新城疫病毒核蛋白單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA的初步建立

王明睿，鐘建平，李 睿，王國松，陳毅歆,

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新城疫病毒核蛋白單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA的初步建立

王明睿1，鐘建平1，李 睿2，王國松1，陳毅歆1, 2

目的 制備新城疫病毒(NDV)核蛋白(NP)的單克隆抗體(單抗)，并用于建立一種可定量檢測NDV病毒含量的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測方法(NDV NP ELISA)。方法 基于NDV病毒株F48E9獲得NP基因，經(jīng)原核表達方式制備出重組抗原rNP；免疫小鼠制備NDV NP特異性單抗；單抗經(jīng)HRP標記和配對篩選，建立NDV NP ELISA，分析其特異性、靈敏度、精密度、準確度和檢測線性，并分析本方法定量檢測的NP含量與PFU病毒滴度的定量相關(guān)性。結(jié)果 建立基于單抗3C10和4E7的NDV NP ELISA，其定量檢測NDV rNP的最佳線性范圍為0.015～0.250 μg/ml(R2=0.9974)，回收率在88.4%～106.01%，變異系數(shù)小于3.4%；該方法具有良好特異性；該方法定量檢測NDV抗原含量與PFU病毒感染滴度有較好的相關(guān)性(R2=0.9209)。結(jié)論 建立NDV NP ELISA，可準確定量檢測NDV病毒中的NP抗原含量，為NDV病毒含量的測定提供一種可靠簡便的分析方法。

新城疫病毒；核蛋白；單克隆抗體；定量檢測；酶聯(lián)免疫吸附測定

新城疫(Newcastle disease，ND)是由副黏病毒科(Paramyxoviridae)禽副黏病毒屬(Avulavirus)中的NDV引起的一種高度接觸性的急性禽類傳染病[1]。人類感染NDV可引起發(fā)熱等流感樣癥狀，但很快就會痊愈，1955年文獻首次報道NDV能夠在腫瘤細胞中復(fù)制并殺傷腫瘤細胞，而不殺傷人正常細胞[2]。自此之后，NDV不斷被當作溶瘤制劑用于惡性腫瘤的治療研究，部分NDV天然毒株如73-T、MTH68、PV107等在臨床試驗中已顯示出一定的腫瘤治療效果[3-5]，隨著反向遺傳技術(shù)的發(fā)展，通過基因改造在NDV基因組中導(dǎo)入外源性的腫瘤殺傷因子從而增強其溶瘤效果，使NDV在腫瘤治療方面擁有更好的前景。

病毒滴定是開展NDV溶瘤研究所必需的實驗操作。NDV常用的滴定方法主要為測定雞胚半數(shù)致死量(LD50)、雞胚半數(shù)感染量(EID50)、細胞培養(yǎng)物半數(shù)感染量(TCID50)和測定噬斑形成單位(PFU)等。LD50或EID50的測定需要用到雞胚，操作十分復(fù)雜，雞胚發(fā)育強弱差異和接種時的操作可能會影響實驗結(jié)果；TCID50和PFU的測定是在細胞水平上進行的，具有較高的準確度，但是耗時較長，操作也較為復(fù)雜，因此有必要發(fā)展新的操作簡便的NDV滴定方法。NDV基因組約15 kb，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，其中NP是NDV病毒粒子中含量最豐富的病毒蛋白，保守性很高，常用于NDV的診斷。鑒于此，本研究目的是篩選NDV的NP蛋白特異性單克隆抗體，并建立基于酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的雙抗體夾心NDV抗原檢測方法，為NDV的病毒滴定提供一種新的手段。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞與實驗動物 NDV病毒株F48E9和La Sota為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)王曉佳教授饋贈，傳染性法氏囊病毒(IBDV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、雞毒支原體(MG)、雞痘病毒(FPV)購自青島易邦生物工程有限公司；小鼠骨髓瘤細胞株Sp2/0-Ag14(Sp2/0)和Vero細胞為本實驗室保存；BALB/c小鼠(6-8周齡)購自上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗遵循《實驗動物保護條例》。

