心肌聲學(xué)造影評價(jià)胰島素不同干預(yù)時(shí)間點(diǎn)對糖尿病大鼠心肌灌注的影響

張 展

張 軍2ZHANG Jun

劉 芳1LIU Fang

拓勝軍2TA Shengjun

岳瑾琢1YUE Jinzhuo

賀建國2HE Jianguo

心肌聲學(xué)造影評價(jià)胰島素不同干預(yù)時(shí)間點(diǎn)對糖尿病大鼠心肌灌注的影響

張 展1ZHANG Zhan

張 軍2ZHANG Jun

劉 芳1LIU Fang

拓勝軍2TA Shengjun

岳瑾琢1YUE Jinzhuo

賀建國2HE Jianguo

中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志

2017年 第25卷 第6期：405-408，413

Chinese Journal of Medical Imaging 2017 Volume 25 (6): 405-408, 413

目的應(yīng)用心肌聲學(xué)造影（MCE）技術(shù)評價(jià)胰島素不同時(shí)間點(diǎn)干預(yù)糖尿病大鼠心肌微循環(huán)灌注的差異，探討MCE在糖尿病心肌?。―CM）療效評價(jià)中的價(jià)值。材料與方法將90只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組（NC）、糖尿病組（DM）和胰島素干預(yù)組（INS），每組30只。成功制備糖尿病模型后，INS組隨機(jī)分A、B、C 3個亞組，分別于成模0、4、8周后開始胰島素干預(yù)，均連續(xù)給藥12周；NC和DM組也隨機(jī)分為3個亞組，與INS組各亞組同步飼養(yǎng)，不予干預(yù)。于成模后12、16、20周末對各亞組大鼠開胸行MCE檢查，分析心肌血容量（A）、血流速度（β）和血流量（A×β）的變化，并取心肌組織行病理學(xué)檢查。結(jié)果與DM組比較，INS組A、β和A×β均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與NC組比較，INS組A亞組A×β減低，B亞組A、A×β減低，C亞組A、β、A×β均減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；INS組各亞組間比較，A、B亞組間各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；C亞組A、A×β低于A亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。病理結(jié)果顯示，INS組毛細(xì)血管基底膜厚度較DM組改善；毛細(xì)血管密度INS各亞組均較DM組增加，僅A亞組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論胰島素早期干預(yù)可改善心肌微血管結(jié)構(gòu)，增加心肌血流量。MCE可敏感、準(zhǔn)確地對DCM大鼠的心肌微循環(huán)進(jìn)行評價(jià)，可作為DCM早期診斷和動態(tài)療效監(jiān)測的重要方法，具有重要的臨床指導(dǎo)意義。

糖尿病并發(fā)癥；心肌疾??；胰島素；超聲心動描記術(shù)；造影劑；心肌再灌注；微循環(huán)；疾病模型，動物；大鼠，Sprague-Dawley

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）患者存在病程及病情不一，治療時(shí)間、方法及依從性不一等客觀條件限制，且難以在各個治療階段獲取心肌組織進(jìn)行組織和細(xì)胞水平檢測驗(yàn)證，無法對糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）療效進(jìn)行客觀評價(jià)。本實(shí)驗(yàn)選取成熟的DM大鼠模型，使用心肌保護(hù)作用確定的胰島素在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行療程相同的干預(yù)[1-4]；并應(yīng)用心肌聲學(xué)造影（myocardial contrast echocardio-graphy，MCE）技術(shù)對心肌微循環(huán)灌注改變作出定量評價(jià)，以電鏡和免疫組化結(jié)果作為印證，為DCM的療效評估提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 SD雄性大鼠90只，體重220～300 g，平均（260.1±24.3）g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供[SCXK（軍）2012-0007]。按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組（NC）、糖尿病組（DM）和胰島素干預(yù)組（INS），每組30只。單次腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）溶液65 mg/kg制作DM模型，第5、7天采尾靜脈血，血糖濃度＞16.7 mmol/L，且具有明顯“三多一少”癥狀為模型制備成功，NC組注射等量緩沖液。模型建成后，INS組再隨機(jī)分A、B、C 3個亞組，分別在成模0、4、8周后開始皮下注射精蛋白生物合成人胰島素（諾和靈?N）6 U/kg，1次/d，均連續(xù)給藥12周。NC、DM組也隨機(jī)分為A、B、C 3個亞組，并與INS各亞組同步飼養(yǎng)，不給予干預(yù)。A、B、C亞組大鼠分別在成模12、16、20周末檢測各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2 儀器與方法 使用Acuson Sequoia 512超聲診斷儀，15L8-S線陣探頭，頻率8～14 MHz。 麻醉大鼠，頸靜脈插管、接呼吸機(jī)和心電圖。開胸取左心室乳頭肌短軸切面，MCE二維-造影雙幅模式，經(jīng)優(yōu)化后增益設(shè)置在實(shí)驗(yàn)中保持不變。以0.9 ml/（kg·min）連續(xù)輸注SonoVue造影劑（Bracco公司），當(dāng)充盈穩(wěn)定后觸發(fā)瞬時(shí)高能脈沖破壞心肌內(nèi)微泡，獲得再灌注實(shí)時(shí)成像，存儲250幀[3]。應(yīng)用Syngo?US Workplace軟件脫機(jī)分析，勾畫心肌內(nèi)感興趣區(qū)，得到聲學(xué)強(qiáng)度-時(shí)間曲線y=A×（1－e－βt）。A代表心肌血容量；β代表血流速度；A×β值代表心肌血流量（圖1）。分析3次取平均值，擬合度＜0.9棄用。

