反應(yīng)溫度對(duì)臺(tái)灣乳白蟻內(nèi)外源纖維素酶活力的差異影響

曾文慧++鐘俊鴻++李秋健++劉炳榮

摘要：臺(tái)灣乳白蟻（Coptotermes formosanus Shiraki）不僅是我國重要的經(jīng)濟(jì)害蟲，也是研究低等白蟻木質(zhì)纖維素二元降解系統(tǒng)的模式生物。將臺(tái)灣乳白蟻消化道解剖分成唾液腺/前腸+中腸（內(nèi)源）與后腸（外源）2個(gè)部分，以臺(tái)灣乳白蟻生理臨界溫度區(qū)間（15～42 ℃）為反應(yīng)溫度，測(cè)定內(nèi)切葡聚糖酶（endo-1，4-β-D-glucanohydrolasease，簡(jiǎn)稱EG）、纖維二糖水解酶（cellobiohydrases，簡(jiǎn)稱CBH）、β-葡萄糖苷酶 （β-glucosidase，簡(jiǎn)稱BG）以及濾紙酶（filter paper，簡(jiǎn)稱FPA）的活力，旨在探討反應(yīng)溫度對(duì)臺(tái)灣乳白蟻內(nèi)源與外源纖維素酶活力的影響差異。結(jié)果表明，整頭白蟻的FPA與EG酶活力隨反應(yīng)溫度變化趨勢(shì)一致。整頭白蟻BG酶在22～42 ℃下反應(yīng)活力無顯著差異。反應(yīng)溫度對(duì)外源纖維素酶活力的影響大于對(duì)內(nèi)源纖維素酶活力的影響。后腸EG、BG、CBH及FPA最佳反應(yīng)溫度均為32 ℃，而相應(yīng)內(nèi)源纖維素酶最佳反應(yīng)溫度均高于37 ℃。

關(guān)鍵詞：臺(tái)灣乳白蟻；纖維素酶；雙纖維素水解系統(tǒng)；反應(yīng)溫度

中圖分類號(hào)： S433.89文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）08-0091-04

臺(tái)灣乳白蟻（Coptotermes formosanus Shiraki）屬于低等白蟻，高效的木質(zhì)纖維素降解系統(tǒng)不僅使它成為世界范圍內(nèi)危害極大的重要經(jīng)濟(jì)害蟲，也成為研究生物質(zhì)能轉(zhuǎn)化的模式生物[1-2]。臺(tái)灣乳白蟻的木質(zhì)纖維素降解系統(tǒng)由2部分組成：前腸/唾液腺及中腸組成的內(nèi)源性消化系統(tǒng)；后腸微生物共生體組成的外源性消化系統(tǒng)[3-4]。一方面，低等白蟻后腸生物密度極大的共生鞭毛蟲在降解纖維素的過程中起著不可替代的主導(dǎo)作用。同時(shí)，大量原核微生物（細(xì)菌與古細(xì)菌）或生活在鞭毛蟲的細(xì)胞表面（ectosymbionts），或生活在鞭毛蟲的細(xì)胞內(nèi)部（endosymbionts）與鞭毛蟲形成了第二重的共生關(guān)系[5-6]。另一方面，低等白蟻?zhàn)陨硪材芊置谡子衫w維素酶、半纖維素酶組成的木質(zhì)纖維素降解酶系[7-8]。其中，纖維素酶主要包括內(nèi)切葡聚糖酶（endo-1，4-β-D-glucanase，EC. 3.2.1.4，簡(jiǎn)稱EG）、纖維二糖水解酶（β-1，4-cellobiohydrolase，EC. 3.2.1.91，簡(jiǎn)稱CBH）以及β-葡萄糖苷酶 （β-glucosidase，EC. 3.2.1.21，簡(jiǎn)稱BG）[9-10]。

研究表明，溫度是低等白蟻取食、生存、后腸原生動(dòng)物活性及消化效率[11-13]的重要影響因素。但目前為止，關(guān)于溫度對(duì)低等白蟻纖維素降解雙系統(tǒng)差異影響鮮有研究。臺(tái)灣乳白蟻的生理溫度臨界范圍（critical thermal range）為14.0～46.3 ℃[14]。本研究在臺(tái)灣乳白蟻生理臨界溫度范圍內(nèi)，選取15、22、28、32、37、42 ℃作為纖維素酶反應(yīng)溫度，分析反應(yīng)溫度對(duì)內(nèi)源、外源3種纖維素酶，以及濾紙酶（filter paperase，簡(jiǎn)稱FPA）活力的差異影響，為今后更深入地闡明環(huán)境與低等白蟻宿主-共生微生物纖維素水解系統(tǒng)相互作用機(jī)制以及新型白蟻防治方法提供理論數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)白蟻：供試白蟻工蟻取自本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的3個(gè)獨(dú)立臺(tái)灣乳白蟻巢。供試工蟻在28 ℃，相對(duì)濕度（80±5）%條件下，以蛭石保濕饑餓48 h均一化白蟻腸道，以備酶活力測(cè)定。

