掌葉半夏凝集素基因的克隆及亞細(xì)胞定位分析

趙 歡

(西華師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充 637009)

掌葉半夏凝集素基因的克隆及亞細(xì)胞定位分析

趙 歡

(西華師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充 637009)

為了克隆掌葉半夏凝集素基因(Pinelliapedatisectaagglutinin，PPA)，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和亞細(xì)胞定位。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增掌葉半夏凝集素基因的ORF序列，構(gòu)建pCAMBIA1300-35S-PPA-eGFP重組載體，導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101并在煙草中進(jìn)行瞬時表達(dá)，采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察其亞細(xì)胞定位?？寺～@得的PPA基因全長由777個核苷酸組成，編碼258個氨基酸，含有3個甘露糖結(jié)合位點(diǎn)和2個保守的B-lectin結(jié)構(gòu)域，GenBank登錄號為KF154981，氨基酸序列登錄號為AGV40779。序列比對表明，該序列與天南星、滴水珠、花南星和半夏凝集素的氨基酸序列相似性分別為96%，91%，86%和83%。亞細(xì)胞定位的結(jié)果表明，pCAMBIA1300-35S-PPA-eGFP融合蛋白在細(xì)胞核內(nèi)無分布，而是點(diǎn)狀分布在細(xì)胞質(zhì)膜上。為進(jìn)一步解析掌葉半夏凝集素基因的結(jié)構(gòu)與功能，開展掌葉半夏凝集素抗病蟲害機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

掌葉半夏；掌葉半夏凝集素；基因克?。粊喖?xì)胞定位

植物凝集素是一類非酶和非免疫起源的植物蛋白，含有至少一個非催化結(jié)構(gòu)域且能可逆結(jié)合到特異糖及糖復(fù)合物[1]。自Herman Stillmark在蓖麻籽中發(fā)現(xiàn)蓖麻毒蛋白(Ricin)以來，現(xiàn)已從豆科、蘭科、茄科、蔥科、大戟科、百合科、禾本科、石蒜科、天南星科等植物中分離獲得了1 000多種植物凝集素[2]。Van Danme等[3-4]根據(jù)氨基酸序列的同源性及其在進(jìn)化上的關(guān)系，將植物凝集素分為7個基因家族，分別為豆科凝集素(The legume lectins)、含Hevein結(jié)構(gòu)域的殼多糖結(jié)合蛋白(The chitin binding lectins composed of hevein domains)、Ⅱ型核糖體失活蛋白(RIP)、葫蘆科韌皮部凝集素(Cucurbitaceae phloem lectins)、Jacalin相關(guān)凝集素(Jacalin-related lectins)、雪花蓮相關(guān)凝集素(GNA-related agglutinin)和含蓖麻毒蛋白B結(jié)構(gòu)域凝集素(Lectins with ricin-B domains)。已有研究表明，雪花蓮相關(guān)凝集素家族對刺吸式口器的害蟲(如葉蟬、蚜蟲、豆象、飛虱、粉虱、棉鈴蟲等)及一些病原微生物具有顯著的抑制或致死作用，且具有穩(wěn)定性好、污染小及相對安全等優(yōu)點(diǎn)，在病蟲害防治方面已日益受到重視[5]。

掌葉半夏又名虎掌南星或簡稱為虎掌，為天南星科半夏屬多年生草本植物，其性辛、味平、入肝經(jīng)，具有燥濕化痰、祛風(fēng)定驚、消腫散結(jié)之功效[6-8]。掌葉半夏的化學(xué)成分主要有生物堿、黃酮、多糖、甾醇、脂肪酸、氨基酸、掌葉半夏蛋白等[9-10]。掌葉半夏凝集素(Pinelliapedatisectaagglutinin，PPA)蛋白是掌葉半夏蛋白的重要組分之一，其隸屬于與雪花蓮相關(guān)的凝集素家族，能專一結(jié)合甘露糖，具有抗蟲、抗菌、抗腫瘤和凝集血細(xì)胞等生物學(xué)活性[11-12]。孫光星等[13]應(yīng)用Sephadex G-100分子篩層析、DE-32離子交換層析和制備電泳等方法首次從掌葉半夏中分離純化出掌葉半夏凝集素A，分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白為一糖蛋白，其分子量為16.3 kDa，等電點(diǎn)為5.8，主要含18種氨基酸。Lin等[14]分別以掌葉半夏葉片的DNA為模板克隆了PPA基因全長，結(jié)果顯示，PPA基因的開放讀碼框的長度為777 bp，編碼258個氨基酸的前體蛋白，與同屬半夏凝集素序列的相似性很高。Wu等[15]以掌葉半夏塊莖的cDNA為模板克隆了PPA基因，序列比對發(fā)現(xiàn)，PPA基因無內(nèi)含子。

