同步檢測(cè)PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3的三重RT-qPCR方法的初步建立

胡加誼，羅志文，何 凡，李向宏，胡福初，范鴻雁，劉志昕，張治禮

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶果樹(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部海口熱帶果樹(shù)科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，海南省熱帶果樹(shù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571100；2.黃埔出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 廣州 510730；3.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所，海南 海口 571101)

同步檢測(cè)PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3的三重RT-qPCR方法的初步建立

胡加誼1，2，羅志文1，何 凡1，李向宏1，胡福初1，范鴻雁1，劉志昕3，張治禮1

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶果樹(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部海口熱帶果樹(shù)科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，海南省熱帶果樹(shù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571100；2.黃埔出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 廣州 510730；3.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101)

目前我國(guó)菠蘿產(chǎn)區(qū)已相繼報(bào)道3種菠蘿凋萎相關(guān)病毒(PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3)。通過(guò)建立這3種菠蘿凋萎相關(guān)病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(RT-qPCR)同步定量檢測(cè)方法，為菠蘿凋萎病毒的定性定量研究提供技術(shù)手段。根據(jù)這3種菠蘿凋萎相關(guān)病毒的外殼蛋白基因序列分別設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan水解探針，在優(yōu)化PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-qPCR反應(yīng)體系后，以PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3CP基因目的片段的重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，初步建立了PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-qPCR檢測(cè)方法。其中PMWaV-1標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.283logx+39.02，其擴(kuò)增效率達(dá)101.7%，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999；PMWaV-2標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.393logx+37.53，其擴(kuò)增效率為97.1%，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.998；PMWaV-3標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.171 logx+38.48，其擴(kuò)增效率為106.7%，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.996；這表明3種菠蘿凋萎相關(guān)病毒質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在同一反應(yīng)體系中可穩(wěn)定擴(kuò)增，且線性關(guān)系表現(xiàn)良好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。靈敏度試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，該方法對(duì)PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的最低檢測(cè)線分別為99，98，868拷貝；重復(fù)性試驗(yàn)表明PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-qPCR擴(kuò)增曲線的標(biāo)準(zhǔn)差小于0.267，變異系數(shù)小于1.44%。這表明建立的三重RT-qPCR檢測(cè)方法可快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定地定量檢測(cè)PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3等3種病毒，為PMWaV的定性定量研究和復(fù)合侵染機(jī)制的探索提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

菠蘿凋萎??；檢測(cè)方法；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR；PMWaV；TaqMan探針

菠蘿凋萎病是世界上主要菠蘿產(chǎn)區(qū)最為嚴(yán)重的病害之一，也是中國(guó)最嚴(yán)重的菠蘿病害之一，調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國(guó)海南、廣東、廣西等菠蘿主產(chǎn)區(qū)均有MWP發(fā)生，在發(fā)病嚴(yán)重的菠蘿園中，植株發(fā)病率可達(dá)60%，造成25%～30%的經(jīng)濟(jì)損失。菠蘿凋萎相關(guān)病毒(Pineapplemealybugwiltassociatedvirus，PMWaV)為菠蘿凋萎病的主要致病因子，屬于長(zhǎng)線形病毒科(Closteroviridae)葡萄卷葉病毒屬(Ampelovirus)[1-2]。目前，世界各地學(xué)者已從菠蘿植株中發(fā)現(xiàn)了5種PMWaV[3]，李運(yùn)河等和吳麗亭等[4-5]在對(duì)廣東、廣西和海南等地的菠蘿樣品檢測(cè)中僅發(fā)現(xiàn)PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3，而PMWaV-4 和PMWaV-5僅分別報(bào)道于夏威夷、澳大利亞[6-7]。澳大利亞的Gambley等[7]的研究發(fā)現(xiàn)PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3與菠蘿凋萎病均存在一定的相關(guān)性，且PMWaV-3與菠蘿凋萎病的相關(guān)性明顯高于PMWaV-1和PMWaV-2，而PMWaV-2早已被證明是MWP的病原之一，它與菠蘿粉蚧共同作用引起菠蘿凋萎病[8]；此外，有研究表明，PMWaV-1陽(yáng)性菠蘿植株的平均單果重明顯降低、早熟果比率上升，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致30%的田間損失[9]。由此可見(jiàn)，PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3對(duì)MWP發(fā)生和危害均有著重要影響，果樹(shù)種質(zhì)資源與遺傳育種研究室對(duì)海南田間的菠蘿樣品檢測(cè)結(jié)果表明MWP樣品存在明顯的復(fù)合侵染現(xiàn)象。目前，基于單一PMWaV檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用屢見(jiàn)報(bào)道，包括免疫電鏡、血清學(xué)方法、普通RT-PCR[6]方法和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(RT-qPCR)方法[10-12]；也有一些學(xué)者針對(duì)幾種不同PMWaV建立起可同步檢測(cè)幾種PMWaV的方法，羅志文[13]也建立了可以同步檢測(cè)PMWaV-1、PMWaV-2和PBCoV的三重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)。然而，可同時(shí)檢測(cè)并定量多種PMWaV的檢測(cè)方法在國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道，鑒于菠蘿凋萎病對(duì)我國(guó)菠蘿產(chǎn)業(yè)造成較大損失和病毒的快速定量檢測(cè)對(duì)無(wú)毒種苗篩選過(guò)程的重要性，本研究針對(duì)目前在我國(guó)屢見(jiàn)報(bào)道的PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3，并以海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶果樹(shù)研究所基地的菠蘿凋萎病陽(yáng)性樣品作為研究對(duì)象，針對(duì)病毒CP基因序列設(shè)計(jì)引物和探針，通過(guò)制備重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，初步建立并優(yōu)化了PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的三重RT-qPCR檢測(cè)方法，以期為菠蘿無(wú)毒種苗繁育產(chǎn)業(yè)發(fā)展和菠蘿凋萎病毒復(fù)合侵染作用機(jī)制的揭示打下扎實(shí)的技術(shù)鋪墊。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2013年5月-2014年6月在海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶果樹(shù)研究所和中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所進(jìn)行。