主要試劑包括：羧甲基纖維素鈉（sodium salt of caboxy methyl cellulose，簡(jiǎn)稱CMC-Na，天津福晨化學(xué)試劑廠）、葡萄糖（glucose，廣州化學(xué)試劑廠）、濾紙（雙圈定性濾紙）、 D-水楊苷（D-salicin，上海晶純?cè)噭┯邢薰荆?、?duì)硝基苯-8-D-纖維二糖苷（p-NPC，美國Sigma公司）、對(duì)硝基苯酚（p-NP，美國Genview公司）、牛血清蛋白組分Ⅴ（albumin from bovine serum，簡(jiǎn)稱BSA，美國Genview公司）、3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，簡(jiǎn)稱DNS，美國Genview公司）、考馬斯亮藍(lán)G-250（coomassie brilliant blue G-250，美國Genview公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1纖維素酶粗酶液制取選取乳白蟻工蟻約80頭置于0.9%（質(zhì)量濃度）滅菌生理鹽水中反復(fù)漂洗之后，用濾紙吸干表面水分，放入已滅菌的干凈培養(yǎng)皿中。在實(shí)體解剖鏡下將白蟻腸道解剖，分成前腸/唾液腺+中腸（內(nèi)源纖維素酶活力檢測(cè)段）和后腸（外源纖維素酶活力檢測(cè)段）2部分，與5頭未解剖的乳白蟻共分成3組，分別用1 mL醋酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH值=5.6）離心管再轉(zhuǎn)移至玻璃組織勻漿器，冰浴研磨；研磨完畢后，將勻漿液吸至離心管定容至1 mL，12 000 r/min、4 ℃冷凍離心（美國Sigma公司，3K15） 15 min，取上清，再次12 000 r/min、4 ℃冷凍離心5 min，取上清即為粗酶液，于 -20 ℃ 保存待用。

1.2.2纖維素酶活力測(cè)定（1）濾紙酶（FPA）、內(nèi)切葡聚糖酶（EG）及β-葡萄糖苷酶（BG）活力的測(cè)定參照Miller的方法[15]，均采用還原糖法。在1.5 mL的離心管中，分別加入120 μL 1% CMC-Na、D-Salicin及5 mm×5 mm滅菌濾紙1片，預(yù)熱5 min，然后加入12 μL酶液，37 ℃準(zhǔn)確反應(yīng) 60 min，立即加入120 μL DNS 溶液終止反應(yīng)，沸水浴 5 min，冰浴冷卻，使用多功能酶標(biāo)儀（victor 3 multi-label microplate reader，美國珀金埃爾默儀器有限公司）在540 nm處測(cè)定吸光度，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物計(jì)算產(chǎn)物還原糖含量[16]。EG、BG、FPA酶活力定義為1 mg蛋白質(zhì)在37 ℃、pH值=56反應(yīng)條件下分解底物，1 min可以產(chǎn)生還原糖的量，表示為U/mg。每個(gè)酶切反應(yīng)重復(fù)3次。（2）纖維二糖水解酶（CBH）活力測(cè)定：在 1.5 mL 離心管中加入120 μL 1 mmol pNPC底物，預(yù)熱5 min，然后加入酶液12 μL，37 ℃ 準(zhǔn)確反應(yīng) 60 min，加入120 μL Na2CO3 （0.6 mol/L）溶液終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀測(cè)定D405 nm，從p-NP標(biāo)準(zhǔn)曲線求得p-NP含量，計(jì)算酶活力單位。CBH酶活力定義為1 mg蛋白質(zhì)在37 ℃、pH值=5.6反應(yīng)條件下分解p-NPC，1 min可以產(chǎn)生p-NP的量，表示為U/mmol。每個(gè)酶切反應(yīng)測(cè)定3次。