目前，對掌葉半夏凝集素的研究集中于其抗癌機(jī)制和轉(zhuǎn)基因作物抗蟲活性的研究等方面，對其亞細(xì)胞定位尚未見報道。本研究以掌葉半夏葉的基因組DNA為模板，根據(jù)已報道的掌葉半夏凝集素序列(GenBank登錄號：HM593586)設(shè)計擴(kuò)增引物，克隆了PPA基因的全長，并將其連接到含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)標(biāo)記的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-35S上，通過分析基因序列，了解PPA基因的亞細(xì)胞定位，旨在為從顯微水平上闡明掌葉半夏凝集素抗病蟲害的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以掌葉半夏為研究材料，樣品采集自四川省南充市順慶區(qū)白土壩鄉(xiāng)，經(jīng)西華師范大學(xué)彭正松教授鑒定為掌葉半夏(Pinelliapedatisecta)，現(xiàn)栽培保存于西華師范大學(xué)生命科學(xué)院教學(xué)科研田。大腸桿菌DH5α由西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-35S-eGFP、農(nóng)桿菌GV3101和本生煙Nicotianatabacum均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻重大病害抗性機(jī)制研究室王文明研究員惠贈。

1.2 掌葉半夏凝集素PPA基因的擴(kuò)增

于2014年9月采集掌葉半夏單株，采用CTAB法提取葉片的DNA，并以之為模板，根據(jù)GenBank的PPA基因序列(登錄號為HM593586)，設(shè)計特異性引物PPA_F:5′-ACAGGTACCATGGCCTCCAAGCTCCTCCTCTTCCT-3′和PPA_R：5′-ACAGGTACCCGCGGCAATTGGGC-3′(劃線部分為KpnⅠ酶切位點(diǎn)的序列)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL：KOD酶 0.5 μL，10×KOD PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，MgSO41 μL，DNA 2 μL，上下游引物各0.8 μL，滅菌雙蒸 H2O 15.4 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，共30個循環(huán)包括：94 ℃變性15 s，65 ℃退火30 s，68 ℃ 延伸1 min，最后于72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后，于16 ℃與 pEASY-Blunt 載體連接過夜，采用凍融法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于含50 mg/mL卡那霉素(Kanamycin，Kan)的LB 固體培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)。用PCR檢測、酶切鑒定挑選陽性克隆，將其命名為pEASY-Blunt-PPA，送上海生工生物工程有限公司測序。

1.3 PPA基因?qū)χ参锉磉_(dá)載體的轉(zhuǎn)化

將鑒定正確的pEASY-Blunt-PPA用KpnⅠ單酶切，回收目的片段。同時將pCAMBIA1300-35S-eYFP用KpnⅠ單酶切和CIP處理，回收目的載體。用Implen超微量分光光度計分別測其濃度，根據(jù)目的基因與載體摩爾比10∶1計算出各所需的體積。用DNA ligation high連接酶連接目的片段和載體，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR擴(kuò)增、酶切篩選陽性克隆，將含正確片段的重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA1300-35S-PPA-eGFP，送上海生工測序。重組子向農(nóng)桿菌GV3101的轉(zhuǎn)化方法參照文獻(xiàn)[16]。將重組子pCAMBIA1300-35S-PPA-eGFP通過凍融轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含50 mg/L利福平(Rifampicin，Rif)和50 mg/L Kan的YEB固體培養(yǎng)基，于28 ℃培養(yǎng)2 d。PCR檢測、酶切鑒定陽性克隆，備用。

