新疆油雞禽流感病毒Xj14分離株P(guān)A基因的克隆與序列分析

武軍元++黃忠武++康強++姚禮文

摘要：為了從分子水平上掌握新疆油雞H9N2亞型禽流感病毒PA基因的遺傳進化情況，采用RT-PCR技術(shù)對新疆油雞分離株Xj14的PA基因進行克隆、測序及分子進化分析，將PA基因的核苷酸序列和對應的氨基酸序列與 GenBank 中已經(jīng)公布的參考序列進行同源性比較。結(jié)果表明，新疆油雞分離株的PA基因由2 151個堿基組成，編碼716個氨基酸，與AIV A/Duck/HongKong/Y439/97的PA基因處于同一分支，其核苷酸和氨基酸水平的同源性依次為899%和96.9%，在系統(tǒng)進化上屬于歐亞分支中的Y439譜系。

關(guān)鍵詞：禽流感病毒；油雞；PA基因；克??；序列分析

中圖分類號： S852.65+7文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0020-03

禽流感（avian influenza，AI）是由A型流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的病毒性傳染病。自Homme等1966年從威斯康辛州患有溫和呼吸道疾病的火雞中分離到第1株H9N2亞型禽流感病毒之后，該亞型病毒在世界范圍內(nèi)呈廣泛流行的趨勢[1-4]。我國1994年首次從廣東省的發(fā)病雞群中分離到H9N2亞型禽流感病毒[5-6]，1998年首先報道H9N2亞型AIV可以感染人[7]，1999年我國香港地區(qū)發(fā)生了人感染H9N2的病例[8]。進一步的研究結(jié)果表明，1997年我國香港地區(qū)感染人的H5N1病毒的內(nèi)部蛋白基因片段來源于H9N2亞型AIV[9]；2013年發(fā)生于我國上海等地的重配病毒H7N9中6個內(nèi)部基因均來自H9N2亞型AIV[10]；劉金華等近期發(fā)表在PNAS上的研究結(jié)果揭示，單一基因型H9N2流感病毒在我國雞群中的優(yōu)勢流行為H7N9流感病毒的重排提供了充分條件[11]。A型流感病毒基因組由8個單股負鏈RNA片段組成，它們編碼11個已知的病毒蛋白質(zhì)，RNA聚合酶是由流感病毒基因組3個最大的片段PB1、PB2和PA編碼的異源三聚體復合物。其中，PB1是病毒RNA聚合酶的催化亞基，負責病毒RNA的復制以及轉(zhuǎn)錄、PB2以一種稱為“Snatch”的方式參與宿主mRNA帽狀結(jié)構(gòu)的切割而完成病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄[12]。近年來的研究結(jié)果表明，PA亞基不但參與病毒復制過程，而且參與病毒RNA轉(zhuǎn)錄、決定內(nèi)切核酸酶和蛋白酶的活性，以及參與病毒粒子組裝等多種生命活動過程，基于篩選慢性肝炎和艾滋病藥物的啟示[13]，PA蛋白因可以抑制病毒的復制轉(zhuǎn)錄、有效發(fā)揮抗病毒作用而成為新型抗流感藥物研發(fā)的潛在靶點。

由此可見，加強對不同物種H9N2亞型AIV的檢測，密切關(guān)注其重配情況，進一步對其生物學特性以及分子流行病學進行研究，對于預測和防控流感大流行的發(fā)生具有不可忽視的作用。本研究對從新疆油雞當中分離到的1株H9N2亞型禽流感病毒進行PA基因克隆測序，并進行分子進化分析，以了解新疆油雞H9N2亞型AIV PA基因遺傳進化的情況。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒H9N2亞型禽流感病毒新疆油雞分離株A/Chicken/XinjiangBaicheng/1/2014（H9N2）（簡稱Xj14）于新疆生產(chǎn)建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室分離保存。

1.1.2主要試劑及儀器設備High Pure Viral RNA Kit（Cat. No. 11858882001）購自Roche公司；PrimeScriptTM Ⅱ First-strand cDNA Synthesis Kit（Cat. No.6210A）購自寶生物工程（大連）有限公司；HiPure Gel Pure DNA Kits購自Magen公司；pGEM-T Easy Vector購自Promega公司；Trans 2K DNA Markers、TransTaq-T DNA Polymerase購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；TIANprep Mini Plasmid Kit購自天根生化科技有限公司。梯度PCR儀、全自動凝膠成像分析系統(tǒng)、高速離心機為德國Eppendorf公司。

