污染土壤中重金屬鋅吸附菌株的篩選研究

楊 卓

（河北環(huán)境工程學(xué)院，河北秦皇島066102）

污染土壤中重金屬鋅吸附菌株的篩選研究

楊 卓

（河北環(huán)境工程學(xué)院，河北秦皇島066102）

主要對污染土壤中吸附重金屬鋅菌株的篩選、鑒定進(jìn)行研究。從污染土壤樣品中富集培養(yǎng)微生物菌株，通過吸附率測定，得到4株鋅吸附能力較高的菌株，分別命名為ZnA-4、ZnE-3、ZnH-2、ZnL-2，其中ZnH-2菌株對鋅的吸附率最高，達(dá)到48.30%，其次是ZnL-2，吸附率為42.95%。通過常規(guī)細(xì)菌鑒定方法，從菌落形態(tài)特征、生理生化試驗(yàn)兩方面對4株菌進(jìn)行鑒定，初步鑒定這4株菌均為芽孢桿菌屬。此功能性菌株有望在土壤污染原位固定技術(shù)中作為修復(fù)菌劑。

重金屬污染；菌株篩選；菌株鑒定；鋅離子

鋅是動(dòng)植物生長發(fā)育所必需的微量營養(yǎng)元素之一，在調(diào)節(jié)人體的免疫功能，維持機(jī)體正常生理機(jī)能中具有重要的作用，可以促進(jìn)兒童的正常發(fā)育，治療厭食和營養(yǎng)不良等[1-2]。近年來，經(jīng)濟(jì)建設(shè)速度加快，鉛、鋅礦產(chǎn)資源開采、金屬冶煉、燃料生產(chǎn)等生產(chǎn)活動(dòng)使得鋅等重金屬可以通過多種途徑進(jìn)入土壤環(huán)境，從而造成嚴(yán)重的土壤重金屬污染[3]。土壤被鋅污染后，土壤鋅被植物吸收會(huì)導(dǎo)致作物減產(chǎn)，還會(huì)通過食物鏈層層傳遞，最終威脅人體健康，所以減輕土壤重金屬危害，確保土壤質(zhì)量和農(nóng)產(chǎn)品食用安全，對人類的健康非常重要[4]。

土壤重金屬污染的傳統(tǒng)治理方法主要有化學(xué)沉淀法、電解法、離子交換法和膜分離技術(shù)等，但是傳統(tǒng)的方法費(fèi)用高、能耗大，易造成二次污染。在長期的研究中，微生物吸附技術(shù)受到了廣泛關(guān)注。微生物吸附技術(shù)是近年來研究發(fā)現(xiàn)的一類新型、高效的清除土壤中重金屬的方法，與傳統(tǒng)方法相比，其運(yùn)行費(fèi)用低，對土壤肥力和代謝活性沒有影響，可以避免污染物轉(zhuǎn)移而對人類健康和環(huán)境產(chǎn)生影響[5]。

本研究從土壤中篩選分離高效吸附鋅的細(xì)菌菌株，并且對吸附能力較高的菌株進(jìn)行種屬鑒定，以期為生物技術(shù)治理土壤鋅污染提高菌種資源，并為其進(jìn)一步研究奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

群測群防是指山洪災(zāi)害易發(fā)區(qū)的縣（市、區(qū)）、鎮(zhèn)（鄉(xiāng)）兩級(jí)人民政府和村（居）民委員會(huì)，組織轄區(qū)內(nèi)企事業(yè)單位和廣大人民群眾，在水行政主管部門和相關(guān)專業(yè)技術(shù)單位的指導(dǎo)下，通過防御組織建立、責(zé)任制落實(shí)、防災(zāi)預(yù)案編制、防災(zāi)知識(shí)宣傳、避險(xiǎn)技能培訓(xùn)、避災(zāi)措施演練等手段，對由降雨引發(fā)的洪水等突發(fā)災(zāi)害進(jìn)行監(jiān)測預(yù)警的防御措施，實(shí)現(xiàn)對山洪災(zāi)害的提前預(yù)防、及時(shí)監(jiān)測、快速預(yù)警和有效避讓的一種主動(dòng)防災(zāi)減災(zāi)體系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)所用設(shè)備有：高壓滅菌鍋、雙層搖床、智能生化培養(yǎng)箱、電子天平、超凈工作臺(tái)、低溫冰箱、光學(xué)顯微鏡、4℃冰箱、752型紫外可見分光光度計(jì)、高速離心機(jī)、微量移液器。