圖1 大鼠MCE圖像分析。A. MCE二維-造影雙幅模式；B. Syngo US Workplace分析界面；C. 聲學(xué)強(qiáng)度-時(shí)間曲線

1.3 病理檢查 實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死動物后，左心室心肌固定部位取材，10%甲醛固定，石蠟包埋切片行CD31免疫組化染色。隨機(jī)選取10個（×400）高倍鏡視野計(jì)數(shù)，取平均值作為毛細(xì)血管密度；另取4塊1 mm×1 mm×4 mm組織，多聚甲醛-戊二醛固定，透射電鏡觀察毛細(xì)血管超微結(jié)構(gòu)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件，計(jì)量資料以±s表示，檢驗(yàn)正態(tài)分布和方差齊性后，各組間參數(shù)比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)中2只造模失敗剔除（空腹血糖未升高），DM組B亞組死亡2只、C亞組死亡3只。余均無死亡。

2.2 一般指標(biāo)比較 與NC組比較，INS組、DM組各亞組血糖增高，體重減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與DM組比較，INS組各亞組血糖減低，體重增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；INS組各亞組間比較，血糖、體重差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 大鼠MCE指標(biāo)比較 與NC組比較，DM各亞組A、β和A×β均減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；INS組A亞組A×β減低，B亞組A、A×β減低，C亞組各指標(biāo)均減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與DM組比較，INS組各亞組A、β和A×β均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。INS各亞組間比較，A、B亞組間各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；C亞組A、A×β低于A亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。2.4 大鼠毛細(xì)血管密度比較 與NC組比較，DM組、INS組毛細(xì)血管密度均減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與DM組比較，INS組A亞組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B、C亞組亦有增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。INS各亞組間比較，B、C亞組均低于A亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表1 各組大鼠一般指標(biāo)比較（±s）

表1 各組大鼠一般指標(biāo)比較（±s）

分組 血糖（mmol/L） 體重（g）NC組A亞組（n=10） 6.48±0.79 580.62±46.54 B亞組（n=10） 6.01±0.58 606.15±40.62 C亞組（n=10） 5.66±0.46 628.96±41.25 DM組A亞組（n=9） 31.03±4.24* 382.13±34.22*B亞組（n=7） 32.35±1.49* 332.56±38.44*C亞組（n=7） 31.75±2.15* 301.25±33.64*INS組A亞組（n=10） 17.11±5.62*# 495.65±37.75*#B亞組（n=10） 19.18±2.68*# 521.28±48.53*#C亞組（n=10） 20.45±4.46*# 533.52±45.54*#注：與NC組比較，*P＜0.05；與DM組比較，#P＜0.05

表2 各組大鼠MCE指標(biāo)比較（±s）

表2 各組大鼠MCE指標(biāo)比較（±s）

注：與NC組比較，*P＜0.05；與DM組比較，#P＜0.05；與INS組A亞組比較，△P＜0.05

分組 A（dB） β（/s） A×β（dB/s）NC組A亞組（n=10）21.17±1.95 1.07±0.14 23.37±2.13 B 亞組（n=10）21.06±2.14 1.06±0.13 23.25±2.27 C 亞組（n=10）22.25±2.10 1.07±0.15 25.42±2.10 DM組A亞組（n=9）14.32±1.53* 0.94±0.09* 12.53±1.55*B亞組（n=7）12.16±1.27* 0.90±0.10* 11.61±1.34*C亞組（n=7）10.25±1.76* 0.78±0.14* 9.15±1.45*INS組A亞組（n=10）19.67±1.68# 1.04±0.15# 20.90±2.52*#B 亞組（n=10）19.16±1.48*# 1.03±0.12# 19.69±1.48*#C 亞組（n=10）16.65±1.94*#△ 1.01±0.17*#17.94±2.18*#△