1.1.1 病毒材料 試驗(yàn)中用于建立PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的三重RT-qPCR檢測(cè)方法所用的PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3陽(yáng)性菠蘿植株材料均由海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶果樹(shù)研究所提供。

1.1.2 主要試劑 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒(Bioteke公司)、反轉(zhuǎn)錄酶(TransGen公司)、Trans5αCell(TransGen 公司)；pMD18-T 載體(TaKaRa公司)、TaqDNA 聚合酶(TaKaRa公司)、Real Master Mix(Prob)(TaKaRa 公司)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(AXYGEN)、質(zhì)粒提取試劑盒(AXYGEN公司)。

1.1.3 主要設(shè)備 TP600 PCR 儀(TaKaRa公司)；MX3005 熒光PCR 儀(Stratagene公司)；NanoDrop ND-2000C 微量紫外分光光度計(jì)(Thermo公司)。

1.2 特異性引物和TaqMan探針的設(shè)計(jì)合成

根據(jù)GenBank中登錄的PMWaV-1CP基因序列的保守區(qū)域(登錄號(hào)為：HE983617、EU769114、JN995532、JN995531)、PMWaV-2CP基因序列的保守區(qū)域(登錄號(hào)為：HE983618、EU769116、JN995535、JN995534、DQ225114、JX645775、JN995533)和PMWaV-3CP基因序列的保守區(qū)域(登錄號(hào)為：JN995536、FJ209048)，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增3種病毒CP的特異性引物和TaqMan 水解探針，用于建立PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的三重RT-qPCR檢測(cè)方法。引物和探針均由上海生工合成。引物和探針序列見(jiàn)表1。

表1 PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR引物和探針

1.3 三重RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備

參考百泰克公司多糖多酚植物總RNA 快速提取試劑盒(離心柱型)的說(shuō)明書(shū)提取PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3陽(yáng)性菠蘿葉RNA和PMWaV-free菠蘿葉RNA，并參照康為世紀(jì)有限公司的TransScript Ⅱ Reverse Transcriptase說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，置于-20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆?。以PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3陽(yáng)性的cDNA為PCR擴(kuò)增模板，利用表1所列引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包含Trangen Taq(5 U/μL)0.2 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)1 μL，10 × PCR Buffer(含Mg2+)2 μL，上游引物(10 μm/μL)和下游引物(10 μm/μL)各0.5 μL，cDNA 1 μL和ddH2O 14.8 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸20 s，循環(huán)35次；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。

