穿山龍多糖影響NADPH氧化酶/ROS信號通路抗H2O2誘導(dǎo)的HUVECs細胞損傷作用研究

張曉雪，孫慧君，李士軍，王長遠，單新輝，周曉琳，金 越

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 藥理教研室，遼寧 大連 116044；2.大連醫(yī)科大學(xué) 臨床藥理教研室，遼寧 大連 116044；3.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗科，遼寧 大連 116011；4.大連市結(jié)核病醫(yī)院 藥劑科，遼寧 大連 116034；5.大連市甘井子區(qū)衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧 大連 116034)

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論 著

穿山龍多糖影響NADPH氧化酶/ROS信號通路抗H2O2誘導(dǎo)的HUVECs細胞損傷作用研究

張曉雪1，孫慧君2，李士軍3，王長遠2，單新輝4，周曉琳5，金 越1

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 藥理教研室，遼寧 大連 116044；2.大連醫(yī)科大學(xué) 臨床藥理教研室，遼寧 大連 116044；3.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗科，遼寧 大連 116011；4.大連市結(jié)核病醫(yī)院 藥劑科，遼寧 大連 116034；5.大連市甘井子區(qū)衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧 大連 116034)

目的 檢測穿山龍多糖(RDNP)是否可以通過影響NADPH氧化酶/ROS信號通路對H2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)氧化損傷產(chǎn)生保護作用。方法 H2O2作用HUVECs 4 h造成損傷，分別給予25、50、100、200、400、800 μg/mL RDNP進行干預(yù)，選取適當濃度進行后續(xù)實驗。采用MTT法測定細胞活力；試劑盒檢測 LDH、MDA、SOD、T-AOC、GSH-Px、ROS水平；Western Bolt及 qRT-PCR法檢測Nox4、p22phox的蛋白及mRNA表達。結(jié)果 加入50、100和200 μg/mL濃度的RDNP與H2O2模型組間相比，活力增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。因此選擇50、100、200 μg/mL RDNP劑量組進行實驗。不同濃度RDNP均可以顯著改善H2O2損傷，使細胞形態(tài)逐漸趨于正常，以200 μg/mL RDNP給藥組的效果最為顯著。RDNP可以降低H2O2損傷HUVECs模型中LDH、MDA及ROS的水平，并增強細胞內(nèi)SOD、 GSH-Px、T-AOC活力；且從mRNA水平及蛋白水平抑制Nox4、p22phox的表達。結(jié)論 RDNP可以通過干擾NADPH氧化酶/ROS信號通路抑制H2O2造成的HUVECs氧化損傷，保護內(nèi)皮細胞。

穿山龍多糖；Nox4；ROS；p22phox；動脈粥樣硬化

近年來，越來越多的研究證實，從早期炎癥細胞遷移到血管壁脂肪紋的形成、晚期血管細胞活化以及更復(fù)雜的病變發(fā)展，動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展，均與血管內(nèi)皮發(fā)生氧化應(yīng)激密切相關(guān)[1]。中藥多糖可以通過降低炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)及血清脂質(zhì)水平抗動脈粥樣硬化，且具有副作用小的特點[2-3]。穿山龍(Rhizoma Dioscoreae Nipponicae)是一類傳統(tǒng)的中藥[3]。有研究表明，穿山龍多糖(Rhizoma Dioscoreae Nipponicae polysaccharides，RDNP)可以降低大鼠血糖、中性脂質(zhì)和總膽固醇水平，清除羥基自由基[4]，其可能具有抗氧化損傷及防治動脈粥樣硬化的作用。但對于RDNP抗氧化應(yīng)激作用機制的文獻報道比較少。因此，本實驗旨在研究穿山龍多糖(RDNP)是否可以通過影響NADPH氧化酶/ROS信號通路對H2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)氧化損傷產(chǎn)生保護作用，為穿山龍多糖作為抗動脈粥樣硬化的新藥開發(fā)提供理論基礎(chǔ)及依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和抗體