1.2.3蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。將粗酶液稀釋1倍，取50 μL稀釋粗酶液，加入250 μL考馬斯亮藍(lán) G-250顯色試劑，多功酶標(biāo)儀測(cè)定D595 nm，用牛血清蛋白組分Ⅴ制作標(biāo)準(zhǔn)曲線求蛋白質(zhì)含量，每個(gè)樣本測(cè)定3次。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)。整頭白蟻、唾液腺/前腸+中腸及后腸3組樣品在不同反應(yīng)溫度下的酶活力差異均采用單因素方差分析（One Way ANOVA，α=0.05）與t檢驗(yàn)（LSD，α=0.05）。3巢白蟻共進(jìn)行3次梯度反應(yīng)溫度測(cè)定，所有誤差線為均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差（standard error of mean，簡(jiǎn)稱SEM）。

2結(jié)果與分析

前腸/唾液腺+中腸部分用于檢測(cè)白蟻內(nèi)源性纖維素酶活性變化，4種酶標(biāo)準(zhǔn)縮寫為FPA/EG/BG/CBH-FM；后腸部分用于檢測(cè)白蟻共生微生物來源纖維素酶活性變化，4種酶標(biāo)準(zhǔn)縮寫為FPA/EG/BG/CBH-H；整頭白蟻4種酶指標(biāo)縮寫為FPA/EG/BG/CBH-W。

2.1反應(yīng)溫度對(duì)內(nèi)源與外源纖維素酶降解濾紙能力的差異影響

FPA-W活力在反應(yīng)溫度為22 ℃達(dá)到最大值，且在15、22、37、42 ℃下反應(yīng)測(cè)得各FPA酶活力之間無顯著差異。FPA-W在28、32 ℃下反應(yīng)活性相對(duì)較?。▓D1-A）。后腸對(duì)濾紙的降解能力受反應(yīng)溫度影響較內(nèi)源性纖維素酶大（FPA-FM 組內(nèi)F=3.536，P<0.05；FPA-H組內(nèi)F=2875，P<0.05）。FPA-H最佳反應(yīng)溫度為32 ℃，顯著大于其他反應(yīng)溫度下FPA-H活力。FPA-FM對(duì)濾紙的最佳降解溫度為42 ℃。在15～32 ℃時(shí)，F(xiàn)PA- H活力大于FPA-FM活力，而在 37～42 ℃時(shí)，F(xiàn)PA- FM活力大于FPA-H活力（圖1-B）。

2.2反應(yīng)溫度對(duì)內(nèi)源與外源內(nèi)切葡聚糖酶活力的影響

EG- W的最佳反應(yīng)溫度為37 ℃，且在22、37、42 ℃下反應(yīng)測(cè)得各EG-W酶活力之間無顯著差異。在28、32 ℃下，EG-W反應(yīng)活性相對(duì)較?。▓D2-A）。后腸微生物群落對(duì)濾紙酶的降解能力受反應(yīng)溫度影響較內(nèi)源性纖維素酶大（EG-FM 組內(nèi)F=7.111，P<0.05；EG-H組內(nèi)F=11.107，P<0.05）。EG-H 最佳反應(yīng)溫度為32 ℃，顯著大于其他溫度下EG-H活力。在15、22、32、37、42 ℃下，EG-FM反應(yīng)活性兩兩之間無顯著差異（圖2-B）。

2.3反應(yīng)溫度對(duì)內(nèi)源與外源β-葡萄糖苷酶活力的影響

BG-W活力受反應(yīng)溫度影響小，組內(nèi)無顯著差異（BG-W 組內(nèi)F=2.040，P=0.145）（圖3-A）。BG -FM與BG-H酶活力在15～32 ℃下反應(yīng)， 隨溫度升高而增加，而反應(yīng)溫

度升高至37～42 ℃，BG-FM活力顯著增加，BG-H活力則顯著降低（圖3-B）。

2.4反應(yīng)溫度對(duì)內(nèi)源與外源纖維二糖水解酶的影響

CBH-W最佳反應(yīng)溫度為37 ℃，且在37、42 ℃時(shí)，CBH-W的酶活力之間無顯著差異（圖4-A）。CBH-FM在15～32 ℃內(nèi)，反應(yīng)活力變化整體趨勢(shì)隨溫度升高而增加。在22～32 ℃之內(nèi)，CBH-H活性隨反應(yīng)溫度升高逐漸增加，且在32 ℃時(shí)，CBH-H活力達(dá)到最高值，反應(yīng)溫度再升高活力顯著下降（圖4-B）。