1.4 PPA-eGFP融合蛋白在煙草中的瞬時表達(dá)

將已鑒定的農(nóng)桿菌單克隆接種到2 mL含Kan和Rif的YEB液體培養(yǎng)基，于28 ℃過夜培養(yǎng)。將菌液6 600 r/min離心2 min，棄上清收集菌體，用1 mL 緩沖液10 mmol/L MgCl2重懸。用1 mL無菌醫(yī)用注射器吸取菌液，將菌液從葉片背面注射進(jìn)葉片內(nèi)，注射好后的本生煙于培養(yǎng)室照常培養(yǎng)，36 h后制片，在熒光共聚焦顯微鏡下觀察本生煙葉背面熒光表達(dá)情況。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 序列分析

采用NTI軟件進(jìn)行引物設(shè)計；PPA基因氨基酸序列的翻譯、相對分子量與等電點(diǎn)等預(yù)測采用瑞士生物信息學(xué)研究所網(wǎng)站http://expasy.org/完成；PPA基因的信號肽切割位點(diǎn)、亞細(xì)胞定位和結(jié)構(gòu)域等預(yù)測分別采用在線軟件SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、WoLF PSORT(http://psort.hgc.jp/)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)程序完成；采用DNAMAN 6.0軟件比對氨基酸序列；采用MEGA軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPA基因克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

以掌葉半夏葉的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段大小約為750 bp左右，與預(yù)期值相符(圖1-A)。將PCR產(chǎn)物回收，克隆到pEASY-blunt載體，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，篩選陽性重組子，以PPA基因的ORF正確克隆提取質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ單酶切，同時將表達(dá)載體pCAMBIA1300-35S-eGFP用KpnⅠ單酶切并經(jīng)CIP處理，用DNA ligation high將回收后的PPA基因連接到pCAMBIA1300-35S-eGFP，構(gòu)建融合表達(dá)載體pCAMBIA1300-35S-PPA-eGFP，將其進(jìn)行單酶切鑒定，結(jié)果表明，單酶切在10 kb和750 bp 左右分別有明顯條帶，結(jié)果與預(yù)期相符(圖1-B)。進(jìn)一步對載體的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行測序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，PPA基因完整ORF的長度為777 bp，與GenBank數(shù)據(jù)庫的HM593586的序列相似度為98.6%，編碼區(qū)完整，表明載體構(gòu)建成功。現(xiàn)已在GenBank中登錄，其核苷酸序列的登錄號為KF154981，氨基酸序列的登錄號為AGV40779。

A：M.DM2000；1～3.PCR產(chǎn)物；B：M.DM10000;1～2.單酶切結(jié)果。A：M.DM2000；1-3.PCR production；B：M.DM10000；1-2.The result of single digestion.

2.2 PPA基因氨基酸序列分析

序列分析表明，PPA蛋白由258個氨基酸組成，分子質(zhì)量為28.2 kDa，理論等電點(diǎn)為7.7。信號肽區(qū)域預(yù)測結(jié)果表明，PPA蛋白為分泌型蛋白，含一條24 aa的信號肽序列，切割位點(diǎn)在丙氨酸A與纈氨酸V之間。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果表明，PPA氨基酸序列含2個保守的B-lectin結(jié)構(gòu)域，分別位于第27-133 aa和第148-255 aa處。此外，序列還含有3個甘露糖結(jié)合位點(diǎn)基序(QXDXNXVXY)，分別位于52-60，173-181，235-243位。

結(jié)合前人所報道的PPA氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)(GenBank的登錄號分別為ADK56179和AAR27793)，3條PPA氨基酸序列長度差異不大為256～258 aa，其中本試驗(yàn)克隆的掌葉半夏凝集素序列AGV40779和ADK56179的長度均為 258 aa，序列AAR27793分別在102，139 aa處有2個氨基酸的缺失，長度為256 aa(圖2)。除去缺失位點(diǎn)外，3條PPA氨基酸共含有39個變異位點(diǎn)，占序列總長的15.2%。其中，信號肽區(qū)含有4個氨基酸變異位點(diǎn)，占序列總長的1.5%；靠N端的B-lectin結(jié)構(gòu)域含有21個氨基酸變異位點(diǎn)，占序列總長的8.2%；靠C端的B-lectin結(jié)構(gòu)域含有9個氨基酸變異位點(diǎn)，占序列總長的3.5%(表1)。另外，3條PPA氨基酸序列的甘露糖結(jié)合位點(diǎn)基序上也存在差異，其中，第1個甘露糖結(jié)合位點(diǎn)的第2個氨基酸在天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)之間變化；第2個結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸序列完全一致；第3個結(jié)合位點(diǎn)的第5個氨基酸在苯丙氨酸(F)和亮氨酸(L)之間變化(表2)。

