房水中血管內(nèi)皮生長因子表達水平與黃斑水腫程度的相關(guān)性研究

朱妍 宋愈 黃黎黎

·臨床研究·

房水中血管內(nèi)皮生長因子表達水平與黃斑水腫程度的相關(guān)性研究

朱妍 宋愈 黃黎黎

目的 初步探討房水中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平與黃斑水腫程度是否正相關(guān)。方法 58例接受抗VEGF藥物治療的視網(wǎng)膜血管性疾病患者，包括增生期糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(CRVO)、視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞(BRVO)、視盤血管炎，相干光斷層掃描(OCT)及眼底血管熒光素造影(FFA)檢查證實合并黃斑水腫，記錄黃斑中心厚度。玻璃體腔注射抗VEGF藥物時獲取房水。采用VEGFElisa試劑盒，通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定房水中VEGF的濃度。統(tǒng)計學(xué)分析房水中VEGF水平與黃斑厚度是否存在正相關(guān)關(guān)系。結(jié)果 所有患者黃斑中心厚度在1102～197μm之間，均值(498.175±197.594)μm?；颊叻克械腣EGF濃度在112.7004～34.9411pg/ml之間，均值(78.971±15.743)pg/ml。統(tǒng)計學(xué)分析顯示房水中VEGF水平與黃斑中心厚度相關(guān)性系數(shù)為～0.219，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.102>0.05)。結(jié)論 房水中的VEGF濃度與黃斑中心厚度無明顯正相關(guān)關(guān)系?？赡艽嬖诙喾N機制參與黃斑水腫及影響水腫程度，其相互關(guān)系有待進一步研究。

血管內(nèi)皮生長因子；黃斑水腫；視網(wǎng)膜血管性疾病

[臨床眼科雜志，2017，25：137]

[J Clin Ophthalmol,2017,25:137]

視網(wǎng)膜血管性疾病是一類常見的致盲性眼病，臨床常見的包括糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)、視網(wǎng)膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion, RVO)、視網(wǎng)膜動脈阻塞(retinal artery occlusion, RAO)、視網(wǎng)膜血管炎等疾病。此類病變，常因視網(wǎng)膜長期缺血、缺氧導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平明顯升高，血管滲漏致黃斑囊樣水腫，并導(dǎo)致大量新生血管生成[1]。目前對視網(wǎng)膜血管性疾病導(dǎo)致黃斑水腫的進一步研究揭示， VEGF的大量表達在其中起到關(guān)鍵作用[2-5]。為此，本研究初步探討房水中VEGF表達水平與黃斑水腫的程度是否存在相關(guān)性，現(xiàn)將相關(guān)情況報告如下。

資料與方法

一、一般資料

2016年1月至2016年7月在我院眼科接受抗VEGF藥物治療的患者58例(58只眼)，其中增生期糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy, PDR)患者15例(15只眼)，女性6例，男性9例，年齡75～53歲；視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞(branch retinal vein occlusion , BRVO)患者31例(31只眼)，女性13例，男性18例，年齡73～41歲；視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(central retinal vein occlusion, CRVO)患者11例(11只眼)，女性5例，男性6例，年齡68～52歲。視盤血管炎患者1例(1只眼)，女性，年齡26歲。

入組患者均根據(jù)眼底熒光素血管造影(FFA)及相干光斷層成像(OCT)檢查，明確診斷為視網(wǎng)膜血管性疾病合并黃斑水腫，且無眼底激光光凝和其他眼部手術(shù)史，既往未曾接受任何抗VEGF藥物治療。本次研究經(jīng)我院倫理委員會討論批準，所有入選患者均簽署知情同意告知書，并能堅持隨訪。

二、術(shù)前檢查和相關(guān)準備

對所有患者進行常規(guī)的視力、眼壓、裂隙燈、眼底、眼部B型超聲、FFA檢查，排除眼部活動性炎癥疾病和高眼壓者。注藥當天進行OCT檢查測量黃斑中心厚度。同時進行全身情況如血常規(guī)、血糖、心電圖、血壓等檢查，評價是否能耐受玻璃體腔注藥手術(shù)。注藥前使用抗生素滴眼液滴眼5～7 d，每日3次。