DNA凝膠回收試劑盒回收PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3CP基因的PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物連接pMD18-T 載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans5α Cell，然后根據(jù)3種病毒分別隨機(jī)挑取3個(gè)重組克隆，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，參照說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒，菌液送上海Invitrogen公司測(cè)序，并經(jīng)DNAMAN分析鑒定。利用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定陽(yáng)性重組質(zhì)粒的濃度，并根據(jù)公式C=A/B×6.02×1014(其中C代表質(zhì)粒濃度(單位為拷貝/μL)，A代表以O(shè)D260分析得到的濃度(單位為ng/μL)，B為質(zhì)粒DNA 的分子量)計(jì)算重組質(zhì)粒濃度的拷貝數(shù)，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 三重RT-qPCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

這個(gè)我很有體會(huì)。上周因?yàn)橹夤苎纵斠?，我插著針管還在用平板敲字，旁人看來(lái)一定覺(jué)得這個(gè)人真是自律啊，帶病還堅(jiān)持工作。其實(shí)，我能堅(jiān)持很大部分原因是寫(xiě)作真的是我非常渴望非常熱愛(ài)做的事。相比而言，我在減肥上的自控力就差很多了，剛剛發(fā)完毒誓要戒甜食，轉(zhuǎn)身就安慰自己，算了，吃飽了才有力氣減……

將分別含PMWaV-1，PMWaV-2和PMWaV-3CP基因目的片段的重組質(zhì)粒稀釋相同倍數(shù)，等比例混勻?yàn)榛旌腺|(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，并以此作為三重RT-qPCR反應(yīng)體系優(yōu)化的模板。根據(jù)單因子變量的原則，分別優(yōu)化三重實(shí)時(shí)RT-qPCR反應(yīng)體系中的探針濃度、引物濃度和緩沖液比例。反應(yīng)體系優(yōu)化設(shè)置見(jiàn)表2，選取三重RT-qPCR中擴(kuò)增曲線Ct值最小、熒光信號(hào)最強(qiáng)的使用濃度作為優(yōu)化結(jié)果。

表2 PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-qPCR檢測(cè)方法反應(yīng)體系優(yōu)化

1.5 構(gòu)建三重RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

將3種病毒目的基因的重組質(zhì)粒(其中，PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3濃度分別為0.990×109，0.980×108，0.868×108拷貝/μL)等比例混成三重質(zhì)粒模板，并用超純水以10倍的梯度，稀釋三重質(zhì)粒模板，按照1.4優(yōu)化后的三重RT-qPCR反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)，得出檢測(cè)3種菠蘿凋萎相關(guān)病毒的三重RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 三重RT-qPCR檢測(cè)方法的測(cè)評(píng)

1.6.1 抗干擾測(cè)評(píng)試驗(yàn) 將三重RT-qPCR擴(kuò)增體系按模板成分不同分為4組，第1組的模板為PMWaV-1CP目標(biāo)片段的重組質(zhì)粒(濃度：0.99×105拷貝/μL)，第2組的模板為PMWaV-2CP目標(biāo)片段的重組質(zhì)粒(濃度：0.98×105拷貝/μL)，第3組的模板為PMWaV-3CP目標(biāo)片段的重組質(zhì)粒(濃度：0.868×105拷貝/μL)，第4組的模板為混合質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(105倍稀釋的重組質(zhì)粒等比例混合)，按照1.4優(yōu)化的三重RT-qPCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增試驗(yàn)。

1.6.2 靈敏度測(cè)評(píng)試驗(yàn) 按照1.5所述步驟制備10倍梯度稀釋的三重質(zhì)粒模板，并按照1.4優(yōu)化后的三重RT-qPCR反應(yīng)體系在Mx3005熒光定量PCR儀上檢測(cè)，得出三重RT-qPCR對(duì)PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的最低檢測(cè)限。

1.6.3 重復(fù)性測(cè)評(píng)試驗(yàn) 利用1.5所述制備三重質(zhì)粒模板，并根據(jù)1.4優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，每個(gè)梯度的濃度均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，并根據(jù)各個(gè)RT-qPCR擴(kuò)增曲線的Ct值計(jì)算平均Ct值、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通RT-PCR檢測(cè)與重組質(zhì)粒測(cè)序