1.2方法

1.2.1引物設計參照已知的AIV序列設計了1條反轉(zhuǎn)錄通用引物Uni 12，用于AIV各片段的反轉(zhuǎn)錄擴增，序列為Uni 12：5′-AGCAAAAGCAGG-3′。

參考NCBI公布的H9N2亞型AIV的PA基因序列，利用Primer premier 5.0軟件設計一對基因特異性引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成，序列為Bm-PA-1：5′-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAC-3′；Bm-PA-2：5′-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTT-3′。

1.2.2病毒RNA提取及PA基因RT-PCR擴增取 200 μL 尿囊液，按照Roche公司的High Pure Viral RNA Kit（Cat. No. 11858882001）說明書提取病毒RNA，用流感病毒反轉(zhuǎn)錄通用引物Uni-12，按照PrimeScriptTM Ⅱ First-strand cDNA Synthesis Kit（Cat. No.6210A）說明書反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。用所設計的PA基因特異性引物進行PCR擴增，采用 50 μL 的反應體系，組成如下：10×PCR緩沖液5 μL，10 mmol dNTPs 4 μL，Taq DNA聚合酶（5 U）0.5 μL，上下游引物各 1 μL（10 μmol），cDNA模板1 μL，無RNA酶的水37.5 μL。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，53 ℃ 40 s，72 ℃ 2.5 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR反應結(jié)束后，取5 μL反應產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.3PA基因克隆與序列測定參照HiPure Gel Pure DNA Kits說明書將RT-PCR產(chǎn)物純化回收，回收產(chǎn)物克隆到pGEM-T Easy Vector上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中，選擇PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送北京擎科武漢測序部進行序列測定。

1.2.4PA基因生物學分析應用序列分析軟件DNAStar對測序結(jié)果進行拼接處理，將所得序列與GenBank中公布的H9N2亞型流感病毒典型代表株（表1）的PA基因序列進行同源性比較，用MEGA6軟件的neighbour-joining方法構(gòu)建進化樹，分析其遺傳進化關(guān)系。

2結(jié)果與分析

2.1PA基因的RT-PCR擴增

利用設計的針對PA基因的特異性引物Bm-PA-1/Bm-

2.2PA基因的核苷酸及氨基酸序列同源性分析

測序結(jié)果表明，本研究擴增的PA基因開放閱讀框由 2 151 個堿基組成，編碼716個氨基酸，將擴增的核酸序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫獲得GenBank登錄號KX575647。將本研究分離毒株與GenBank公布的其他毒株進行核苷酸和氨基酸序列同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究分離毒株的核苷酸和氨基酸序列均與A/Duck/HongKong/Y439/97具有較高的同源性，其核苷酸和氨基酸水平的同源性依次為89.9%和96.9%（表2）。

2.3PA基因的系統(tǒng)進化分析

將本研究分離毒株與國內(nèi)流行毒株的PA基因進行多序列比對并繪制PA基因的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖2），分析結(jié)果表明，新疆油雞分離毒株Xj14的PA基因與2013年世界衛(wèi)生組織推薦的疫苗株A/HongKong/33982/2009親緣關(guān)系最近，與國內(nèi)參考毒株A/Duck/HongKong/Y439/97同處于一個分支。

3討論

禽流感病毒是目前危害世界及我國養(yǎng)禽業(yè)的烈性病毒之一。禽流感病毒的血清亞型眾多，遺傳變異程度極其頻繁，目前，H5和H7亞型禽流感病毒對養(yǎng)殖業(yè)造成的直接危害較

大，因此，該亞型是基層生產(chǎn)防控的重點。H9N2禽流感是中國大陸主要的流行亞型，感染雞群具有發(fā)病率高、免疫抑制和產(chǎn)蛋下降的特點，而且一旦感染很難清除，對養(yǎng)殖業(yè)以及公共衛(wèi)生造成了極大的危害。近期，Pu等研究發(fā)現(xiàn)，單一基因型H9N2流感病毒在我國雞群中的優(yōu)勢流行為H7N9流感病毒的重排提供了充分條件[11]，由此可見，H9N2流感病毒可以通過基因重組或重配產(chǎn)生新的對哺乳動物甚至人類高致病力的病毒株。