表1 掌葉半夏凝集素氨基酸序列的變異位點(diǎn)

表2 掌葉半夏凝集素甘露糖活性位點(diǎn)氨基酸序列分析

3條PPA氨基酸序列相似性為94.7%，其中，AGV40779與ADK56179序列相似性較高，為97%；而與AAR27793序列相似性較低，為86%，推測掌葉半夏凝集素基因AGV40779和AAR27793在結(jié)構(gòu)和功能上可能存在一定的不同。此外，其與天南星、滴水珠、花南星和半夏凝集素的氨基酸序列相似性分別為96%，91%，86%和83%，說明天南星科植物凝集素序列存在較高的相似性，推測該科植物凝集素蛋白在部分功能上應(yīng)具有相似性。

2.3 PPA基因氨基酸序列的相似性分析

將克隆所得的掌葉半夏凝集素(AGV40779)與已報道的天南星科5個物種9條凝集素氨基酸序列，即掌葉半夏凝集素(PPA，GenBank的登錄號：AAR27793和ADK56179)、天南星凝集素(AHA、AAP50524和AAQ16181)、滴水珠凝集素(PCA，ABK88277)、花南星凝集素(ALA，AAS66304)和半夏凝集素(PTA，AAR27794、ABX47148和AFY06641)繪制進(jìn)化樹，結(jié)果表明，天南星科植物凝集素的氨基酸序列被分為兩類，其中，本試驗(yàn)克隆所得的掌葉半夏凝集素AGV40779與掌葉半夏凝集素ADK56179、天南星凝集素、滴水珠凝集素和花南星凝集素聚為一類，而半夏凝集素和掌葉半夏凝集素AAR27793聚為另一類(圖3)。推測天南星科植物中可能存在兩類凝聚活力不同的凝集素基因。

2.4 PPA基因亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位預(yù)測表明PPA蛋白可在膜、細(xì)胞質(zhì)和液泡中表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PPA的亞細(xì)胞定位，本試驗(yàn)構(gòu)建了PPA融合蛋白植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-35S-PPA-eGFP并導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株GV3101，并在本生煙葉片進(jìn)行瞬時表達(dá)中，培養(yǎng)36 h后，以FM4-64為熒光探針標(biāo)記細(xì)胞膜，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒在細(xì)胞核內(nèi)無分布，其綠色熒光點(diǎn)狀散布于整個細(xì)胞膜上(圖4-A)，且該區(qū)域同F(xiàn)M4-64的紅色熒光區(qū)域(圖4-B)完全重疊(圖4-C)，表明PPA點(diǎn)狀分布于細(xì)胞質(zhì)膜上。

圖2 掌葉半夏凝集素氨基酸序列比對

圖3 基于Neighbor-joining方法構(gòu)建掌葉半夏凝集素及相關(guān)序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

A.重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-35S-PPA-eGFP；B.FM4-64；C.A圖和B圖的融合圖像。A.Represented pCAMBIA1300-35S-PPA-eGFP；B.Represented FM4-64；C.Represented Merged.

