牡丹DNA甲基結(jié)合域蛋白基因PsMBD5的克隆和表達(dá)特性分析

司福會，張玉喜，劉春英，蓋偉玲，戰(zhàn)新梅，蓋樹鵬

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東省高校植物生物技術(shù)重點實驗室，山東 青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與植保學(xué)院，山東 青島 266109)

牡丹DNA甲基結(jié)合域蛋白基因PsMBD5的克隆和表達(dá)特性分析

司福會1，張玉喜1，劉春英1，蓋偉玲2，戰(zhàn)新梅1，蓋樹鵬1

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東省高校植物生物技術(shù)重點實驗室，山東 青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與植保學(xué)院，山東 青島 266109)

前期通過轉(zhuǎn)錄組結(jié)合表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)一類MBD片段在低溫解除牡丹花芽內(nèi)休眠中的差異表達(dá)，為了進(jìn)一步研究MBD基因特征及其在牡丹休眠解除中的作用，利用RACE擴(kuò)增獲得1 204 bpPsMBD5全長cDNA，其中編碼框1 056 bp，推測編碼351個氨基酸。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，PsMBD5蛋白分子量約為38.127 4 kDa，等電點為5.14，不穩(wěn)定系數(shù)為44.27，推測該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。同源性分析表明，牡丹PsMBD5與梅PmMBD5的同源性最高，為38.1%，與亞麻薺CsMBD5的同源性最低，為25.8%，與13種擬南芥MBD蛋白同源性最高的是AtMBD5。實時熒光定量PCR分析表明，PsMBD5基因在牡丹不同組織中均有表達(dá)，在初花期牡丹的根中轉(zhuǎn)錄水平最高，在花瓣、心皮和萼片中次之，在雄蕊中最低；PsMBD5基因在牡丹花芽中受低溫誘導(dǎo)，且轉(zhuǎn)錄水平在低溫處理14 d時達(dá)到最大值，之后維持較高的轉(zhuǎn)錄水平。研究結(jié)果為進(jìn)一步解析PsMBD5基因?qū)δ档せㄑ康男菝呓獬恼{(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

PsMBD；RACE；生物信息學(xué)分析；表達(dá)特性

DNA甲基化現(xiàn)象是DNA主要的一種表觀遺傳修飾，在植物的生長發(fā)育、花芽分化、非生物脅迫、基因組防御、基因表達(dá)調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用[1]。DNA甲基結(jié)合域(Methyl-binding domain，MBD)蛋白是一類轉(zhuǎn)錄因子，與甲基化DNA結(jié)合有關(guān)，在DNA甲基化依賴的基因調(diào)控過程中起作用[2]。近年來，表觀遺傳中的DNA甲基化和MBD研究已成熱點。擬南芥中已經(jīng)鑒定出13個具有MBD結(jié)構(gòu)域的蛋白，其中MBD5、MBD6和MBD7能夠特異性結(jié)合不同數(shù)量的CpG核苷酸的甲基化序列，而AtMBD5蛋白能夠特異性結(jié)合甲基化的CG和CHH序列，不能夠結(jié)合甲基化的CHG序列[3-4]。多個MBD基因參與生長發(fā)育的調(diào)控[5-6]，mbd9突變體植株的發(fā)育異常，開花時間提前[7]；超表達(dá)SlMBD5導(dǎo)致番茄果實色素合成增加，植株矮化[8]；AtMBD7參與DNA的去甲基化過程，降低植株甲基化水平[9-10]，小麥中TaMBD6基因受春化作用誘導(dǎo)，促進(jìn)淀粉積累量增加[11]。關(guān)于牡丹MBD轉(zhuǎn)錄因子的研究目前尚未見報道。