1.2 主要試劑與耗材 PEG1350、次黃嘌呤、胸腺嘧啶、氨基碟呤、DMSO、HRP、弗氏佐劑均購自Sigma公司。RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基為Invitrogen公司產(chǎn)品。胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品。硝酸纖維素膜為MDI公司產(chǎn)品。抗體亞型鑒定試劑購自Bio-Rad公司。病毒裂解液購自碧云天公司。各種常規(guī)化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 NDV F48E9株NP重組蛋白的表達及純化鑒定 根據(jù)已發(fā)表的NDV NP基因序列設(shè)計并合成引物，上游引物：5-CGGATCCATGTCTTCCGTATTTGATGAGTACGAGCAGCTC-3，下游引物：5-GCAAGCTTATACCCCCAGTCGGTGTCATTATCTTGAG-3。利用RT-PCR的方法從病毒培養(yǎng)液中調(diào)取并擴增F48E9株NP基因，定向連接到pTO-T7載體上，進行測序鑒定及比對。將陽性重組質(zhì)粒pTO-NP轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2566感受態(tài)細胞，IPTG誘導(dǎo)表達，重組蛋白rNP的表達經(jīng)SDS-PAGE電泳與Western blot鑒定，鎳離子柱親和層析純化等。

1.3.2 單抗的制備 取純化的rNP，與弗氏完全佐劑乳化，多點皮下注射BALB/c小鼠，注射劑量100 μg/只，間隔14天取相同劑量rNP加等量弗氏不完全佐劑乳化進行加強免疫。融合前3天，以50 μg rNP經(jīng)脾臟注射進行加強免疫。按常規(guī)雜交瘤技術(shù)，在無菌條件下，收集小鼠脾臟細胞與Sp2/0進行細胞融合。陽性雜交瘤細胞經(jīng)4次克隆化后進行擴大培養(yǎng)和保存。

1.3.3 單抗的效價測定和亞類鑒定 采用體內(nèi)誘生法在BALB/c小鼠腹腔中制備單抗腹水。采用間接ELISA方法測定抗體效價。按AbD Serotec公司抗體亞類鑒定試劑盒說明書鑒定抗體亞類。

1.3.4 單抗的純化及標記 用MabSelect Sure LX層析介質(zhì)純化腹水中的單抗，SDS-PAGE電泳鑒定純度。采用過碘酸鈉法標記HRP。

1.3.5 雙抗體夾心NDV NP ELISA的建立

1.3.5.1 包被單抗及酶標單抗最佳工作濃度的確定 將rNP蛋白稀釋至1 μg/mL，2%的NBS為陰性對照，PBS為空白對照，采用方陣滴定法確定最佳的單抗包被濃度和酶標單抗稀釋度。采用常規(guī)夾心ELISA方法，以pH7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋純化的3C10包被酶標板，100 μL/孔，4℃過夜；采用0.05%Tween-20的PBS(PBST)洗板3次，每次3 min；含2%明膠的磷酸鹽緩沖液封閉酶標板，37℃孵育2 h，洗板；加入待檢樣品，100 μL/孔，37℃孵育30 min，洗板；4E7-HRP為酶標抗體，37℃孵育30 min，洗板；通過TMB使底物顯色，100 μL/孔，37℃反應(yīng)15 min；最后以2 M的濃硫酸50 μL/孔終止反應(yīng)，用OD450/630讀微孔光密度值。

1.3.5.2 直線性和定量限度實驗 用PBS將NP抗原稀釋為1 μg/mL，連續(xù)二倍稀釋后用本方法測定。以抗原濃度和對應(yīng)的OD值做線性回歸分析，以陰性對照的2.1倍為Cutoff值，分析最佳線性范圍，確定定量限度。

1.3.5.3 準確性及精密性檢測 將NP抗原分別稀釋為250、180、100 ng/mL，3人次進行獨立試驗，每一稀釋度作6份重復(fù)測定。比較測定值和真實值，計算均值、標準偏差，驗證該方法的準確性及精密性。

1.3.5.4 特異性試驗 用建立的NDV NP ELISA方法對已知的傳染性法氏囊病毒(IBDV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、雞毒支原體(MG)、雞痘病毒(FPV)等禽類病毒進行交叉反應(yīng)性試驗，確定該ELISA方法的特異性。

1.3.5.5 與病毒滴度相關(guān)性分析 將不同批次的NDV病毒培養(yǎng)液裂解后用本方法檢測各樣品的NDV抗原活性，同時用空斑法檢測各個樣品的病毒滴度。通過比較兩種方法的檢測結(jié)果，分析本方法檢測與病毒滴度的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 NDV病毒NP抗原的表達及小鼠免疫 采用RT-PCR的方法從NDV F48E9株病毒培養(yǎng)液中獲取NP的基因，經(jīng)測序鑒定正確后，構(gòu)建了pTO-T7/ NP重組表達質(zhì)粒。在E.coli菌株ER2566中進行大量表達后，利用親和層析的方法純化制備出高純度的重組蛋白rNP。用經(jīng)過NDV免疫的小鼠血清作為Western blot 的一抗檢測rNP，結(jié)果顯示原核重組表達的NP蛋白活性良好，與抗NDV的血清有良好的反應(yīng)(圖1)。用純化得到的rNP免疫BALB/c小鼠，制備單克隆抗體。