3結(jié)論與討論

低等白蟻對(duì)木質(zhì)纖維素的高效降解通常認(rèn)為是內(nèi)源與外源（后腸共生微生物）降解系統(tǒng)的增效協(xié)同作用[3]。溫度是影響低等白蟻取食消化等生理功能的重要物理因子[11-13]。本試驗(yàn)選取臺(tái)灣乳白蟻生理臨界溫度范圍內(nèi)的15、22、28、32、37、42 ℃作為纖維素酶反應(yīng)溫度，分析研究了反應(yīng)溫度對(duì)乳白蟻工蟻內(nèi)源與外源3種纖維素酶及濾紙酶活力的差異影響。

整頭白蟻的FPA、EG、BG、CBH活力隨反應(yīng)溫度的變化為內(nèi)源及外源纖維素酶活力隨反應(yīng)溫度變化的綜合作用。其中，F(xiàn)PA-W與EG-W的活力隨反應(yīng)溫度變化的趨勢(shì)相似，BG-W活力則受反應(yīng)溫度影響小，組內(nèi)無明顯差異。濾紙全酶活是衡量纖維素酶降解天然纖維素能力的指標(biāo)。EG首先作用于非結(jié)晶態(tài)纖維素和水溶性纖維素衍生物，隨機(jī)水解糖苷鍵，分解成葡萄糖、纖維二糖、纖維三糖和其他寡聚糖。BG再將纖維二糖和水溶性糊精水解成葡萄糖。因而，只需要EG與BG等2種酶的參與即能將一部分纖維素水解成葡萄糖[14]。結(jié)果表明，白蟻對(duì)天然纖維素的降解可能極大地被EG活力所影響。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，外源（后腸）共生微生物纖維素酶對(duì)溫度的敏感性大于內(nèi)源性（唾液腺/前腸+中腸）纖維素酶。而且，內(nèi)源性纖維素酶的最佳反應(yīng)溫度高于外源共生微生物纖維素酶的最佳反應(yīng)溫度。其中，F(xiàn)PA-H、EG-H、BG-H 及CBH-H的最佳反應(yīng)溫度均為32 ℃，且活力均在37 ℃后顯著下降。然而，F(xiàn)PA-FM與EG-FM在反應(yīng)溫度升至42 ℃時(shí)，活性未出現(xiàn)明顯影響。在15～42 ℃范圍內(nèi)，BG-FM 與CBH-FM活力整體隨反應(yīng)溫度上升而增加，且CBH-FM活力在42 ℃有顯著增加。由此可見，32 ℃是內(nèi)源與外源酶發(fā)揮作用的重要分歧溫度。研究表明，臺(tái)灣乳白蟻的生理活性溫度范圍為14.0～46.3 ℃[17]，最佳取食溫度范圍為30～35 ℃[18-20]。因此，后腸纖維素酶最佳反應(yīng)溫度處于最佳取食溫度范圍內(nèi)，而內(nèi)源纖維素酶的最佳反應(yīng)溫度則高于該溫度范圍。一方面，低等白蟻后腸消化系統(tǒng)被認(rèn)為對(duì)木質(zhì)纖維素的降解起主導(dǎo)性作用，例如：北美散白蟻（Reticulitermes flavipes Kollar）的內(nèi)源與外源纖維素水解系統(tǒng)分別提供33%與66%的葡萄糖[10]，由此推測(cè)，臺(tái)灣乳白蟻后腸纖維素酶最佳反應(yīng)溫度是與乳白蟻?zhàn)罴讶∈硿囟认嗷?duì)應(yīng)的，即在最適取食溫度下臺(tái)灣乳白蟻降解木質(zhì)纖維素也主要依靠后腸共生微生物消化系統(tǒng)。另一方面，纖維素在經(jīng)過白蟻唾液腺和中腸上皮細(xì)胞分泌的各種消化酶的分解后，大部分較易消化的木質(zhì)纖維素在到達(dá)中腸末尾時(shí)已被降解吸收[21]，表明內(nèi)源纖維素酶系統(tǒng)的獨(dú)立性。因此，在40 ℃生理極限高溫環(huán)境下，臺(tái)灣乳白蟻的內(nèi)源性纖維素降解系統(tǒng)對(duì)白蟻的生存起到了非常重要的作用。

白蟻對(duì)周圍環(huán)境的適應(yīng)能力與腸道微生物的組成以及腸道微生物的消化能力有著密不可分的聯(lián)系[22]。闡明溫度與低等白蟻木質(zhì)纖維素消化系統(tǒng)之間的相互作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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