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)為毛茛科、芍藥屬植物，素有“花中之王”的美譽(yù)。解除花芽休眠是牡丹順利開花的前提[12]。牡丹生物學(xué)課題組前期通過轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)一個可能的MBD片段在低溫解除休眠中差異表達(dá)[13-14]，另外還發(fā)現(xiàn)低溫解除休眠進(jìn)程中DNA甲基化水平是下降的[15]，表明表觀遺傳修飾在休眠解除中發(fā)揮了作用。目前仍不清楚該基因是否參與了休眠解除的調(diào)控。本研究利用RACE擴(kuò)增得到PsMBD5基因的完整cDNA序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。實時定量PCR分析了PsMBD5基因組織表達(dá)特性和休眠解除中的表達(dá)模式，研究結(jié)果為進(jìn)一步解析PsMBD5基因的功能及牡丹花芽內(nèi)休眠解除的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為生長健壯的四年生牡丹品種魯荷紅(PaeoniasuffruticosaLuhehong)，購自菏澤牡丹研究所。2015年11月10日移入4 ℃恒溫的冷庫中進(jìn)行低溫處理，分別在0(對照)，7，14，21，28 d處理后取飽滿一致的芽投入液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。取初花期牡丹的營養(yǎng)器官(根、莖和葉)和花器官(萼片、苞片、花瓣、雄蕊和心皮)，立即投入液氮中速凍后，-80 ℃保存。3個重復(fù)，每重復(fù)3個花芽或組織。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

采用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa，大連)提取總RNA，-80 ℃保存。cDNA的合成按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒(TaKaRa，大連)說明書進(jìn)行。RACE-ready-cDNA第一鏈合成按照SMARTer?RACE 5′/3′ Kit試劑盒(Clontech)步驟進(jìn)行。

1.3 RACE擴(kuò)增和實時定量PCR

根據(jù)已知序列設(shè)計基因特異性引物PsMBD5′和PsMBD3′(表1)，分別進(jìn)行5′和3′RACE擴(kuò)增。RACE擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s、72 ℃ 3 min，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s、72 ℃ 3 min，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 3 min，25個循環(huán)。

將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈反應(yīng)液用EASY dilution(TaKaRa，大連)稀釋3倍后作為實時定量PCR模板，其反應(yīng)體系(20 μL)包含2×SYBR Premix Dimer EraserTM10 μL(TaKaRa，大連)，正向引物和反向引物(10 μmol/L)各0.6 μL，cDNA模板2 μL，RNase Free dH2O 6.8 μL，每個樣品3個重復(fù)。反應(yīng)在安捷倫實時熒光定量PCR儀(M×3000P)上進(jìn)行。反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。Actin為內(nèi)參(引物見表1)[16]，數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT法[17]。

表1 相關(guān)引物信息

1.4 生物信息學(xué)分析

測序結(jié)果用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行序列分析、拼接，將拼接序列翻譯的蛋白質(zhì)序列利用Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行蛋白質(zhì)Blast比對。蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、等電點的預(yù)測、信號肽的分析以及核定位信號的預(yù)測所運用的方法參考石紅梅等[18]。利用ClustalW分析了PsMBD5與其他MBD蛋白的同源性。系統(tǒng)發(fā)生樹利用MEGA 4軟件中的鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建，置信度檢驗設(shè)置為Bootstrap=1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 PsMBD5基因的全長cDNA及推測編碼的氨基酸

利用基因特異性引物PsMBD5′和PsMBD3′進(jìn)行RACE擴(kuò)增，如圖1所示，5′ RACE PCR產(chǎn)物為876 bp，3′RACE PCR產(chǎn)物為330 bp。測序后利用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行序列拼接(圖2)，獲得1 204 bpPsMBD5基因的全長cDNA(GenBank accession number：KX517491)，完整的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)1 056 bp，3′非編碼區(qū)(Untranslated region，UTR)146 bp。利用NCBI在線Blast發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列中217-271氨基酸(E-value為4.21e-11)序列為MBD保守結(jié)構(gòu)域。

M.DL2000 分子量Marker；5′.5′ RACE；3′.3′ RACE。M.DL2000 molecular Marker；5′.5′ RACE；3′.3′ RACE.