M: Protein marker; 1: SDS-PAGE of the purified recombinant NP圖1 重組蛋白rNP的SDS-PAGE(A)及Western blot(B)Fig.1 SDS-PAGE(A)and Western blot(B)analysis of recombinant NP protein

2.2 NDV病毒NP單抗的制備及鑒定 選擇血清抗體滴度較高的小鼠，通過細胞融合篩選得到了抗NP的單抗，根據(jù)抗體滴度、特異性、配對檢測NDV的靈敏度，篩選到兩株用于試劑構(gòu)建的單抗3C10和4E7。用ELISA、Western blot和IFA三種方法鑒定兩株單抗性質(zhì)(圖2)。

2.3.1 包被單抗及酶標單抗最佳工作濃度的確定 通過方陣滴定確定單抗3C10最佳包被量為200 ng/孔，酶標單抗4E7-HRP最佳稀釋度為1∶4000(圖3)，此條件下OD陽性值為3.726，陰性值為0.011，且P/N最大。

1：Western blot of rNP with mAb 3C10；2：Western blot of rNP with mAb 4E7；3：Western blot of virus with mAb 3C10；4：Western blot of virus with mAb 4E7圖2 單抗3C10和4E7的性質(zhì)鑒定Fig.2 Characterization of mAbs 3C10 and 4E7

圖3 最適單抗包被濃度和酶標單抗工作濃度的確定Fig.3 Determination for optimal concentration of coated mAb and peroxidase

2.3.2 NDV NP ELISA的標準曲線 將重組蛋白rNP稀釋至1 μg/mL后，進行連續(xù)對倍稀釋，用建立的NDV NP ELISA檢測稀釋后的樣品。對測定的OD值取常用對數(shù)值作為縱坐標，以各稀釋樣本濃度的常用對數(shù)值作為橫坐標，得到檢測NP抗原標準曲線(圖4)。標準曲線方程為y=1.0791x-2.1755，相關(guān)系數(shù)R2=0.9974，最佳線性范圍為0.015～0.250 μg/mL，最低檢出限為0.015 μg/mL。

2.4 NDV NP ELISA的性能鑒定

2.4.1 準確性與精密性 用建立的NDV NP ELISA檢測線性范圍內(nèi)高、中、低濃度的NP抗原，回收率均在88.4%—106.01%，變異系數(shù)均小于3.4%，見表1。

圖4 雙抗體夾心法檢測抗原NP的標準曲線Fig.4 Standard curve of double-antibody sandwich ELISA for NP

表1 NDV NP ELISA的準確性及精密性驗證(n=18)
Tab.1 Accuracy and precision of the developed NDV NP ELISA

NP抗原含量Concentration(ng/mL)測得平均值A(chǔ)veragevalue(ng/mL)標準差SD(ng/mL)變異系數(shù)CVvalue(%)回收率Recovery(%)250251.568.483.488.43-106.01180181.042.911.697.49-103.6210099.572.832.894.59-103.86

2.4.2 特異性 用建立的NDV NP ELISA測定其他NDV毒株和非NDV樣品，結(jié)果顯示非NDV樣品的OD值均小于0.1，與PBS的OD值接近(表2)，表明該NDV NP ELISA特異性良好，對其他常見禽類病毒無非特異性檢出。

2.4.3 NDV NP ELISA測定NP含量與NDV病毒滴度的相關(guān)性分析 取50份NDV病毒樣品裂解后用NDV NP ELISA進行檢測，將得到的NP抗原含量與對應(yīng)樣品的病毒滴度(PFU)取對數(shù)后進行相關(guān)性分析。結(jié)果(圖5)顯示NDV的空斑形成滴度PFU與NDV NP ELISA測定的NP抗原含量相關(guān)性良好，R2=0.9209，提示NDV NP ELISA測定NDV病毒的NP含量的方法可用于NDV病毒的滴度分析。

表2 NDV NP ELISA的特異性驗證結(jié)果
Tab.2 Specificity of the developed NDV NP ELISA

項目(Item)OD值NP抗原溶液(100ng/mL)NPantigen(100ng/mL)0.966LaSota株NDVstrainLaSota3.532Clone30株NDVstrainClone303.758雞傳染性法氏囊病病毒IBDV0.025傳染性喉氣管炎病毒ILTV0.017雞毒支原體MG0.011雞痘病毒APV0.005PBS溶液phosphatebuffersaline0.013

