脂肪干細胞覆膜聚丙烯補片減輕疝修補術后炎癥反應的研究

張方捷 高國棟 葉靜 黃永剛 吳浩 王平

·論著·

脂肪干細胞覆膜聚丙烯補片減輕疝修補術后炎癥反應的研究

張方捷 高國棟 葉靜 黃永剛 吳浩 王平

目的探討脂肪干細胞（ADSCs）覆膜聚丙烯補片對大鼠疝修補術后炎癥反應的影響。方法培養(yǎng)擴增檢測脂肪干細胞并接種到聚丙烯補片上，體外培養(yǎng)10天。成年SD大鼠12只，分為覆膜組6只，未覆膜組6只，分別將ADSCs覆膜聚丙烯補片和聚丙烯補片植入覆膜組和未覆膜組大鼠的腹壁肌肉表面，檢測大鼠術前及術后3、7、14、21、28天血常規(guī)、腫瘤壞死因子-琢（TNF-琢）、白細胞介素-1茁（IL-1茁）水平。結果ADSCs在聚丙烯補片上附著生長良好，免疫熒光檢測顯示干細胞特異性標記CD90表達逸97%。覆膜組在術后14天炎癥反應高峰時期白細胞計數［（10.86±0.56）伊109/L比（11.92±0.56）伊109/L，P<0.05］、TNF-琢［（87.12±12.59）滋g/L比（175.28±34.37）滋g/L，P< 0.01］、IL-1茁［（275.69±54.28）滋g/L比（501.36±98.15）滋g/L，P<0.01］均低于未覆膜組，差異有統(tǒng)計學意義。結論與聚丙烯補片組比較，ADSCs覆膜聚丙烯補片可減輕大鼠疝修補術后全身炎癥反應。

大鼠；疝修補術；炎癥反應；脂肪源干細胞；聚丙烯；補片

用人工合成補片進行疝修補手術是治療各種腹部疝疾病廣泛使用的方法，使術后疝復發(fā)率大大降低。而人工合成補片，尤其是應用最廣泛的聚丙烯補片在使用中仍存在諸如慢性疼痛、局部異物感、腹壁順應性下降等問題，對外科醫(yī)師和患者造成困擾。產生這些問題的一個重要原因是人工合成材料補片使用后宿主組織的（亞）急性炎癥反應導致局部纖維組織明顯增生，造成神經血管壓迫，產生異物感，引起慢性疼痛，并使腹壁順應性下降。我們設想使用脂肪干細胞（adipose-derived sterm cells，ADSCs）覆蓋聚丙烯補片，避免補片與機體的直接接觸，使植入體內的ADSCs在局部微環(huán)境作用下向機體需要的方向分化，以減輕補片植入體內后的炎癥反應和組織纖維化，從而減輕異物感、慢性疼痛，提高腹壁順應性，改善患者術后的生活質量。

1 材料與方法

1.1 材料F1代SD脂肪源干細胞（CELLBIO貨號CBR-130478）購自上海賽齊生物。SPF級SD大鼠，購自浙江省實驗動物中心，6月齡，雄性，體質量，230～250g，合格證書編號0017686，許可證號SCYK（浙）2014-0001。聚丙烯補片購自BARD公司。實驗過程中動物處置符合國家科學技術委員會發(fā)布的關于善待實驗動物的指導性意見規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1 脂肪干細胞的培養(yǎng)和鑒定脂肪干細胞解凍后置于含體積分數10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，接種于25mL培養(yǎng)瓶中，置于37益、0.05%的C02孵箱中，每3天換液1次。待細胞形態(tài)已恢復并貼滿瓶壁，即行傳代。將培養(yǎng)瓶里的培養(yǎng)基倒去，加3～5mL Hanks'液洗滌后棄去。加0.5～1mL 0.25%含EDTA的胰酶消化，消化時間1～3min。輕輕晃動瓶壁，細胞脫落下來后加入3～5mL培養(yǎng)基終止消化。用移液管輕輕吹打瓶壁上的細胞，使之完全脫落，然后將溶液吸入離心管內離心1000rpm/5min。棄上清，1:2傳代。

脂肪干細胞主要從三個方面進行鑒定評估：細胞的形態(tài)：顯微鏡觀察細胞形態(tài)；細胞表面CD90的抗原表達：采用細胞免疫熒光染色法，細胞爬片6 h，4%多聚甲醛固定30min，3%Triton IOOX通透20 min，山羊血清封閉30min，按說明書加入相應比例稀釋的一抗，孵育4益過夜，加入熒光二抗（Alexa Fluor 555）37益孵育1h，DAPI核染10min，熒光顯微鏡下觀察。臺盼藍染色法鑒定細胞活力：取細胞懸液，滴加等量0.4%臺盼藍染液，混勻后吸取部分加入細胞計數板中進行計數。