2.2 PsMBD5基因生物信息學(xué)分析

PsMBD5基因的完整編碼區(qū)推測編碼351個氨基酸，其分子式為C1682H2603N463O535S8，分子量為38.127 4 kDa，理論等電點pI為5.14；不穩(wěn)定指數(shù)為44.27(40以下為穩(wěn)定蛋白)，推測該蛋白為不穩(wěn)定蛋白；絲氨酸的含量最高為10.5%，其次是脯氨酸占9.4%，甘氨酸占8.8%，纈氨酸占8.5%；總平均疏水指數(shù)為-0.566，表明其為親水性蛋白。信號肽預(yù)測結(jié)果表明，其不具有信號肽序列，表明其不是分泌性蛋白。推測在蛋白的第191-201位(RRGRKRKSEKM)和第286-295位(GGRKRKKSVP)存在核定位信號。

2.3 PsMBD5蛋白序列的同源性分析

利用ClustalW軟件將PsMBD5與其他已知植物的MBD蛋白進(jìn)行同源比對，結(jié)果表明，PsMBD5與其他已知植物MBD蛋白的相似性為25.8%～38.1%，其中與梅的PmMBD5蛋白相似性最高，為38.1%，與亞麻薺CsMBD5蛋白同源性最低，為25.8%。與13種擬南芥MBD蛋白同源性最高的是AtMBD5，相似性為32.97%。利用MEGA 4軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，PsMBD5與多種生物的MBD5聚在一起，據(jù)此命名了該基因。

用加粗斜體表示起始密碼子和終止密碼子；polyA尾用雙下劃線表示；PsMBD保守區(qū)用波浪線表示；核定位信號NLS以單下劃線表示。

Bold italic.Initiation codon and terminate codon；Double underline.polyA tail；Wavy line.Conservative regions；Single underline.The nuclear localization signal NLS.

圖2 牡丹PsMBD5基因拼接得到的cDNA全長序列及其編碼的氨基酸序列

Fig.2 Nucleotide sequence of tree peonyPsMBD5 cDNA sequence and encoding amino acid sequence

梅.PmMBD5；蘋果.MdMBD5；棗.ZjMBD5；葡萄.VvMBD5；牡丹.PsMBD5；可可樹.TcMBD5；擬南芥.AtMBD；亞麻薺.CsMBD5；胡楊.PeMBD5；麻風(fēng)樹.JcMBD5。

2.4 PsMBD5基因的表達(dá)模式

利用實時定量PCR分析PsMBD5基因在牡丹初花期各組織(根、莖、葉片、萼片、苞片、花瓣、雄蕊和心皮)的表達(dá)特性(圖4)，結(jié)果顯示，PsMBD5基因在根中的表達(dá)量最高，在花瓣、心皮和萼片中表達(dá)量較高，在雄蕊中最低。

利用實時定量PCR分析了PsMBD5基因在不同人工低溫處理時間(0，7，14，21，28 d)牡丹花芽的表達(dá)模式(圖5)。結(jié)果表明，低溫處理條件下，PsMBD5基因的表達(dá)水平均高于對照，可見該基因受低溫誘導(dǎo)。低溫處理14 d時達(dá)最大值，此時花芽休眠接近解除狀態(tài)，移入溫室后有較高萌發(fā)率[8，12]；之后表達(dá)水平迅速降低。這一結(jié)果暗示著PsMBD5基因可能參與牡丹內(nèi)休眠解除的調(diào)控。

圖4 牡丹PsMBD5基因在初花期不同組織中的表達(dá)

圖5 牡丹PsMBD5在牡丹花芽休眠進(jìn)程中的表達(dá)

3 討論

甲基結(jié)合蛋白(MBD)是與甲基化DNA結(jié)合的反式作用因子，在植物生長發(fā)育過程中起調(diào)控作用。通過牡丹定制芯片分析發(fā)現(xiàn)一可能的MBD片段在低溫誘導(dǎo)的休眠解除中差異表達(dá)[12]。本研究擴(kuò)增得到了其全長cDNA，含保守的MBD結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果將其命名為PSMBD5基因。其推測蛋白的第191-201位(RRGRKRKSEKM)和第286-295位(GGRKRKKSVP)存在核定位信號，可能與其在細(xì)胞核的執(zhí)行功能有關(guān)，與報道的核定位結(jié)果一致[4，8，19]。