表3 各組大鼠毛細(xì)血管密度比較（±s）

表3 各組大鼠毛細(xì)血管密度比較（±s）

注：與NC組比較，*P＜0.05；與DM組比較，#P＜0.05；與INS組A亞組比較，△P＜0.05

分組 毛細(xì)血管密度（個/mm2）NC組A亞組（n=10） 2130.0±260.2 B亞組（n=10） 2259.6±244.0 C亞組（n=10） 2127.6±198.1 DM組A亞組（n=9） 1246.0±155.5*B亞組（n=7） 1114.3±284.7*C亞組（n=7） 991.1±89.0*INS組A亞組（n=10） 1465.6±214.3*#B 亞組（n=10） 1118.5±140.4*△C 亞組（n=10） 1097.2±126.6*△

2.5 大鼠毛細(xì)血管超微結(jié)構(gòu)比較 透射電鏡下NC組毛細(xì)血管基底膜薄而光滑，內(nèi)皮無腫脹；DM組血管基底膜明顯增厚，C亞組為著；INS組A、B亞組基底膜不厚，內(nèi)皮細(xì)胞局部指狀突向腔內(nèi)，C亞組基底膜較DM組明顯改善，較NC組稍厚，內(nèi)皮細(xì)胞多發(fā)突向管腔。見圖2。

3 討論

DCM是在DM心肌代謝紊亂和微血管病變的基礎(chǔ)上出現(xiàn)心肌細(xì)胞廣泛灶性壞死，進(jìn)而導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變的疾病狀態(tài)[5]。微血管病變在DCM的發(fā)生及發(fā)展中起重要作用[6-7]；由此提示針對微血管病變的檢測和療效評價(jià)可作為DCM診療新思路。常規(guī)超聲僅能反映心肌力學(xué)改變，無法評價(jià)微循環(huán)灌注，心肌核素掃描、心臟MRI可用于評價(jià)心肌微循環(huán)，但無法動態(tài)觀察和對心肌血流量做定量分析[8]。因此，探尋一種敏感、準(zhǔn)確的心肌灌注評價(jià)方法以指導(dǎo)DCM早期干預(yù)和療效評價(jià)具有重要的臨床意義。

MCE是一種無創(chuàng)的檢測心肌血流灌注新技術(shù)。通過 fl ash閃爍成像破壞心肌內(nèi)的超聲微泡觀察造影劑的再灌注成像，MCE可以對心肌微循環(huán)灌注進(jìn)行定量評價(jià)[9]。在檢測冠狀動脈疾病心肌灌注方面，MCE和單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描結(jié)果顯著相關(guān)，且MCE敏感性更高[10]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)DM大鼠心肌血流量較對照組明顯減低，并通過核素掃描及病理結(jié)果驗(yàn)證，證明MCE檢測的心肌血流量可準(zhǔn)確評估體內(nèi)狀態(tài)的心肌灌注情況[11-12]。

本研究結(jié)果表明，與DM組相比，INS各亞組A、β、A×β均顯著增高（P＜0.05），提示胰島素治療能增加DM大鼠的心肌微循環(huán)灌注，延緩DCM病變進(jìn)展，其原因?yàn)橐葝u素早期治療能在一定程度上逆轉(zhuǎn)毛細(xì)血管和內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)損傷，進(jìn)而改善血管內(nèi)皮功能，增加心肌血容量和血流量，這與von Bibra 等[13]的結(jié)果相似。這一結(jié)果也通過透射電鏡得到驗(yàn)證：INS組毛細(xì)血管基底膜厚度較DM組減小，管腔有效面積增大，與Thompson[14]的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)論相符。這表明MCE指標(biāo)可以準(zhǔn)確、客觀地反映治療后心肌灌注較病變組的改善程度。與NC組比較，INS組各亞組MCE評價(jià)指標(biāo)偏低（P＜0.0.5），這表明即使成模后即刻進(jìn)行胰島素治療，亦無法完全恢復(fù)正常的心肌灌注，推測可能與實(shí)驗(yàn)中血糖偏高有關(guān)。高血糖可以破壞血管生成相關(guān)因子的平衡，降低促血管生成素-1及其受體的表達(dá)，導(dǎo)致毛細(xì)血管生成減少[15]。另外，長期慢性高血糖作用也會使心肌超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不可逆性的損害。本研究中免疫組化結(jié)果顯示，INS組毛細(xì)血管計(jì)數(shù)僅A亞組較DM組稍有改善（P＜0.0.5），B亞組、C亞組與DM組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.0.5）。毛細(xì)血管密度減低可通過A和A×β反映，因此MCE指標(biāo)亦能敏感地反映治療后心肌灌注與對照組的差異。INS不同亞組間比較，C亞組A、A×β低于A亞組（P＜0.0.5），B亞組各指標(biāo)與A亞組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.0.5），病理學(xué)結(jié)果與之相印證：A亞組與B亞組毛細(xì)血管超微結(jié)構(gòu)基本正常，而C亞組基底膜稍厚，血管內(nèi)皮細(xì)胞突向管腔，導(dǎo)致血管有效面積縮小。MCE能敏感地檢出INS組與DM組、INS組與NC組以及INS組亞組間心肌微血管灌注的差異，其中A、A×β可作為MCE療效監(jiān)測的重要參數(shù)。