穿山龍購自千草園醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司，RDNP由水提醇沉法粗提取，Sevag法和木瓜蛋白酶法去除蛋白，用DEAE-52纖維柱及Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱層析法進行進一步純化，苯酚-硫酸法檢測穿山龍多糖粗提物中的糖成分，最后用高效液相色譜法鑒定穿山龍多糖的純度，本實驗使用的RDNP經(jīng)鑒定純度在95%以上。

DMEM購自Gibco-BRL公司；Nox4抗體購自Proteintech生物技術(shù)公司；p22phox、GAPDH抗體購自Santa Cruz生物技術(shù)公司；活性氧測試試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液， 37 ℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.3 MTT測定細胞存活率

將HUVECs細胞按每孔1×105的密度接種于96孔板中培養(yǎng)，過夜，分別給予0(空白對照組)、25、50、100、200、400、800 μg/mL RDNP，培養(yǎng)12 h后，每孔中加入10 μL MTT(5 mg/mL)溶液，培養(yǎng)板于37 ℃孵育4 h。棄上清液，每孔加入100 μL DMSO溶解結(jié)晶，最后用全自動酶標儀于波長490 nm處測定吸光度值。每組設(shè)定6個平行孔，細胞存活率按公式計算：細胞存活率(%)=實驗組(OD)/空白組(OD)×100%。根據(jù)實驗結(jié)果，選取25、50、100、200μg/mLRDNP及50 μg/mL維生素C(VC)，培養(yǎng)12 h后，加入500 μmol/L H2O2繼續(xù)培養(yǎng)4 h。MTT法檢測細胞活力及細胞存活率，計算方法同上。

1.4 光學(xué)顯微鏡觀察

HUVECs細胞按每孔2×105的密度接種于6孔板中培養(yǎng)12 h，分別給予50、100、200 μg/mL RDNP和50 μg/mL維生素C(VC)，12 h后，加入500 μmol/L H2O2孵育4 h，用OLYMPUS CKX41 倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。

1.5 MDA、LDH、SOD、T-AOC及GSH-Px水平檢測

細胞鋪板及給藥同上，造模結(jié)束后按試劑盒說明測定MDA、LDH、SOD、T-AOC及GSH-Px水平。

1.6 ROS水平測定

細胞造模及給藥同上，結(jié)束后，細胞用胰蛋白酶處理，PBS清洗后，加入10 mmol/L DCFH-DA于37 ℃孵育30 min。PBS清洗2次后，用BD FACSCalibur流式細胞儀進行分析。

1.7 免疫印跡

將HUVECs細胞漿與細胞核進行分離，具體操作方法按照核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒(南京凱基生物技術(shù)有限公司)說明書進行操作。用10%、12%及15% SDS-PAGE凝膠進行電泳。

1.8 RNA提取和qRT-PCR

用RNAiso plus(大連寶生物工程有限公司)提取總RNA，使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(大連寶生物工程有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行擴增與檢測，每個樣品設(shè)3個平行復(fù)孔，β-Actin作為內(nèi)參基因，用2-△△ct的方法求得各個目的基因的相對含量。

所用引物的序列如下：

Nox4： 正向引物 5'-GCTGCATCAGTCTTAACCGAAC-3'；反向引物5'-GGCTCTTCCATACAAATCTTCAA-3'；

p22phox：正向引物5'-CAGTGGTACTTTGGTGCCTACTCC-3'；反向引物5'-GGTGGAGCCCTTCTTCCTCT-3'；

β-actin： 正向引物：5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'；反向引物：5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0 軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均用Tukey檢驗法進行單向方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法確定RDNP的作用濃度