據(jù)報道，MBD基因的表達(dá)具有組織偏好性，AtMBD11在花芽、葉、根、種子、莖中都有較高水平的表達(dá)[7]，玉米MBD114在根尖和幼苗中表達(dá)，MBD120在葉中表達(dá)[20]，MBD101在根尖、葉片和小穗中表達(dá)[21]。本研究對PsMBD基因的組織表達(dá)特異性分析表明，在牡丹初花期的幼根中表達(dá)量最高，其次為花瓣、心皮和萼片中，與AtMBD5的表達(dá)相似[4]，推測牡丹PsMBD5基因在根的生長發(fā)育和花器官的發(fā)育中起到重要的作用。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，MBD5不僅參與染色體重塑，還在細(xì)胞分裂中發(fā)揮了重要作用。Yano等[22]推測MBD5可能通過結(jié)合甲基化的DNA序列，招募RAN3蛋白，促進(jìn)染色體的移動而促進(jìn)細(xì)胞分裂。番茄中超表達(dá)SlMBD5基因?qū)е挛闯墒旆压麑嵣睾吭黾樱仓臧凸麑嵶冃8]。牡丹PsMBD5基因的表達(dá)量在低溫處理14 d迅速達(dá)到最大值(表達(dá)上升了約3 500倍)，此時是休眠解除的臨界期，花芽內(nèi)分裂細(xì)胞數(shù)目增多。推測低溫通過某種方式激活了PsMBD5基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)胞分裂，導(dǎo)致休眠的解除。因而，PsMBD5基因可能參與了牡丹內(nèi)休眠的調(diào)控，深入研究PsMBD5基因與低溫解除休眠中細(xì)胞分裂的關(guān)系，對闡明其調(diào)控休眠解除機(jī)制具有重要意義。

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Cloning and Expression Pattern of DNA Methyl-binding Domain GenePsMBD5 in Tree Peony

SI Fuhui1，ZHANG Yuxi1，LIU Chunying1，GAI Weiling2，ZHAN Xinmei1，GAI Shupeng1

(1.College of Life Sciences，Qingdao Agricultural University，Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province，Qingdao 266109，China；2.College of Agronomy and Plant Protection，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China)

The previous results of the transcriptome and expression profiling analysis in tree peony found that aMBD-like fragment was differentially expressed during low temperature induced dormancy release.To investigate the characteristic and putative function ofMBDduring tree peony bud dormancy release，total 1 204 bp full length cDNA ofPsMBD5 was obtained by RACE amplification.The coding fame of 1 056 bp encoded 351 amino acids.The result of bioinformatics analysis showed that the molecular weight of PsMBD5 was 38.127 4 kDa，isoelectric point was 5.14，which indicated that PsMBD5 was an unstable hydrophilic.The result of homology analysis indicated that the similarity between the PsMBD5 and PmMBD5 was the highest with 38.1% identity，and CsMBD5 was the lowest with 25.8%.When compared with 13 kinds of AtMBD，the identity between the PsMBD5 and AtMBD5 was the highest.The expression patterns were analyzed by Real-time quantitative PCR，and the results showed that the transcript level ofPsMBD5 at the early stage of flowering in root was the highest，followed by in petals，carpel and sepals，and in stamen was the lowest.During the whole process of chilling fulfillment，PsMBD5 was highly induced by low temperature.The transcript level ofPsMBD5 was the highest after 14 d chilling fulfillment，and maintained a high level of transcription after that.These results would provide theoretical basis to validate the regulation mechanism ofPsMBD5 during the peony bud dormancy release.

PsMBD；RACE；Bioinformatics analysis；Expression pattern

2017-01-06

國家自然基金面上項目(31471908；31372104)

司福會(1990-)，女，山東菏澤人，在讀碩士，主要從事牡丹分子生物學(xué)研究。

蓋樹鵬(1974-)，男，山東萊陽人，教授，博士，主要從事牡丹分子生物學(xué)研究。

Q78;S685.03

A

1000-7091(2017)02-0066-05

10.7668/hbnxb.2017.02.011