M.Marker DL2000；1.PMWaV-1 外殼蛋白擴(kuò)增片段；2.PMWaV-1 外殼蛋白擴(kuò)增陰性對(duì)照；3.PMWaV-1 外殼蛋白擴(kuò)增空白對(duì)照；4.PMWaV-2 外殼蛋白擴(kuò)增片段；5.PMWaV-2 外殼蛋白擴(kuò)增陰性對(duì)照；6.PMWaV-2 外殼蛋白擴(kuò)增空白對(duì)照；7.PMWaV-3 外殼蛋白擴(kuò)增片段；8.PMWaV-3 外殼蛋白擴(kuò)增陰性對(duì)照；9.PMWaV-3 外殼蛋白擴(kuò)增空白對(duì)照。M.Marker DL2000；1.PMWaV-1CPgene fragment；2.PMWaV-1 negative control；3.PMWaV-1 blank control；4.PMWaV-2CPgene fragment；5.PMWaV-2 negative control；6.PMWaV-2 blank control；7.PMWaV-3CPgene fragment；8.PMWaV-3 negative control；9.PMWaV-3 blank control.

圖1 PCR擴(kuò)增PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3 目的片段

Fig.1 Target fragment ofPMWaV-1，PMWaV-2，PMWaV-3amplificated by PCR

2.2 三重RT-qPCR反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

三重RT-qPCR檢測(cè)方法的優(yōu)化是為保證在同一反應(yīng)體系中可同時(shí)穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增3種菠蘿凋萎相關(guān)病毒CP基因的靶標(biāo)片段，從而實(shí)現(xiàn)同步、定量檢測(cè)3種菠蘿凋萎相關(guān)病毒。三重RT-qPCR反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果表明，在25 μL的三重RT-qPCR反應(yīng)體系中，當(dāng)Premix Ex Taq(2×)為13.0 μL，PMWaV-1 目的基因上下游各360 nmol/L，PMWaV-2目的基因上下游各440 nmol/L，PMWaV-3目的基因上下游各360 nmol/L，PMWaV-1、PMWaV-2 和PMWaV-3目的基因擴(kuò)增所用探針?lè)謩e為320，360，320 nmol/L時(shí)，3種病毒的CP基因目的片段均可穩(wěn)定擴(kuò)增(圖2)。

圖2 PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

2.3 三重RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度的log值為橫坐標(biāo)，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增曲線Ct值作為縱坐標(biāo)，以10倍梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行三重RT-qPCR檢測(cè)，根據(jù)不同的擴(kuò)增曲線構(gòu)建3種PMWaVs的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。其中，PMWaV-1擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線是y=-3.283logx+39.02，擴(kuò)增效率和線性擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線是y=-3.393logx+37.53，相關(guān)系數(shù)(R2)分別是101.7%和0.999；PMWaV-2擴(kuò)增效率和線性相關(guān)系數(shù)(R2)分別是97.1%和0.998；PMWaV-3擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線是y=-3.171logx+38.48，擴(kuò)增效率和線性相關(guān)系數(shù)(R2)分別是106.7%和0.996。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3的CP基因目的片段均可在同一反應(yīng)體系中穩(wěn)定擴(kuò)增，且線性相關(guān)系數(shù)表現(xiàn)良好，可信度較高，可用于進(jìn)一步的相關(guān)試驗(yàn)。

圖3 PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建

2.4 三重RT-qPCR檢測(cè)方法的測(cè)評(píng)結(jié)果

2.4.1 抗干擾性測(cè)評(píng)結(jié)果 三重RT-qPCR抗干擾試驗(yàn)結(jié)果表明，在三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系中只加入單一病毒目的基因的重組質(zhì)粒模板和同時(shí)加入3種病毒目的基因的重組質(zhì)粒模板進(jìn)行檢測(cè)，相同病毒在不同反應(yīng)體系下的擴(kuò)增曲線都較為接近(圖4)，而Ct值差距均在1.48之內(nèi)(表3)。

2.4.2 靈敏度測(cè)評(píng)結(jié)果 實(shí)時(shí)熒光定量研究中，當(dāng)Ct值大于35時(shí)，定量檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，可視為陰性14-15，所以，由圖5可以看出，三重RT-qPCR檢測(cè)方法對(duì)PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3的最低檢測(cè)限分別為99，98，868拷貝/μL(圖5)。這表明本研究初步建立的三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3都具有良好的靈敏度。

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法抗干擾試驗(yàn)