如圖1所示，400及800 μg/mL RDNP與細胞共培養(yǎng)12 h，發(fā)現(xiàn)細胞活力有所下降，考慮為藥物濃度過大所致，因此設(shè)定RDNP給藥組的最大濃度為200 μg/mL。如圖2所示，用500 μmol/L H2O2處理后，HUVECs細胞活力顯著下降，同時加入50、100和200 μg/mL濃度的RDNP與H2O2模型組間相比，活力增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。但25 μg/mL劑量組與H2O2模型組間無明顯差異。因此我們選擇50、100、200 μg/mL RDNP劑量組進行實驗。

A:空白對照組；B:25 μg/mL RDNP組；C:50 μg/mL RDNP組；D:100 μg/mL RDNP組；E:200 μg/mL RDNP組；F:400 μg/mL RDNP組; G:800 μg/mL RDNP組。## 與空白對照組比較，P<0.01圖1 MTT法測定細胞存活率Fig 1 Cell viability of HUVECs detected by MTT

A:空白對照組；B：500 μmol/L H2O2組；C：25 μg/mL RDNP組；D:50 μg/mL RDNP組；E:100 μg/mL RDNP組；F:200 μg/mL RDNP組；G:50 μg/mL VC組。**P< 0.01 vs.空白對照組，#P< 0.05 vs. H2O2組，##P < 0.01 vs. H2O2組圖2 MTT法測定細胞存活率Fig 2 Cell viability of HUVECs detected by MTT

2.2 RDNP對H2O2誘導(dǎo)HUVECs細胞損傷形態(tài)學(xué)變化的保護作用

在光學(xué)顯微鏡下，用400×放大倍數(shù)，觀察HUVECs細胞的形態(tài)學(xué)變化。正常組細胞呈多邊形，可見典型的鵝卵石樣外觀，細胞與培養(yǎng)板之間及各個細胞間連接緊密，細胞界限清晰(圖3A)。而H2O2損傷模型組細胞表現(xiàn)出異常的形態(tài)變化，包括細胞變圓、腫脹，部分細胞從板底脫落等(圖3B)。而不同濃度RDNP及VC給藥組均可以顯著改善其損傷，使細胞形態(tài)逐漸趨于正常，以200 μg/mL RDNP給藥組的效果最為顯著，可見大面積正常細胞，僅有少數(shù)幾個細胞狀態(tài)異常。

2.3 RDNP對H2O2損傷HUVECs細胞LDH、MDA水平及SOD、T-AOC及GSH-Px水平的影響

H2O2處理過4 h的HUVECs細胞中，MDA和LDH含量顯著增加(圖4A，B)，SOD、T-AOC及GSH-Px活性顯著降低(圖4C-E)。給予RDNP治療后，可以劑量依賴性降低受損細胞中LDH和MDA含量，升高細胞中SOD、T-AOC及GSH-Px水平。

2.4 RDNP對H2O2損傷HUVECs細胞中ROS生成的影響

H2O2誘導(dǎo)2 h后，ROS含量(561.35±11.40)與空白對照組(272.17±15.79)相比顯著升高(圖5C，B)。低中高劑量組RDNP可以劑量依賴性的降低ROS水平(熒光強度均值分別為523.99±7.41，505.85±18.08，386.70±22.98)(圖5D-F)。VC給藥組的平均熒光強度為310.89±31.53(圖5G)。

2.5 RDNP對H2O2誘導(dǎo)HUVECs細胞損傷模型中Nox4與p22phox過表達的影響

在H2O2模型組中，Nox4與p22phox的mRNA表達量均顯著增加。200 μg/mL RDNP給藥組Nox4與p22phox mRNA過表達均被顯著抑制(圖6A、B)。蛋白的表達水平變化也與mRNA表達結(jié)果相一致。H2O2模型組中Nox4與p22phox蛋白表達量高于空白對照組2倍，而RDNP給藥組呈劑量依賴性的降低Nox4與p22phox蛋白表達(圖6C、D)。