1.2 供試土樣的采集

采用五點(diǎn)法取樣，將污水處理廠周邊、廟溝鐵礦門前污染的土壤、小湯河入海處底泥等地點(diǎn)的土壤樣品混合。取樣時(shí)鏟去表面土層，取5～10 cm處的土壤，裝入無菌袋帶，記錄取樣地點(diǎn)，時(shí)間等，回實(shí)驗(yàn)室，4℃冰箱保藏備用。從此部分土樣中富集分離篩選微生物菌株。

1) 設(shè)計(jì)開發(fā)的煙苗剪葉器已經(jīng)進(jìn)入小批量推廣應(yīng)用。應(yīng)用結(jié)果顯示,綜合輔助用工,剪葉效率為120盤/h(煙苗豎膀期) ,是人工剪葉的6倍以上，其集葉率達(dá)到96%以上，避免了剪掉的碎葉對煙苗造成污染。同時(shí)，使用過程中可隨時(shí)對切刀進(jìn)行消毒，避免切刀對煙苗形成二次污染。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

2017年4月24日、25日，我們分別造訪了俄羅斯科學(xué)院卡爾梅克科研中心和以帕里莫夫命名的國家博物館。在我們心目中它們都是卡爾梅克歷史研究的圣地，19世紀(jì)以來，一些有代表性的卡爾梅克歷史研究作品都與它們有關(guān)，并給予我們的17至18世紀(jì)土爾扈特蒙古歷史研究以極大的幫助，獲益匪淺。

1.3.1 菌株的富集和分離

在計(jì)算機(jī)科學(xué)與技術(shù)中，數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)介于數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)軟硬件之間，由于其獨(dú)特的地位使其成為計(jì)算機(jī)專業(yè)的核心基礎(chǔ)課程。數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)課程偏重理論，內(nèi)容抽象，注重理解，同時(shí)又要求學(xué)生能夠?qū)⒊橄蟮乃季S轉(zhuǎn)化為在計(jì)算機(jī)可以操作的具體實(shí)踐，因此數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)是一門理論性和實(shí)踐性都很強(qiáng)的課程[1]，其概念多、內(nèi)容多、高抽象性、強(qiáng)邏輯性和算法復(fù)雜性始終是學(xué)生學(xué)習(xí)的一個(gè)難點(diǎn)[2]。

將馴化后的菌株涂布于固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中已加入500 mg/L的氯化鋅，單菌落在含重金屬的固體培養(yǎng)基上反復(fù)劃線純化，直至獲得純培養(yǎng)。

范冰冰的出道，源于參演一部叫《女強(qiáng)人》的電視劇。當(dāng)年只有15歲的她，只參與拍攝了三天的戲。放在今天，也就是跑龍?zhí)椎?。但范冰冰的演藝?jīng)歷赫然寫著：1996年，范冰冰參與拍攝劉雪華與邵兵主演的電視劇《女強(qiáng)人》。這就像在北京的打工仔，稱自己參與首都建設(shè)差不多。不出名時(shí)可以理解，出了名還這樣做，說明這三天短暫的拍攝對她之后的演藝事業(yè)足夠重要。

1.3.2 菌株吸附能力測定

綜上所述,在內(nèi)分泌科晨交班中開展sbar交班模式,可提高護(hù)士專業(yè)水平,建立和諧的醫(yī)護(hù)團(tuán)隊(duì),提升醫(yī)療護(hù)理服務(wù)質(zhì)量,促進(jìn)患者安全。因此,在晨交班中應(yīng)普及推廣sbar交班模式,縮短交班時(shí)間,提高交班質(zhì)量。