表3 三重RT-qPCR檢測(cè)方法抗干擾試驗(yàn)數(shù)據(jù)

Tab.3 The anti-interference test data of triple RT-qPCR

試驗(yàn)?zāi)０?Template Ct值(PMWaV-1檢測(cè))CtofdetectingPMWaV-1Ct值(PMWaV-2檢測(cè))CtofdetectingPMWaV-2Ct值(PMWaV-3檢測(cè))CtofdetectingPMWaV-3pMDTM-18T-PMWaV-1-CP19.41--pMDTM-18T-PMWaV-2-CP-17.71-pMDTM-18T-PMWaV-3-CP--20.28混合質(zhì)粒模板(3種病毒)19.5418.5318.80Mixedplasmidtemplate(3PMWaVs)

圖5 三重RT-qPCR檢測(cè)方法的靈敏度試驗(yàn)

2.4.3 重復(fù)性 三重RT-qPCR檢測(cè)方法重復(fù)性試驗(yàn)的結(jié)果表明，試驗(yàn)設(shè)置的3個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度的3次重復(fù)中，含PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3目的片段的三重混合質(zhì)粒模板均能獲得穩(wěn)定擴(kuò)增。由表4可見(jiàn)，RT-qPCR擴(kuò)增曲線Ct值的分析結(jié)果表明，三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增曲線的Ct值標(biāo)準(zhǔn)差(SD)都在0.267以?xún)?nèi)，變異系數(shù)(CV)都在1.44%以?xún)?nèi)，這說(shuō)明本研究建立的三重實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法穩(wěn)定性良好。

3 討論與結(jié)論

3.1 PMWaV檢測(cè)技術(shù)

PMWaV是菠蘿凋萎病的主要病原物之一，為減少菠蘿凋萎病造成的田間損失，專(zhuān)家學(xué)者們針對(duì)PMWaV研發(fā)出一系列檢測(cè)手段，包括免疫電鏡檢測(cè)[16]、酶聯(lián)免疫吸附[17]、組織免疫印記[18]和RT-PCR等方法。相對(duì)于前人的研究只專(zhuān)注于病毒的定性分析和單一病毒的定量分析，本研究建立的三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法不僅可在同一反應(yīng)體系中同時(shí)定性檢測(cè)PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3，還可根據(jù)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)3種病毒進(jìn)行定量分析。根據(jù)文獻(xiàn)檢索結(jié)果，本研究首次報(bào)道同步定量檢測(cè)PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3的三重RT-PCR方法，為PMWaV的定性定量分析提供技術(shù)基礎(chǔ)，也豐富了PMWaV的檢測(cè)技術(shù)體系。

表4 PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法重復(fù)性試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3.2 多重RT-qPCR反應(yīng)體系優(yōu)化

多重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)是指可在同一反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增數(shù)個(gè)不同的片段，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同種類(lèi)的植物病毒進(jìn)行同步定性定量分析。反應(yīng)體系的優(yōu)化是多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法建立的關(guān)鍵技術(shù)之一，因?yàn)樵谕粋€(gè)反應(yīng)體系里同時(shí)擴(kuò)增不同的靶標(biāo)片段，這一反應(yīng)體系里不僅需要常規(guī)PCR中的反應(yīng)因子(如DNA聚合酶、緩沖液、dNTPs等)，還需要在這一反應(yīng)體系中具有不同目標(biāo)基因片段的不同模板，還有針對(duì)各個(gè)靶標(biāo)基因的引物和探針等。同一反應(yīng)體系中多個(gè)引物和探針形成二聚體或發(fā)卡結(jié)構(gòu)的概率明顯增高，而多重RT-qPCR的擴(kuò)增效率也易被影響。郭立新等[19]在試驗(yàn)中優(yōu)化了實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板、Mg2+、引物和探針等因子的使用濃度，使其更有效的應(yīng)用于蘋(píng)果莖溝病毒的定量、定性檢測(cè)。Henegariu等[20]通過(guò)多個(gè)試驗(yàn)研究PCR反應(yīng)因子(包括使用濃度、退火溫度等)對(duì)多重PCR的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)引物的濃度、緩沖液用量和退火溫度等因子均對(duì)多重PCR的反應(yīng)效率有影響。Johnson等[21]在建立同步定量檢測(cè)番茄細(xì)菌性潰瘍病病原菌和鳳果花葉病毒的雙重qPCR技術(shù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)引物和探針使用濃度比例對(duì)目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率影響較大，而探針濃度對(duì)目標(biāo)片段的擴(kuò)增效率沒(méi)有影響，但是探針與引物濃度的比率對(duì)擴(kuò)增效率影響很大。參照前人的研究策略，本研究在建立PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-qPCR檢測(cè)方法的過(guò)程中，著重優(yōu)化了三重RT-qPCR反應(yīng)體系中的探針濃度、緩沖液濃度和引物濃度。優(yōu)化后的三重RT-qPCR反應(yīng)體系可穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增目標(biāo)病毒的靶標(biāo)片段，且3種病毒目標(biāo)片段的擴(kuò)增效率均符合Arezi等[22]提出的合理擴(kuò)增效率(80%～115%)，可用于同步定量檢測(cè)PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3。