3 討 論

氧化應(yīng)激是指機體或細胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與消除失衡，或外源性氧化物質(zhì)的過量攝入，導(dǎo)致ROS在體內(nèi)或細胞內(nèi)蓄積而引起的細胞毒性過程[5]。近年來的大量研究揭示，氧化應(yīng)激在AS性疾病的發(fā)生、發(fā)展，到最終臨床事件的全過程中，都扮演著重要角色[6]。

A：空白對照組；B：H2O2組；C：50 μg/mL RDNP組；D：100 μg/mL RDNP組；E：200 μg/mL RDNP組；F：50 μg/mL VC組圖3 RDNP對H2O2誘導(dǎo)HUVECs細胞損傷形態(tài)學(xué)變化的保護作用Fig 3 Effect of RDNP on inhibiting the morphology changes induced by H2O2 in HUVECs(×400)

A：MDA含量；B：LDH含量；C：SOD活性；D：T-AOC活性；E：GSH-Px活性；**P< 0.01 vs.空白對照組，#P< 0.05 vs. H2O2組，##P< 0.01 vs. H2O2組圖4 RDNP對H2O2損傷HUVECs細胞MDA、LDH水平及細胞內(nèi)SOD、GSH-Px、T-AOC活性的影響Fig 4 Effect of RDNP on MDA, LDH levels and intracellular SOD, GSH-Px, T-AOC activities induced by H2O2 in HUVECs

穿山龍為活血舒筋、祛風止痛的常用藥[7]。近年來，穿山龍里面的有效成分之一薯蕷皂苷一直是研究的熱點，而在提取薯蕷皂苷的過程中，多糖是作為雜質(zhì)成分被摒棄掉的。可能是由于這個原因，目前國內(nèi)外關(guān)于穿山龍多糖的研究比較少見。我們利用H2O2造成HUVECs損傷模型，產(chǎn)生細胞氧化應(yīng)激循環(huán)及模擬血管中發(fā)生的ROS損傷血管內(nèi)皮細胞所啟動的AS反應(yīng)。結(jié)果顯示，在RDNP給藥組中，SOD、GSH-Px和T-AOC水平增高，MDA和LDH水平降低，說明RDNP通過保護重要的抗氧化酶體系，來減少細胞損傷，從而達到增強HUVECs細胞抗自由基活性的作用。

A：陰性對照組；B：空白對照組；C：H2O2組；D：50 μg/mL RDNP組；E：100 μg/mL RDNP組；F：200 μg/mL RDNP組；G：50 μg/mL VC組；H：各組ROS水平。**P< 0.01 vs.空白對照組；#P< 0.05 vs. H2O2組；##P< 0.01 vs. H2O2組圖5 RDNP對HUVECs細胞中ROS的影響Fig 5 Effect of RDNP on ROS generation induced by H2O2 in HUVECs

A：p22phox mRNA表達；B：Nox4 mRNA表達；C：p22phox蛋白表達；D：Nox4蛋白表達；**P< 0.01 vs.空白對照組，#P<0.05 vs. H2O2組，## P< 0.01 vs. H2O2組圖6 RDNP對H2O2損傷HUVECs細胞中Nox4與p22phox表達的影響Fig 6 Effect of RDNP on Nox4 and p22phox expressions induced by H2O2 in HUVECs