1.2.2 脂肪干細胞覆膜聚丙烯補片制備將聚丙烯補片剪成5mm伊5mm大小，浸泡75%乙醇中24h，以D-hank's液反復清洗去除乙醇。將培養(yǎng)至第2代的脂肪干細胞消化、重懸后計數為5伊108/L。每塊補片接種100滋L細胞懸液，分別放置于6孔培養(yǎng)板中。4h后加入DMEM-F12培養(yǎng)液8mL，于37益、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換培養(yǎng)液1次，共培養(yǎng)10天。

1.2.3 動物分組、手術及血樣采集成年雄性SD大鼠12只，體質量（250±20）g，隨機分為覆膜補片組（覆膜組）和未覆膜補片組（未覆膜組），每組6只。手術前一天尾靜脈抽取血樣檢查血常規(guī)、腫瘤壞死因子-琢（TNF-琢）、白細胞介素-1茁（IL-1茁）。10%水合氯醛0.3mL/100g麻醉，5萬U/只青霉素鈉肌肉注射預防感染，切開大鼠腹側壁約1cm，分別將覆膜補片及未覆膜補片植入腹壁肌層下方，補片縫合固定，可吸收線縫合切口。術后3、7、14、21、28天抽血檢驗血常規(guī)、TNF-琢、IL-1茁。

1.3 統(tǒng)計學方法應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 脂肪干細胞培養(yǎng)及鑒定ADSCs接種于培養(yǎng)皿24h后細胞形態(tài)開始恢復為梭形及多邊形，傳代后細胞呈長梭形，并形成小集落，呈束狀、菊花狀或旋渦狀排列，生長有方向性。免疫熒光檢測結果顯示，干細胞特異性標記CD90表達逸97%。臺盼藍染色顯示細胞存活良好。

2.2 覆膜聚丙烯補片制備共培養(yǎng)后可見脂肪干細胞附著于聚丙烯補片上生長，編織密集處生長較密集。

2.3 大體觀察聚丙烯補片植入后實驗動物無死亡，未出現侵蝕穿透等表現，傷口愈合均良好。

2.4 兩組大鼠手術前后白細胞數值比較覆膜組和未覆膜組術后均出現白細胞升高，14天時達到最高峰，兩組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），之后數值下降。見表1。

2.5 兩組大鼠手術前后血清TNF-琢和IL-1茁比較術前兩組血清TNF-琢和IL-1茁差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；術后3、7、14、21天，兩組大鼠血清TNF-琢和IL-1茁水平均明顯上升，14天時達到峰值，差異均有統(tǒng)計學意義（P均<0.01）；術后28天，未覆膜組兩項指標仍高于覆膜組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2～3。

3 討論

腹股溝疝是普外科常見病、多發(fā)病，區(qū)域性調查顯示我國腹股溝疝的發(fā)病率為3譯～5譯[1]。腹壁切口疝是腹部手術后常見的并發(fā)癥，發(fā)生率3%～20%[2]。對于腹股溝疝和腹壁切口疝手術在人工合成材料補片出現以前，主要通過單純縫合修補來實現，其復發(fā)率高。目前多應用人工合成材料補片進行修補，從而使術后復發(fā)率大大降低[3]。但人工合成材料補片使用中，尤其是使用最為廣泛的聚丙烯補片使用中存在慢性疼痛、局部異物感明顯、腹壁順應性下降等問題使治療效果并不十分令人滿意，人工合成材料補片使用后宿主組織的(亞)急性炎癥反應是導致上述問題的重要原因[4]。

表1 兩組大鼠手術前后白細胞數值比較（，伊109/L）

表1 兩組大鼠手術前后白細胞數值比較（，伊109/L）

注：與未覆膜組比較，*P<0.05

組別覆膜組未覆膜組鼠數（只）6 6術前7.01±1.22 7.21±1.19 3d 8.35±0.56 9.66±1.70 7d 10.59±0.36 10.87±0.79 14d 10.86±0.56* 11.92±0.56 21d 9.32±0.63 9.55±0.71 28d 8.20±0.54 8.51±0.55

表2 兩組大鼠手術前后血清TNF-琢水平比較（，滋g/L）

表2 兩組大鼠手術前后血清TNF-琢水平比較（，滋g/L）

注：與未覆膜組比較，*P<0.01

組別覆膜組未覆膜組鼠數（只）6 6術前5.23±2.56 5.17±2.87 3d 41.87±8.54 64.21±9.57 7d 50.12±7.85 90.78±75.54 14d 87.12±12.59* 175.28±34.37 21d 51.27±13.51* 91.56±20.41 28d 12.47±5.45 14.49±11.42