三、獲取房水方法

使用鹽酸奧布卡因眼液表面麻醉患眼。嚴格按照內(nèi)眼手術(shù)規(guī)范進行消毒鋪巾。在注射抗VEGF藥物前，使用1 ml注射器于顳側(cè)角膜緣穿刺入前房，抽取房水約0.1～0.5 ml，撤針后角膜穿刺口自閉。隨后于顳上方角膜緣后3.5～4.0 mm，進行玻璃體腔注藥。注射結(jié)束后結(jié)膜囊內(nèi)涂抗生素眼膏。使用不含熱原和內(nèi)毒素的離心管收集抽取的房水，以離心半徑8.4 cm，15000 r/min離心10 min，保存于～70 ℃低溫冰箱中[6]。

四、VEGF檢測

1.檢測方法和原理：使用人VEGF Elisa 試劑盒(上海博谷生物科技有限公司，產(chǎn)品編號：HEV002) ，通過酶聯(lián)免疫吸附法測定房水中的VEGF片段。用VEGF 抗體包被微孔板，制成固相載體，實驗時依次在微孔板中加入標本及標準品，并加入HRP標記的VEGF抗原，標本及標準品中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合。反復(fù)洗滌后加底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化為藍色，再用硫酸終止反應(yīng)，轉(zhuǎn)變成黃色。標本中抗原量越多，結(jié)合在固相上的酶標抗原愈少，顏色越淺。顏色的深淺和樣品中的VEGF含量呈負相關(guān)。采用酶標儀在450 nm波長測定吸光度(OD 值)，根據(jù)標準曲線，計算測試樣品中VEGF 濃度。

2.檢測步驟：將房水標本在室溫下充分解凍均勻后，以1000×g離心15 min，收集上清液。依照標準品的順序分別加入100 μl的標準品溶液于空白微孔中，空白對照孔加入100 μl的蒸餾水，其余微孔中加入100 μl的待測樣本。標準品組、待測樣本組各孔中加入50 μl 的酶標溶液(空白對照孔除外)。酶標板用封板紙密封后，放入濕盒內(nèi)于37℃恒溫孵育1 h。用稀釋后的洗滌液注滿每孔，靜置15～30 s，充分清洗酶標板5次，用吸水紙徹底拍干。各孔加入顯色劑A液50 ul后，再加入顯色劑B液50ul。25～37 ℃下避光反應(yīng)10～15 min，加入50ul終止液。在450 nm波長讀取各孔的OD值。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

本研究統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS20.0軟件進行分析，變量間的相關(guān)性采用Person相關(guān)。P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、黃斑中心厚度(μm)

表1 58例患者黃斑中心厚度情況

黃斑中心厚度1102～197μm，均值(498.175±197.594)μm

二、房水中VEGF的濃度(pg/ml)

表2 58例患者房水VEGF濃度情況

房水中的VEGF濃度112.7004～34.9411pg/ml，均值(78.971±15.743)pg/ml

三、統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果

表3 房水中VEGF濃度與黃斑中心厚度

以上結(jié)果顯示房水中VEGF水平與黃斑中心厚度相關(guān)性系數(shù)為-0.219，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.102>0.05)。

討 論

VEGF是一種分泌型同型二聚體蛋白，它可以促進血管生成，增加血管壁的通透性，加重滲漏[7]，是促進血管新生最重要的誘導(dǎo)因子[8]?？筕EGF藥物通過抑制VEGF的表達，從而抑制眼部新生血管的形成，降低血管的通透性，減少血管滲漏，使視網(wǎng)膜血管性疾病引起的黃斑水腫減輕，為臨床治療黃斑水腫提供了一種新的方法[9，10]。近年來臨床關(guān)于VEGF的研究僅限于注藥前后黃斑區(qū)厚度、最佳矯正視力、眼壓等變化的研究，本研究則通過檢測房水內(nèi)VEGF濃度，了解VEGF水平與黃斑水腫程度是否存在正相關(guān)關(guān)系。

以往的實驗結(jié)果顯示前房內(nèi)細胞因子與玻璃體中的成正相關(guān)[11-14]。Miller等[15]研究猴RVO模型發(fā)現(xiàn)，房水中VEGF升高，而血清中未檢測出VEGF， 因此認為房水中VEGF來源于缺血視網(wǎng)膜釋放到玻璃體中的VEGF，而不可能來源于血液。理論上，玻璃體腔注藥的同時，需先抽取少量玻璃體液，維持眼壓平衡。但在實際操作中玻璃體液抽取困難，難以獲得足量的研究標本。而且可能出現(xiàn)玻璃體積血、視網(wǎng)膜損傷等并發(fā)癥。而前房穿刺獲取房水更安全、有效，對患者的損傷更小，并可以穩(wěn)定注藥后的眼壓。故本研究通過前房穿刺獲取房水標本進行VEGF檢測。