NADPH氧化酶目前被認為是血管內(nèi)生成ROS的主要酶復(fù)合體，其催化亞基Nox1-5，DUOX1 和DUOX2 被稱為Nox 家族[8]。Nox 家族蛋白主要的生物學(xué)功能是產(chǎn)生ROS，維持細胞的正常生理活動[9]，但在異常狀態(tài)下，Nox蛋白過表達則可以產(chǎn)生大量的ROS，促進動脈粥樣硬化發(fā)生。Nox4是NOX中唯一在血管細胞中有高表達且可以促進生成H2O2的一個亞型，在HUVECs細胞中， Nox4是ROS的主要來源[10]。p22phox是NADPH氧化酶中一個重要的組成成分，有活化NADPH氧化酶的作用[11]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在有AS 病灶的冠脈，p22phox 呈強表達[12]，在我們的實驗中，發(fā)現(xiàn)RDNP可以顯著降低HUVECs細胞中ROS水平，說明RDNP可能通過抑制NADPH氧化酶的活性發(fā)揮抗氧化作用。而RDNP給藥組與H2O2損傷組相比，細胞中Nox4和p22phox mRNA水平及蛋白水平呈現(xiàn)出劑量依賴性的降低，證實了我們的推斷。說明RDNP可以影響NADPH氧化酶對H2O2損傷的HUVECs細胞產(chǎn)生保護作用。

我們的研究可為RDNP作為抗動脈粥樣硬化的新藥開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。由于多糖成分復(fù)雜，已有大量實驗證實植物多糖除了具有抗氧化作用之外，還可通過抗炎、降脂等方向改善血管功能，防治AS的發(fā)生及發(fā)展。因此，我們推測RDNP可能通過影響NADPH氧化酶/ROS信號通路進而調(diào)控炎癥信號通路、脂肪代謝信號通路、凋亡信號通路等多條通路抗AS，其具體機制仍需進一步的研究和探討。

[1] Galkina E, Ley K. Immune and Inflammatory Mechanisms of Atherosclerosis[J]. Ann Rev Immunol, 2009, 27(1): 165-197.

[2] Park CM, Youn HJ, Chang HK, et al. TOP1 and 2, polysaccharides from Taraxacum officinale, attenuate CCl(4)-induced hepatic damage through the modulation of NF-kappaB and its regulatory mediators[J]. Food Chem Toxicol, 2010, 48(5): 1255-1261.

[3] 何菊香, 張永, 李言, 等. 川芎嗪對脂多糖誘導(dǎo)的血管通透性增加的保護作用[J]. 實用醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 32(12): 1920-1923.

[4] Jeon JR, Lee JS, Lee CH, et al. Effect of ethanol extract of dried Chinese yam (Dioscorea batatas) flour containing dioscin on gastrointestinal function in rat model[J]. Arch Pharm Res, 2006, 29(5): 348-353.

[5] 趙雅淇, 趙建美. 氧化應(yīng)激、自噬與非霍奇金淋巴瘤的研究進展[J]. 實用醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 32(17):2930-2932.

[6] Xia F, Wang C, Jin Y, et al. Luteolin protects HUVECs from TNF-α-induced oxidative stress and inflammation via its effects on the Nox4/ROS-NF-κB and MAPK pathways[J]. J Atheroscler Thromb, 2014, 21(8): 768-783.

[7] 王寶慶, 李學(xué)彬, 田志發(fā), 等. 穿山龍現(xiàn)代研究概況[J]. 中國林副特產(chǎn), 2010(5): 96-97.

[8] Katsuyama M, Matsuno K, Yabe-Nishimura C. Physiological roles of NOX/NADPH oxidase, thesuperoxide-generating enzyme[J]. J Clin Biochem Nutr, 2012, 50(1): 9-22.

[9] Lambeth JD. Nox enzymes, ROS, and chronic disease: an example of antagonistic pleiotropy[J]. Free Radic Biol Med, 2007, 43(3): 332-347.

[10] Konior A, Schramm A, Czesnikiewicz-Guzik M, et al. NADPH oxidases in vascular pathology[J].Antioxid Redox Signal, 2014, 20(17): 2794-2814.

[11] Schramm A, Matusik P, Osmenda G, et al. Targeting NADPH oxidases in vascular pharmacology[J].Vascul Pharmacol, 2012, 56(5-6): 216-231.

[12] Nowak T, Niemiec P, Zak I. The p22phox protein and the CYBA gene. Their function and associations with atherosclerosis-related diseases[J]. Wiad Lek, 2013, 66(1): 10-17.