圖5 NDV病毒滴度與NDV NP ELISA檢測的NP含量的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation between NDV viral titer and NP concentration

3 討 論

近30多年來，已被認為是一種安全有效的溶瘤試劑[3, 5-6]。為了更好的開展NDV的溶瘤研究，迫切需要操作簡便的病毒定量分析方法。新城疫病毒的基因組是由約15 kb的單股負鏈RNA組成，共編碼核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)糖蛋白和大分子質(zhì)量聚合酶(L)等六種結(jié)構(gòu)蛋白[7]。其中，NP蛋白、P蛋白、L蛋白和病毒基因組RNA緊密結(jié)合，共同形成一個螺旋棒狀的核糖核蛋白復(fù)合體(RNP)，廣泛存在于NDV病毒顆粒中，在病毒復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用。因此，建立針對NP含量的測定方法，能夠很好的反映出NDV病毒顆粒的含量。

本研究制備的NDV病毒NP蛋白的特異性單抗，并建立了定量的雙抗體夾心ELISA方法，顯示出良好的靈敏度、回收率和穩(wěn)定性。該方法檢測的NDV的NP抗原含量與傳統(tǒng)空斑法檢測的NDV病毒滴度有很好的相關(guān)性?？傊摲椒镹DV病毒的定量分析提供了一種快速、簡便的檢測方法。

新城疫目前仍是全球一大嚴重威脅養(yǎng)雞業(yè)的烈性傳染病。在臨床表現(xiàn)中，感染NDV禽類的臨床癥狀和病理解剖檢測容易和其他禽類病毒感染如雞傳染性法氏囊、禽流感、雞喉氣管炎等相混淆，并且不同的NDV毒株的致病差異較大，因此臨床癥狀或病理變化不能作為確診的依據(jù)。當前用于新城疫病毒的檢測方法主要為病毒的分離與鑒定、分子生物學(xué)診斷(如RT-PCR、核酸探針、實時熒光定量檢測)和血清學(xué)檢測技術(shù)(如酶聯(lián)免疫吸附試驗)[8-9]。病毒分離和鑒定方法需要花費較長的時間和精力；RT-PCR等分子生物學(xué)方法雖然靈敏，但是需要特殊的儀器設(shè)備同時對操作人員有較高的要求。而ELISA方法的敏感性和特異性強，操作較為簡便[10]，較適合基層獸醫(yī)部門和禽類養(yǎng)殖場等對新城疫的大面積普查。本研究建立的NDV NP ELISA方法具有良好的特異性，能很好的區(qū)分NDV和非NDV禽類傳染病病毒。因此，對本方法再經(jīng)過進一步的完善優(yōu)化后，有望發(fā)展成為有用的NDV的診斷試劑。

[1] Czegledi A, Ujvari D, Somogyi E, et al. Third genome size category of avian paramyxovirus serotype 1 (Newcastle disease virus) and evolutionary implications[J]. Virus Res, 2006, 120(1-2): 36-48. DOI: 10.1016/j.virusres.2005.11.009

[2] Flanagan AD, Love R, Tesar W. Propagation of Newcastle disease virus inEhrlichascitescellsinvitroandinvivo[J]. Proc Soc Exp Biol Med, 1955, 90(1): 82-86. DOI:10.3181/00379727-90-21945

[3] Csatary LK, Moss RW, Beuth J, et al. Beneficial treatment of patients with advanced cancer using a Newcastle disease virus vaccine (MTH-68/H)[J]. Anticancer Res, 1999, 19(1B): 635-638.

[4] Pecora AL, Rizvi N, Cohen GI, et al. Phase I trial of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, in patients with advanced solid cancers[J]. J Clin Oncol, 2002, 20(9): 2251-2266. DOI: 10.1200/JCO.2002.08.042[5] Batliwalla FM, Bateman BA, Serrano D, et al. A 15-year follow-up of AJCC stage III malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus (NDV) oncolysate and determination of alterations in the CD8 T cell repertoire[J]. Mol Med, 1998, 4(12): 783-794.

[6] Liu JJ, Liu KY, Wang J. The research progress of the anti-tumor genes of newcastle disease virus[J]. Chin J Zoonoses, 2011, 27(3): 260-262. (in Chinese)

劉進軍，劉開揚，王靜. 新城疫病毒抗腫瘤基因的研究進展[J]. 中國人獸共患病學(xué)報, 2011, 27(3): 260-262.