禽流感病毒依據(jù)HA和NA基因的分子進化特征可以分為北美和歐亞兩大譜系，歐亞譜系又進一步分為A/CK/BJ/94、G1/97和Y439/97 3個亞分支[14]，AIV的HA、NA、NP、M、PB1、PB2和PA進化情況相似。筆者所在實驗室前期的研究結(jié)果顯示，新疆油雞分離株Xj14的HA和NA基因均屬于國內(nèi)穩(wěn)定存在的BJ/94亞分支，且從分子水平上證實Xj14為低致病力的毒株，只是HA在關(guān)鍵位點出現(xiàn)Q234L的突變，NA基因在3個紅細胞吸附區(qū)域發(fā)生多處突變，HA、NA基因的糖基化位點均有所增加，這種受體結(jié)合位點的改變和潛在糖基化位點的增加可能使之在進化過程中獲得跨種傳播的能力[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，新疆油雞分離毒株Xj14的PA基因與2013年世界衛(wèi)生組織推薦的疫苗株A/HongKong/33982/2009親緣關(guān)系最近，與歐亞譜系國內(nèi)參考毒株A/Duck/HongKong/Y439/97處于一個分支。因此，新疆油雞分離株Xj14很有可能是歐亞譜系不同亞分支重排的新毒株，其中，疫苗株A/HongKong/33982/2009參與病毒的重排組成。

綜上所述，應當加強邊疆新疆地區(qū)H9N2亞型AIV監(jiān)控的力度，為流感大數(shù)據(jù)的建立提供理論依據(jù)。

參考文獻：

[1]Homme P J，Easterday B C.Avian influenza virus infections.Ⅳ. Response of pheasants，ducks，and geese to influenza A-turkey-Wisconsin-1966 virus[J]. Avian Dis，1970，14（2）：285-290.

[2]Alexander D J.A review of avian influenza in different bird species[J]. Vet Microbiol，2000，74（1/2）：3-13.

[3]Brown I H，Banks J，Manvell R J，et al.Recent epidemiology and ecology of influenza A viruses in avian species in Europe and the Middle East[J]. Dev Biol，2006，124：45-50.

[4]Lee Y J，Shin J Y，Song M S，et al.Continuing evolution of H9 influenza viruses in Korean poultry[J]. Virology，2007，359（2）：313-323.

[5]Wang J Y，Ren J J，Liu W H，et al.Complete genome sequence of a new H9N2 avian influenza virus isolated in China[J]. Genome Announc，2013，1（3）：e00261.

[6]陳伯倫，張澤紀，陳偉斌. 禽流感研究Ⅰ. 雞A型禽流感病毒的分離與血清學初步鑒定[J]. 中國獸醫(yī)雜志，1994，20（10）：3-5.

[7]Guo Y J，Li J G，Cheng X W.Discovery of man infected by avian influenza A （H9N2） virus [J]. Chin J Exp Clin Virol，1999，13（2）：105-108.

[8]Peiris M，Yuen K Y，Leung C W，et al.Human infection with influenza H9N2[J]. The Lancet，1999，354（9182）：916-917.

[9]Liu J H，Okazaki K，Ozaki H，et al.H9N2 influenza viruses prevalent in poultry in China are phylogenetically distinct from A/quail/Hong Kong/G1/97 presumed to be the donor of the internal protein genes of the H5N1 Hong Kong/97 virus[J]. Avian Pathology，2003，32（5）：551-560.

[10]Gao R，Cao B，Hu Y，et al.Human infection with a novel avian-origin influenza A （H7N9） virus[J]. N Engal J Med，2013，368（20）：1888-1897.

[11]Pu J，Wang S G，Yin Y B，et al.Evolution of the H9N2 influenza genotype that facilitated the genesis of the novel H7N9 virus[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2015，112（2）：548-553.

[12]Li M L，Rao P，Krug R M.The active sites of the influenza capdependent endonuclease are one different polymerase subunits[J]. EMBO J，2001，20（8）：2078-2086.

[13]Xing S H，Li X B.Research progress of anti-virus activity and action mechanism of febrifuge and detoxifying herbs[J]. Chin Pharmacol Bull，2014，30（4）：464-468.

[14]Bi J M，Deng G C，Dong J，et al.Phylogenetic and molecular characterization of H9N2 influenza isolates from chickens in Northern China from 2007—2009[J]. PLoS One，2010，5（9）：e13063.

[15]武軍元，康強. 新疆油雞H9N2亞型禽流感病毒分離株HA和NA基因的克隆及進化生物信息分析[J]. 中國獸醫(yī)學報，2016，36（4）：623-629.