醫(yī)學(xué)術(shù)語使用規(guī)范

醫(yī)學(xué)術(shù)語應(yīng)全文統(tǒng)一，不要一義多詞或一詞多義。婦產(chǎn)科學(xué)、耳鼻咽喉科學(xué)、血液病學(xué)、呼吸病學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、眼科學(xué)和外科學(xué)的名詞已由醫(yī)學(xué)名詞審定委員會審定公布，應(yīng)嚴格執(zhí)行。其他尚未審定者，目前以下列兩個主題詞索引為準：(1)《醫(yī)學(xué)主題詞注釋字順表(1992年版)中文索引》(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)信息研究所，1992)；(2)《中醫(yī)藥主題詞表》(中國中醫(yī)研究院圖書情報研究所，1987)。在這兩個主題詞表中找不到者，則以人民衛(wèi)生出版社出版的《英漢醫(yī)學(xué)詞匯》、化學(xué)工業(yè)出版社出版的《藥名詞匯》和科學(xué)出版社出版的各學(xué)科名詞審定本為準。國內(nèi)尚無統(tǒng)一譯名的，參考以上詞典慎重擬定，并在譯名后加括號標注外文；在醫(yī)學(xué)名詞審定委員會正式公布后，應(yīng)立即嚴格遵照執(zhí)行。中文藥物名稱應(yīng)使用其化學(xué)名，不用商品名。

Rhizoma Dioscoreae Nipponicae polysaccharides protective effect onH2O2-induced HUVECs injury model by interfering NADPH oxidase/ROS pathway

ZHANG Xiaoxue1, SUN Huijun2, LI Shijun3, WANG Changyuan2, SHAN Xinhui4, ZHOU Xiaolin5, JIN Yue1

(1.DepartmentofPharmacology,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China; 2.DepartmentofClinicalPharmacology,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China; 3.DepartmentofClinicalLaborator,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China; 4.DepartmentofPharmacy,DalianMunicipalTuberculosisHospital,Dalian116034,China; 5.InstituteofHealthInspection,GanjingziDistrictofDalian,Dalian116034,China)

Objective To investigate effect of Rhizoma Dioscoreae Nipponicae polysaccharides (RDNP) on protecting HUVECs from H2O2-induced injury by interfering NADPH oxidase/ROS pathway. Methods HUVECs were treated with RDNP in the presence/absence of H2O2for 4 h. Then cell activity was detected by MTT method. LDH, MDA, SOD, T-AOC, GSH-Px and ROS were detected by reagent kits to evaluate the cell injuries and the antioxidant activity. Western blot and qRT-PCR was used to evaluate the protein expression and the mRNA expression of Nox4, p22phox. Results LDH, MDA, ROS levels decreased and intracellular SOD, T-AOC as well as GSH-Px activities enhanced in H2O2-treated HUVECs when RDNP was used, especially with 200 μg/mL. Simultaneously, Nox4, p22phox expression were both decreased in protein and mRNA levels in HUVECs. Conclusions RDNP could protect HUVECs from H2O2-induced injury by interfering NADPH oxidase/ROS pathway.

Rhizoma Dioscoreae Nipponicae polysaccharides (RDNP); Nox4; ROS; p22phox; atherosclerosis

國家自然科學(xué)基金項目(81273508)；遼寧省教育廳基金項目(L2011153)

張曉雪(1990-)，女，碩士研究生。E-mail：m15040555883@163.com

金 越，副教授。E-mail：rutin@sina.com

10.11724/jdmu.2017.03.02

R966

A

1671-7295(2017)03-0214-06

張曉雪，孫慧君，李士軍，等.穿山龍多糖影響NADPH氧化酶/ROS信號通路抗H2O2誘導(dǎo)的HUVECs細胞損傷作用研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2017,39(3)：214-219.

2016-12-26；

2017-03-22)