更多的臨床試驗表明，用抗VEGF藥物治療DR可有效提高視力和減輕黃斑水腫[9，16]。但至今并沒有相關(guān)文獻證實人眼房水中VEGF濃度與黃斑區(qū)厚度是否存在一定的相關(guān)性。本研究通過對房水中VEGF濃度與注射前黃斑區(qū)厚度相關(guān)性的分析，發(fā)現(xiàn)兩者間并不存在明確相關(guān)性。分析可能存在以下幾個原因。首先，多種細胞因子在視網(wǎng)膜血管性疾病的發(fā)病過程中起重要作用。其中包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 、胰島素樣生長因子-1(IGF-1) 、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) 、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β) 、腫瘤壞死因子-α(TNF-α) 及色素上皮衍生因子(PEDF) 等。VEGF是目前已知最直接作用于眼內(nèi)的新生血管形成因子，它能特異性的作用于視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞。IGF-1可以促進細胞的增生和分化，同時可以激活VEGF，促進新生血管的形成[17]。bFGF可以強力促進血管生成。TGF-β促進內(nèi)皮細胞黏附、增生及細胞外基質(zhì)沉積[18]，從而促進視網(wǎng)膜血管新生。TNF-α可提高目標細胞對TGF-β、VEGF及IGF-1等的反應(yīng)性，促進血管新生及成纖維組織增生。PEDF是目前已知的最有效的血管增生抑制劑之一[19]。其次，原發(fā)疾病是否得到控制以及病程長短都對眼內(nèi)VEGF濃度及黃斑水腫程度起到重要影響。伍春榮等[20]認為2型糖尿病并發(fā)PDR與糖尿病病程、尿白蛋白含量、空腹血糖、糖化血紅蛋白和血壓水平增高有關(guān)。其中病程、尿白蛋白含量和空腹血糖水平是影響PDR發(fā)病的危險因素。眼內(nèi)本身存在一定程度的VEGF，它在色素上皮細胞(retinalpigmentepithelium,RPE)、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、睫狀上皮細胞、Müller細胞、內(nèi)皮細胞均有表達[21]。然而只有增高的VEGF水平可以使視網(wǎng)膜血管產(chǎn)生病理性改變，引起玻璃體積血和視網(wǎng)膜新生血管等[10，21，22]。對于個體VEGF高表達而導(dǎo)致病理性改變的濃度閾值和時間閾值，還缺乏相關(guān)研究。

本研究初步顯示房水中的VEGF濃度與黃斑中心厚度無明顯正相關(guān)關(guān)系，但由于收集病例數(shù)有限，有待長期臨床觀察和進一步探討。同時，參與黃斑水腫及影響水腫程度的多種機制仍待進一步研究。

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(收稿：2016-09-10)

Relationship between aqueous humor vascular endothelial growth factor level and macular edema

ZhuYan,SongYu,HuangLili.

DepartmentofOphthalmology,NantongFirstPeople’sHospital,Nantong,Jiangsu226001,China

Objective To investigate whether the level of vascular endothelial growth factor (VEGF) in aqueous humor is positively correlated with the degree of macular edema.Methods 58 patients with retinal vascular diseases, including proliferative diabetic retinopathy (PDR), central retinal vein occlusion (CRVO), branch retinal vein occlusion (BRVO) and optic disc vasculitis

anti VEGF treatment. Optical coherence tomography (OCT) and fundus fluorescein angiography (FFA) were used to confirm macular edema. Aqueous humor was obtained during the vitreous cavity injection of anti VEGF drugs. Human vascular endothelial growth factor (VEGF) ELISA kit was used to determine the concentration of VEGF. Statistical analysis of the relationship between VEGF levels in the aqueous humor and macular thickness. Results All patients with macular center thickness between 197～1102 μm, with mean 498.175±197.594 μm. VEGF concentration in the aqueous humor was between 34.9～112.7 pg/ml, mean 79.0±15.7 pg/ml. Statistical analysis showed that the correlation coefficient between VEGF level and macular central thickness was -0.219, but there was no statistical significance (P=0.102>0.05). Conclusions There was no positive correlation between the concentration of VEGF in the aqueous humor and the thickness of the macular. There may be many mechanisms involved in macular edema and the degree of edema, and the relationship between them needs to be further studied.

Vascular endothelial growth factor(VEGF); Macular edema; Retinal vascular disease

10.3969/j.issn.1006-8422.2017.02.012

南通市青年科研基金項目(WQ2015014)

226001江蘇省南通市第一人民醫(yī)院眼科

宋愈(Email:195332410@qq.com)