1.3.2.1 菌體的制備

游客們搭上列車，列車慢慢往上爬，像是要爬上喜馬拉雅山區(qū)，進(jìn)入一個(gè)氣氛黯淡恐怖的地域，突然之間，面前出現(xiàn)了怒吼的雪人，列車趕緊急速后退，換上另外一條軌道，暫時(shí)似乎離開了危機(jī)，說時(shí)遲那時(shí)快，接著路上的鐵軌突然中斷消失了，在雪人的怒吼聲中，列車急速下降，仿佛要一路掉進(jìn)山谷里，中途還連續(xù)幾個(gè)劇烈的翻滾……

取5 g土樣于含Zn2+的液體培養(yǎng)基中，攪勻制成土壤懸液，搖床培養(yǎng)3 d后轉(zhuǎn)接至新鮮液體培養(yǎng)基中，直到Zn2+濃度達(dá)到500 mg/L。如此連續(xù)富集獲得高純度、穩(wěn)定的富集培養(yǎng)物。

從斜面上挑取已活化的菌體，振蕩培養(yǎng)20 h，將培養(yǎng)物收集菌體，用去離子水洗滌后再離心，反復(fù)3次，所得菌體以待備用。

式中：C0——重金屬離子初始濃度，mg/L；Ct——重金屬離子平衡濃度，mg/L。

采用國標(biāo)方法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.4 計(jì)算

國際市場：國際氮肥價(jià)格下行，印度MMTC標(biāo)購預(yù)計(jì)將采購120萬噸尿素，貿(mào)易商報(bào)價(jià)較10月招標(biāo)下降20美元/噸左右，同時(shí)，印度尿素庫存較低，因此后續(xù)還可能出現(xiàn)招標(biāo)。國際磷肥價(jià)格平穩(wěn)運(yùn)行，部分地區(qū)高端價(jià)格出現(xiàn)下降，中國企業(yè)出口商談價(jià)在405美元/噸 FOB左右。國際鉀肥價(jià)格守穩(wěn)盤整，新訂單集中在巴西，其他地區(qū)新單采購較少，亞洲地區(qū)鉀肥價(jià)格與上周持平。

稱取一定量的干菌體加入到50 ml含Zn2+的水溶液中，按不同的試驗(yàn)要求振蕩吸附后，13 000 r/min離心5 min。

1.3.3.3 吸附試驗(yàn)

重金屬吸附率，用式計(jì)算：

1.3.2.2 制備Zn標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 菌株對鋅的吸附試驗(yàn)

各菌株對鋅離子的吸附率詳見表1。

2.1 菌株的富集、純化

將得到的菌株進(jìn)行編號(hào)，劃線純化培養(yǎng)。各菌落形態(tài)表現(xiàn)不一。顏色多為白色及淡黃色，極少數(shù)菌株呈現(xiàn)紅色或淺紅色，形狀多為圓形或近圓形，表面大多扁平，少數(shù)凸起，大部分整齊排列，少數(shù)呈不規(guī)則形狀。

所篩選分離出的58株耐鋅菌株。有34株菌對鋅有吸附作用，其中ZnH-2菌株對鋅的吸附率最高，達(dá)到48.30%，而ZnL-2菌株對鋅的吸附率也達(dá)到了42.95%。其次是ZnE-3和ZnA-4。這4株菌對鋅污染土壤的修復(fù)更有價(jià)值，對這4株菌進(jìn)行生物學(xué)特性研究。

噢，噢，你瞧我又弄混了。吳小哥不好意思地把兩只手扣在了一起。每當(dāng)我給他糾正的時(shí)候，他就把兩只手扣在一起，露出羞怯的神情。更多的時(shí)候，我會(huì)順著他的思路跑下去。

表1 菌株對鋅的吸附結(jié)果

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 菌落特征

通過對ZnA-4、ZnE-3、ZnH-2、ZnL-2這4株菌菌落形態(tài)的觀察，初步判斷為細(xì)菌菌落，圓形或近圓形、白色。詳細(xì)描述見表2。

2.3.2 革蘭氏染色

通過對這4株菌進(jìn)行革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)。在顯微鏡下觀察，都為桿菌，除了ZnE-3是革蘭氏陽性菌，其他3株菌均為革蘭氏陰性菌。見圖1。