圖2 大鼠心肌毛細(xì)血管超微結(jié)構(gòu)（醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，×12 000）。A. NC組C亞組毛細(xì)血管基底膜薄而光滑；B. DM組C亞組毛細(xì)血管基底膜明顯增厚（箭頭）；C. INS組C亞組毛細(xì)血管基底膜稍厚，血管內(nèi)皮細(xì)胞突向管腔內(nèi)（箭）

本研究將所有大鼠在開胸狀態(tài)下進(jìn)行檢查，均獲得良好的聲像圖質(zhì)量，利于準(zhǔn)確評價(jià)造影結(jié)果；但亦存在一定的局限性：由于DM大鼠病程不同，為保證治療療程相同，MCE檢測存在時(shí)間差，因此在對INS組3個亞組進(jìn)行橫向比較時(shí)，目前尚無法排除時(shí)間因素的干擾，因此有待于進(jìn)一步深入研究以得到更客觀的結(jié)論。

總之，胰島素早期干預(yù)能改善微血管結(jié)構(gòu)，增加心肌血流灌注。MCE能敏感、準(zhǔn)確地對DCM大鼠的心肌微循環(huán)進(jìn)行評價(jià)，且安全無創(chuàng)、易重復(fù)檢測，可作為DCM早期診斷和動態(tài)療效監(jiān)測的重要方法，具有明確的臨床指導(dǎo)意義。

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（本文編輯 聞 浩）

Assessment of Myocardial Perfusion in Diabetes Mellitus Rats with Insulin Intervention at Different Times by Using Myocardial Contrast Echocardiography

PurposeTo evaluate the myocardial perfusion in diabetes mellitus (DM) rats with insulin intervention at different times by myocardial contrast echocardiography (MCE)so as to explore the value of MCE in evaluating the treatment of diabetic cardiomyopathy(DCM).Materials and MethodsIn this prospective study, 90 rats were randomly divided into normal control (NC) group, DM group and insulin intervention (INS) group, with 30 rats in each group. After the DM models were established, the INS group was then divided into three subgroups of A, B and C treated with insulin intervention at 0, 4 and 8 weeks respectively and further treated continuously for 12 weeks. The NC and DM groups were also randomly divided into three subgroups and fed synchronously just as the INS group but without insulin intervention. At the end of 12, 16 and 20 weeks after modeling, the rats in each subgroup were examined by MCE. The changes of myocardial blood volume (A),blood velocity (β) and blood fl ow (A×β) were analyzed, and the myocardial tissues were also collected for pathological examination.ResultsA, β and A×β were increased in INS group compared with DM group (P＜0.05). Compared with NC group, the values of INS group including A×β in A subgroup, A and A×β in B subgroup, A, β and A×β in C subgroup were decreased (allP＜0.05). In INS group, there was no difference in the three values of myocardial blood between A and B subgroup (P＞0.05), but A and A×β were lower in C subgroup than those in A subgroup (P＜0.05). On pathology, the thickness of capillary basement membrane of INS group improved compared with DM group; the capillary density of INS group increased compared with DM group, but there was signi fi cant difference only in A subgroup (P＜0.05).ConclusionEarly insulin intervention can improve myocardial microvascular structure and increase myocardial blood fl ow. MCE can be used to evaluate the myocardial microcirculation of DCM rats sensitively and accurately, which can be used as an important method for early diagnosis and dynamic monitoring of DCM with clinical signi fi cance.

Diabetes complications; Cardiomyopathies; Insulin; Echocardiography;Contrast media; Myocardial reperfusion; Microcirculation; Disease models, animal; Rats,Sprague-Dawley

1. 西安市兒童醫(yī)院超聲科 陜西西安710003

張 軍

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81271580）。

2016-12-08

10.3969/j.issn.1005-5185.2017.06.002

2017-02-27

2. 第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院超聲科 陜西西安710032

Department of Ultrasound, Xijing Hospital,the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, China

Address Correspondence to:ZHANG Jun

E-mail: zhangjun@fmmu.edu.cn

R445.1；R587.1