō)明我國(guó)沉香藥材受到黃曲霉毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)較小。

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唐建新，女，漢族，本科，主管藥師，研究方向?yàn)橹兴幇踩浴-mail:wbxu@163.com

梁生旺，男，漢族，本科，教授，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制。

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2017-03-24 編輯：梁志慶)