3 討論

Wu等[15]從掌葉半夏球莖中克隆獲得了PPA的cDNA序列全長，抗蚜蟲鑒定表明，轉(zhuǎn)基因煙草植株有效地抑制了蚜蟲的增長。本試驗(yàn)以掌葉半夏葉片DNA為模板，克隆所得的掌葉半夏凝集素全長777 bp，編碼258個氨基酸的前體蛋白，具有半夏屬植物凝集素特有的信號肽序列、甘露糖結(jié)合位點(diǎn)基序和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，與Wu等[15]所報道的核苷酸和氨基酸序列相似性分別為99%和97%，說明不同掌葉半夏植株的凝集素序列具有高度保守性，且該凝集素蛋白的分布不存在組織器官的特異性。Lin等[14]以掌葉半夏葉片的DNA為模板克隆了PPA基因，本試驗(yàn)克隆所得的掌葉半夏凝集素與其所報道的氨基酸序列相似性僅為86%，說明掌葉半夏的葉中存在2種同工凝集素。聚類結(jié)果表明，該2種掌葉半夏同工凝集素位于不同的大類中，推測其功能可能存在一定的不同。

植物凝集素的抗蟲機(jī)制主要表現(xiàn)為三方面:植物凝集素可結(jié)合蟲體中腸上皮細(xì)胞表面的特異糖化合物，干擾蟲體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；可結(jié)合蟲體的消化酶或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的聚糖結(jié)構(gòu)，影響昆蟲對食物的消化；可影響一些與蟲體生理代謝相關(guān)基因的表達(dá)等[17-18]。本研究對PPA融合蛋白的共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pCAMBIA1300-35S-PPA-EGFP的細(xì)胞產(chǎn)生明顯的綠色熒光蛋白，并且融合蛋白點(diǎn)狀分布在質(zhì)膜上。結(jié)合Wu等[15]的報道，推測當(dāng)植物受到蚜蟲傷害時，其質(zhì)膜分布的PPA會分泌并特異結(jié)合蚜蟲消化道上皮細(xì)胞表面的甘露糖，進(jìn)而影響害蟲對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，抑制其生長發(fā)育和繁殖。

梁江麗等[19]在體外成功表達(dá)了掌葉半夏和半夏凝集素蛋白并對其凝集兔血紅細(xì)胞的活性進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PPA的凝集活力為PTA的4倍，推測可能是第3個甘露糖結(jié)合位點(diǎn)(QDNGXGVXY)2個氨基酸的差異(X位點(diǎn)分別為Y/F；I/V)造成了2種半夏屬植物凝集素的凝集活性不同。此外，筆者亦對PTA的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，PTA均勻分布于整個細(xì)胞膜上[20]。2種半夏屬植物凝集素生物活性的差異，是否由第3個甘露糖結(jié)合位點(diǎn)序列的特異性和亞細(xì)胞定位的不同造成，此點(diǎn)有待深入研究。

[1] 向 陽，杜才富，馬正強(qiáng).Jacalin類凝集素研究進(jìn)展[J].植物生理學(xué)報，2013，49(10)：1023-1029.

[2] 蔡茜茜，李巧玲，劉舒云，等.植物凝集素研究與展望[J].食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2013，3(6)：51-57.

[3] Van Damme E J，Peumans W J，Barre A，et al.Plant lectins：A composite of several distinct families of structurally and evolutionary related proteins with diverse biological roles[J].Critical Reviews in Plant Sciences，1998，17(6)：575-692.

[4] Peumans W J，Van Damme E J.Lectins as plant defense proteins[J].Plant Physiology，1995，109(2)：347-352.

[5] 張小霞，曹素梅，梁振普，等.植物凝集素在抗刺吸式害蟲轉(zhuǎn)基因工程中的應(yīng)用[J].植物保護(hù)，2010，36(4)：23-28.

[6] 郁紅禮，張 倩，吳 皓，等.掌葉半夏(虎掌南星)礬制前后致炎毒性比較研究[J].中國中藥雜志，2013，38(22)：3893-3897.

[7] 王 莉，楊永杰，歸綏琪，等.掌葉半夏主要成分對子宮頸癌細(xì)胞生長的抑制作用[J].復(fù)旦學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2009，36(6)：675-680.

[8] 魏淑紅，彭正松.半夏類藥材研究概況[J].中藥材，2003，26(11)：828-832.

[9] 黃和平，聶久勝，黃 鵬，等.中國半夏屬藥用資源研究概況[J].中國現(xiàn)代中藥，2014，16(3)：258-261.

[10] 王 乾，王康才，鄭晨曦，等.不同形態(tài)氮對掌葉半夏生長及塊莖主要化學(xué)成分的影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2014(4)：1038-1043.