表3 兩組大鼠手術前后血清IL-1茁水平比較（，滋g/L）

表3 兩組大鼠手術前后血清IL-1茁水平比較（，滋g/L）

注：與未覆膜組比較，*P<0.01

組別覆膜組未覆膜組鼠數（只）6 6術前9.54±3.57 9.21±2.49 3d 78.29±15.24 159.28±54.38 7d 198.17±24.48 334.35±89.45 14d 275.69±54.28* 501.36±98.15 21d 182.35±49.82* 324.26±33.75 28d 40.73±21.25 51.46±24.25

脂肪組織位于可以較易獲得的結締組織中，與骨髓一樣來源于間充質。Zuk等[5]于2001年首先發(fā)現脂肪干細胞（ADSCs）在適當的誘導條件下能向脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、肌肉細胞及神經組織定向分化。2009年美國斯坦福大學醫(yī)學院的研究人員發(fā)現抽出的人體脂肪是培養(yǎng)干細胞的最佳“溫室”。在脂肪干細胞內，有兩種轉錄因子的表達水平高于皮膚成纖維細胞，表明在初始狀態(tài)下，脂肪干細胞更容易被誘導為誘導多能干細胞，并且利用脂肪干細胞培養(yǎng)誘導多能干細胞不需要飼養(yǎng)細胞，這無疑提高了其安全性[6]。脂肪干細胞還可以分泌血管內皮細胞生長因子，促進血管生成[7]。脂肪干細胞來源充分，可以反復取材，無免疫排斥，不涉及醫(yī)學倫理學問題，細胞增殖快速，取材簡便，分離容易，避免抽取骨髓，損傷較小，患者易于接受。Altman等[8]發(fā)現，植入體內ADSCs在局部微環(huán)境作用下可以同時向成纖維細胞、鱗狀上皮細胞及血管內皮細胞方向分化。另一方面，ADSCs具有旁分泌的功能，可以分泌多種膠原、纖維連接蛋白及生長因子，能間接促進組織的愈合[9]。本實驗結果表明，ADSCs提取培養(yǎng)簡單方便，細胞活力好，細胞CD90表達高達97%以上，ADSCs也可在聚丙烯材料補片上良好生長。

聚丙烯等人工合成材料植入體內后引發(fā)的炎癥反應可以引起局部組織腫脹壞死，并導致明顯的纖維化，使網片皺縮變形，局部組織硬度增加，順應性下降[10]，使患者出現疼痛、異物感，并容易出現復發(fā)及感染等。本研究中覆膜組和未覆膜組術前白細胞、TNF-琢和IL-1茁均無顯著性差異，在術后3、7、14、21、28天時未覆膜組三項指標均高于覆膜組，其中14天時兩組白細胞數值有顯著差異，3、7、14、21天時血清TNF-琢和IL-1茁水平顯著性差異與表不符。綜合各項指標，相較聚丙烯補片，植入ADSCs覆膜聚丙烯補片大鼠疝修補術后全身炎癥反應可減輕，達到更好的治療效果。

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（收稿：2016-10-08修回：2016-10-27）

Effect of Adipose-derived Stem Cells Coated Polypropylene Patch on the Inflammation after Herniorrhaphy

ZHANG Fangjie,GAO Guodong,YE Jing,HUANG Yonggang,WU Hao,WANG Ping.Department of Hernia& Abdominal Wall Surgery,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou(310000),China

Objective To investigate the effect of adipose-derived stem cells（ADSCs）coated polypropylene patch（PP）on relieving the inflammation after herniorrhaphy.M ethods The ADSCs were seeded into polypropylene mesh and in vitro cultured for 10 d.Twelve SD rats were random ly divided into control group and experimental group, with 6 rats in each group.PP coated with ADSCs and PP were implanted into the abdominal wall muscles of ex原perimental group and control group,respectively.The blood samples were collected before and 3,7,14,21 and 28d after operation to measure white blood cell（WBC）count,TNF-琢and IL-1茁.Results ADSCs grew well on the polypropylene patch,and the CD90 expression was more than 97%by immunofluorescence.In the peak period of in原flammatory reaction on Day 14,the WBC count[（10.86±0.56）伊109/L vs（11.92±0.56）伊109/L,P<0.05],TNF-琢（87.12±12.59滋g/L vs 175.28±34.37滋g/L,P<0.01）,IL-1茁（275.69±54.28滋g/L vs 501.36±98.15滋g/L,P<0.01）in experimental group were lower than those of control group.Conclusion Polypropylene patch coated with ADSCs can effecti-vely reduce the systemic inflammatory response after herniorrhephy in rats.

rats;herniorrhaphy;inflammatory response;adipose-derived stem cells;polypropylene;patch

杭州市醫(yī)療衛(wèi)生及重點?？茖２】蒲泄リP專項基金項目資助（No.20130633B03）

杭州市第一人民醫(yī)院疝和腹壁外科（杭州310000）

高國棟，E-mail：flyht66@sina.com