表2 菌落形態(tài)

圖1 菌落形態(tài)特征

圖2 菌株革蘭氏染色

2.4 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

具體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

由以上的結(jié)果，對照常見細(xì)菌鑒定手冊作初步判斷：ZnA-4、ZnE-3、ZnH-2、ZnL-2為芽孢桿菌（Bacillus.spp）。

3 結(jié)論

隨著工業(yè)的發(fā)展和人口的不斷增加，重金屬排放量不斷增加[6]。本次實(shí)驗(yàn)通過對污染土壤中吸附重金屬鋅的篩選，得到了4株吸附率較高的菌株，分別是ZnA-4、ZnE-3、ZnH-2、ZnL-2，其中ZnH-2菌株對鋅的吸附率最高，達(dá)到48.30%，其次是ZnL-2，吸附率為42.95%。這4株菌對鋅污染土壤的修復(fù)很有價(jià)值，所以又進(jìn)行了形態(tài)及生理生化特征鑒定。經(jīng)初步鑒定ZnA-4、ZnE-3、ZnH-2、ZnL-2為芽孢桿菌（Bacillus）。下一階段可以對菌株的吸附能力的優(yōu)化進(jìn)行進(jìn)一步研究。相關(guān)研究可以為微生物菌株吸附機(jī)制研究提供依據(jù)，并為其環(huán)境修復(fù)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)[7]。

表3 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

[1]朱永官，陳保冬，林愛軍，等.珠江三角洲地區(qū)土壤重金屬污染控制與修復(fù)研究的若干思考[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2005，25（12）：1575-1579.

[2]周啟星，魏樹和，刁春燕.污染土壤生態(tài)修復(fù)基本原理及研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26（2）：419-424.

[3]張富運(yùn)，陳永華，吳曉芙，等.鉛鋅超富集植物及耐性植物篩選研究進(jìn)展[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（12）：92-96.

[4]王云，魏復(fù)盛.土壤環(huán)境元素化學(xué)[M].北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，1995：42-57.

[5]何啟賢.土壤重金屬污染修復(fù)技術(shù)述評(píng)[J].廣州化工，2012，40（22）：44-46.

[6]張坤，羅書.水體重金屬污染治理技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國環(huán)境管理干部學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，20（3）：62-64.

[7]李慧芬，林雁冰，王娜娜，等.一株Zn抗性菌株的篩選鑒定及吸附條件優(yōu)化[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（11）：2189-2196.

（編輯：程?。?/p>

A Study on Screening of Adsorption of Heavy Metal Zinc Strains in Pollution Soil

Yang Zhuo
（Hebei University of Environmental Engineering,Qinhuangdao Hebei 066102,China）

This experiment mainly carried out the study on the screening,identification of adsorption of heavy metal zinc strains in pollution soil.Through contaminated soil samples collected,enrichment cultivation,separation strains,as well as the determination of adsorption rate,the 4 strains with higher adsorption capacity were obtained,named ZnA-4,ZnE-3,ZnH-2,ZnL-2.The adsorption rate of ZnH-2 strain was the highest,at 48.30%,Next was ZnL-2,the adsorption rate was 42.95%.Through the using conventional methods of bacterial identification,the 4 strains were identified from the two aspects of colony morphology,physiological and biochemical test, preliminary identification of 4 strains were bacillus(Bacillus.spp).

heavy metal pollution,strain screening,strain identificat,Zn2+

X53

A

1008-813X（2017）03-0087-03

10.13358 /j.issn.1008-813x.2017.03.23

2017-02-15

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目《生物炭固定化微生物對重金屬污染土壤的修復(fù)效應(yīng)研究》（ZD2017025）

楊卓（1980-），女，回族，河北秦皇島人，畢業(yè)于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)土壤學(xué)專業(yè)，博士，副教授，主要從事土壤重金屬污染與植物修復(fù)方面的研究。