[11] 趙 歡，彭正松.半夏屬植物凝集素的研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與利用，2014，26(9):1531-1537

[12] Lu Q，Li N，Luo J，et al.Pinelliapedatisectaagglutinin interacts with the methylosome and induces cancer cell death[J].Oncogenesis，2012，1(10)：e29.

[13] 孫光星，丁聲頌，錢瑤君.掌葉半夏凝集素A的分離純化及分析[J].上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1995，22(4)：299-302.

[14] Lin J，Zhou X，F(xiàn)ei J，et al.Genomic cloning and characterization of aPPAgene encoding a mannose-binding lectin from Pinellia pedatisecta[J].Biocell，2006，30(1)：15-25.

[15] Wu Z M，Yan H B，Pan W L，et al.Transform of an ectopically expressed bulb lectin gene fromPinelliapedatisectainto tobacco plants conferring resistance to aphids(Myzusnicotianae)[J].Aust J Crop Sci，2012，6(5)：904-911.

[16] 賈小霞，齊恩芳，王一航，等.轉(zhuǎn)錄因子DREB1A基因和Bar基因雙價植物表達(dá)載體的構(gòu)建及對馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化的研究[J].草業(yè)學(xué)報，2014，23(7)：110-117.

[17] Xiang Y，Du C F，Zq M，et al.Progress in research on Jacalin-related lectins[J].Plant Physiol J，2013，49(10)：1023-1029.

[18] De Hoff P，Brill L，Hirsch A.Plant lectins：the ties that bind in root symbiosis and plant defense[J].Molecular Genetics and Genomics ，2009，282(1)：1-15.

[19] 梁江麗，陳 波，田曉平，等.三葉半夏和掌葉半夏凝集素原核表達(dá)及特性研究[J].中國生物工程雜志，2009，29(3)：80-84.

[20] 趙 歡，彭正松，雷 楊，等.半夏凝集素基因的克隆、生物信息學(xué)分析及其蛋白的亞細(xì)胞定位[J].中草藥，2014，45(13)：1914-1919.

Genomic Cloning an Agglutinin Gene fromPinelliapedatisectaand Analysis on Its Subcellular Localization

ZHAO Huan

(College of Life Science，China West Normal University，Nanchong 637009，China)

To clonePinelliapedatisectaagglutinin gene(PPA)from the leaves ofPinelliapedatisecta，analyzed on its biological information characteristics，and observed its subcellular localization.The open reading frame sequence ofPPAgene was amplified by PCR method.The recombinant vector pCAMBIA1300-35S-PPA-eGFP was constructed and then transferred intoAgrobacteriumstrain GV3101.Agrobacteriumsuspensions expressing PPA were injected at different concentrations intoNicotianatabacumleaves and the subcellular location was observed by confocal laser scanning microscope.It showed that the open reading fragment sequence length ofPPAgene was 777 bp，encoding 258 amino acids with GenBank accession number KF154981 and AGV40779，respectively.It contained two conservative B-lectin domains and three mannose binding sites.Sequence alignment demonstrated that the deduced amino acid sequence of PPA，which were 96%，91%，86% and 83% identical respectively，with the corresponding region ofArisaemaheterophyllum，Pinelliacordata，ArisaemalobatumandPinelliaternata.The subcellular location results indicated that the PPA-eGFP was located in the plasma membrane as large spots，but not found in nucleus.The results would provide the foundation for further study the structure and function ofPPAgene，and elucidate anti-microbial mechanism of PPA.

Pinelliapedatisecta；Pinelliapedatisectaagglutinin；Gene cloning；Subcellular localization

2017-01-13

四川省教育廳重大培育項(xiàng)目(15CZ0015);西華師范大學(xué)青年教師資助專項(xiàng)(1D012)；西華師范大學(xué)青年教師資助專項(xiàng)(14D012)

趙 歡(1982-),女,四川雅安人,講師,博士,主要從事藥用植物基因資源保護(hù)與研究開發(fā)。

Q78

A

1000-7091(2017)02-0032-06

10.7668/hbnxb.2017.02.005