本研究根據(jù)PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3的CP基因分別設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針(攜帶不同熒光標(biāo)記)，通過(guò)制備重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和優(yōu)化反應(yīng)體系，初步建立PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-qPCR檢測(cè)方法，可用于PMWaV-1、PMWaV-2，PMWaV-3 3種病毒快速同步定量檢測(cè)。本方法的初步建立可為菠蘿無(wú)毒種苗生產(chǎn)過(guò)程中的病毒快速定性定量檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)一步研發(fā)和改進(jìn)提供試驗(yàn)基礎(chǔ)，也可為菠蘿凋萎病毒復(fù)合侵染作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提供技術(shù)支持。

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Establishment of a Triple RT-qPCR Method for the Simultaneous Detecting ofPMWaV-1，PMWaV-2 andPMWaV-3

HU Jiayi1，2，LUO Zhiwen1，HE Fan1，LI Xianghong1，HU Fuchu1，F(xiàn)AN Hongyan1，LIU Zhixin3，ZHANG Zhili1

(1.Institute of Tropical Fruit Trees in Hainan Academy of Agricultural Sciences，Haikou Investigation Station of Tropical Fruit Trees in Ministry of Agriculture，Key Laboratory of Tropical Fruit Tree Biology of Hainan Province，Haikou 571100，China；2.Huangpu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureua，Guangzhou 510730，China；3.Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101，China)

The objective of this paper was to provide a technique for quantitative and quanlitative studies of PMWaV by establishing the method of Real-time Fluorescent Quantitative RT-PCR(RT-qPCR)for simultaneous quantitative detection ofPMWaV-1，PMWaV-2 andPMWaV-3.Primers and probes were designed and synthesized according to theCPgene ofPMWaV-1，PMWaV-2 andPMWaV-3，respectively.After optimized the reaction system of triple RT-qPCR，the standard curves were generated by purified DNA of the recombined plasmid ofPMWaV-1，PMWaV-2，PMWaV-3 coat protein gene，respectively.And the method of RT-qPCR for the simultaneous detection ofPMWaV-1，PMWaV-2，PMWaV-3 had been improved.The amplification efficiency ofPMWaV-1，PMWaV-2，PMWaV-3 in the RT-qPCR method was up to 101.7%，97.1%，106.7%，respectively.Meanwhile ，with theR2between 0.996 and 0.999.The sensibility test of triple RT-qPCR syetem showed the detection limit of quantification forPMWaV-1，PMWaV-2，PMWaV-3 was 99，98 and 868 copies，respectively.Moreover，repeats experiment datas showed that standard deviation was below 0.26 and variable coefficient was below 1.44%.This study indicated that the method for simultaneous detection and quantification ofPMWaV-1，PMWaV-2，PMWaV-3 was a fast，sably and sensitive reaction system，which could be the technological base for quantitative and quanlitative studies ofPMWaV.

Mealybug Wilt of Pineapple；Dctection method；RT-qPCR；PMWaV；TaqMan probe

2017-01-20

海南省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目(ZDYF2016035)； 公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201203021)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260460)

胡加誼(1988-)，男，廣東梅州人，研究實(shí)習(xí)員，碩士，主要從事果樹(shù)植物病理學(xué)研究。

張治禮(1970-)，男，安徽臨泉人，研究員, 博士，主要從事果樹(shù)生理與分子生物學(xué)研究。

S432.4；Q78

A

1000-7091(2017)02-0038-07

10.7668/hbnxb.2017.02.003