[7] Steward M, Vipond IB, Millar NS, et al. RNA editing in Newcastle disease virus[J]. J Gen Virol, 1993, 74 ( Pt 12): 2539-2547. DOI: 10.1099/0022-1317-74-12-2539

[8] Wu HR, Diao YX, Li HM, et al. Application of indirect immuno-fluorescent assay for detection and antigen location of duck paramyxovirus in paraffin sections[J]. Chin J Vet Sci, 2011, 31(02): 189-193. (in Chinses)

吳煥榮, 刁有祥, 李宏梅, 等. 間接免疫熒光染色檢測鴨源副黏病毒及在鴨體內(nèi)的抗原定位[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報, 2011, 31(02): 189-193.

[9] Wu HR, Diao YX, Li HM, et al. Establishment and application of RT-PCR diagnostic method for duck paramyxovirus disease[J]. J Northwest A F Univ, 2010, 38(11): 31-35. (in Chinses)

李建俠, 刁有祥, 劉霞, 等. 鴨副粘病毒病RT-PCR診斷方法的建立與應(yīng)用[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2010, 38(11): 31-35.

[10] Ma SJ, Xiong YQ, Zhang QH, et al. Comparison of three commercial ELISA kits for detection of antibodies against Japaneses encephalitis virus in swine sera[J]. Chin J Zoonoses, 2015, 31(5): 423-426. (in Chinese)

馬淑娟，熊益權(quán)，張瓊花，等. 三種ELISA試劑盒檢測豬流行性乙型腦炎病毒血清IgG抗體比較[J]. 中國人獸共患病學(xué)報, 2015, 31(5): 423-426.

Development of monoclonal antibodies against nucleoprotein of Newcastle disease virus and establishment of a quantitative double-antibody sandwich ELISA for NDV antigen

WANG Ming-rui1, ZHONG Jian-ping1, LI Rui2, WANG Guo-song1, CHEN Yi-xin1,2

(1.StateKeyLaboratoryofMolecularVaccinologyandMolecularDiagnostics，SchoolofLifeScience,XiamenUniversity,Xiamen361102,China;2.StateKeyLaboratoryofMolecularVaccinologyandMolecularDiagnostics,SchoolofPublicHealth,Diseases,XiamenUniversity,Xiamen361102,China)

We developed the monoclonal antibodies against nucleoprotein (NP) of Newcastle disease virus (NDV), and established a double antibody sandwich ELISA method for quantitative determination of NP antigen of NDV (NDV NP ELISA). The recombination NP protein derived from strain F48E9 of NDV were prepared and used to immunize BLAB/c mice. The mouse splenic cells from immunized mice were fused with SP2/0 cells to generate monoclonal antibodies (mAb). The NDV NP specific mAbs were paired to establish a double antibody sandwich ELISA method. The performance of the NDV NP ELISA was evaluated, including specificity, sensitivity, precision, accuracy and linearity. The correlation between the ELISA and PFU virus titer was analyzed by regression analysis method. Two monoclonal antibodies 3C10 and 4E7 were selected to establish double antibody sandwich ELISA for NP antigen of NDV. The linearity and performance of the NDV NP ELISA was characterized. The detection linearity fell in the range of 0.015-0.250 μg/mL (R2=0.997 4). The detection limit of the assay was 0.015 μg/mL. The recovery was between 88.4% and 106.01%; the variation coefficient was below 3.4%. In testing of 50 NDV virus samples, this assay performed well and correlated comparably with PFU virus titer (R2=0.920 9). The NDV NP ELISA for quantitative detection of NDV is a reliable quantifiable assay for detection of NDV NP protein; it provides a new approach for rapid and quantitative detection of Newcastle disease virus.

Newcastle disease virus; NP protein; monoclonal antibody; quantitative assay; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Chen Yi-xin, Email: yxchen2008@xmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.06.002

國家自然科學(xué)基金(31670934)：基于廣譜中和單抗的通用型流感疫苗設(shè)計及其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)研究

陳毅歆，Email:yxchen2008@xmu.edu.cn

1.廈門大學(xué) 國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心 生命科學(xué)學(xué)院，廈門 361102； 2.廈門大學(xué) 分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國家重點實驗室 公共衛(wèi)生學(xué)院，廈門 361102

R372

A

1002-2694(2017)06-0481-05

2017-04-17 編輯：李友松

Supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31670934): The design of universal influenza vaccine based on broadly neutralizing monoclonal antibody and its structural study.