廣東首例蘇里南輸入性寨卡病毒感染病例的實(shí)驗(yàn)室檢測

梁潔怡，戴 俊，黎東紅，師永霞*，黃吉城，袁 帥，鄭 夔，李小波，張顯光，宋衛(wèi)，吳惠明

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廣東首例蘇里南輸入性寨卡病毒感染病例的實(shí)驗(yàn)室檢測

梁潔怡1，戴 俊1，黎東紅1，師永霞1*，黃吉城1，袁 帥1，鄭 夔1，李小波1，張顯光2，宋衛(wèi)2，吳惠明2

目的 對從廣州白云國際機(jī)場口岸入境的一例自蘇里南歸國發(fā)熱人員進(jìn)行寨卡病毒實(shí)驗(yàn)室檢測。方法 采集發(fā)熱人員的血液和唾液樣本，同時(shí)使用兩種寨卡病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑進(jìn)行寨卡病毒核酸檢測。RT-PCR擴(kuò)增寨卡病毒部分基因片段，并進(jìn)行序列測定和同源性比較。基于擴(kuò)增片段構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析輸入性病例的來源。結(jié)果 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR結(jié)果顯示，該病例血清樣本寨卡病毒核酸弱陽性、唾液樣本寨卡病毒核酸陽性。RT-PCR擴(kuò)增出預(yù)期大小約1.5Kb片段，測序結(jié)果表明該片段與巴西寨卡病毒株(GenBank號KX197250)相應(yīng)序列的同源性為99%。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示該病毒屬亞洲譜系。結(jié)論 根據(jù)患者流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)和病例標(biāo)本核酸檢測情況，確診該病例為廣東首例從蘇里南地區(qū)輸入性寨卡病例。

寨卡病毒；實(shí)時(shí)熒光RT-PCR；核酸檢測；進(jìn)化分析

寨卡病毒病是由寨卡病毒(Zika virus) 感染而引起的一類蟲媒病毒病[1]，臨床表現(xiàn)與登革熱和基孔肯雅熱類似，以發(fā)熱、皮疹、關(guān)節(jié)痛和結(jié)膜炎常見，也可出現(xiàn)頭痛、眼后痛、肌肉痛和嘔吐癥狀[2]。2015年5月，巴西首次確認(rèn)寨卡疫情本土傳播后，疫情迅速蔓延擴(kuò)散至南美洲多個(gè)國家，并出現(xiàn)了與之相關(guān)的數(shù)千例新生兒小頭畸形和格林-巴利綜合癥等疑似病例[3]。截止2017年1月5日，全球75個(gè)國家和地區(qū)報(bào)告了蚊媒傳播的寨卡疫情，29個(gè)國家報(bào)告與寨卡病毒有關(guān)的新生兒小頭畸形和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形疫情，21個(gè)國家報(bào)告與寨卡病毒有關(guān)的格林-巴利綜合癥，疫情形勢仍然嚴(yán)峻[4]。目前中國已報(bào)道有20余例輸入性寨卡病毒感染病例。最新寨卡疫情亞洲和非洲風(fēng)險(xiǎn)報(bào)告稱，若疫情持續(xù)爆發(fā)，位于亞洲地區(qū)的印度、中國和印尼恐怕將有更多人口暴露在寨卡風(fēng)險(xiǎn)之下[5]。近期，東南亞新加坡、越南等國暴發(fā)的寨卡疫情已經(jīng)為之敲響了警鐘[6-7]。因此，由于我國部分地區(qū)存在著寨卡病毒病流行的條件和傳播媒介，與寨卡疫情流行區(qū)的人員往來頻繁，如果不能在輸入性疫情傳播的初期進(jìn)行有效控制，將導(dǎo)致疫情的大規(guī)模爆發(fā)，造成嚴(yán)重后果。

1 材料與方法

1.1 病例 陳某，女，40歲，旅蘇里南籍華僑，2016年7月8日乘坐荷蘭CZ308航班至廣州白云國際機(jī)場，機(jī)場檢驗(yàn)檢疫局衛(wèi)生檢疫人員對其進(jìn)行檢疫查驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查，得知該旅客一周前前往蘇里南(寨卡病毒疫情發(fā)生國)，入境時(shí)申報(bào)頭痛2 d，皮疹1 d?，F(xiàn)場檢疫查體發(fā)現(xiàn)全身散在皮疹，體溫37.2 ℃。采集血液和唾液樣本至廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心衛(wèi)檢室(以下簡稱衛(wèi)檢室)檢測。同時(shí)送至定點(diǎn)醫(yī)院進(jìn)行對癥治療和防蚊等隔離治療。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 病毒RNA核酸提取試劑盒(QIAamp Viral RNA Kit)和一步RT-PCR擴(kuò)增試劑(One step RT-PCR Kit)購自德國Qiagen公司，熒光PCR通用試劑(Ag-Path-IDTMOne step RT-PCR Kit)購自美國Ambion公司。商品化寨卡病毒核酸測定試劑盒(熒光RT-PCR法)購置上海之江生物科技股份有限公司，Stepone Plus、Q6熒光定量PCR儀和9700 PCR儀為美國ABI公司儀器。

1.2.2 核酸提取 按照病毒RNA核酸提取試劑盒說明書提取血清和唾液的病毒RNA，最后用60 μL洗脫液洗脫病毒核酸。-70 ℃冰箱保存。

1.2.3 引物和探針 在PrM基因高保守性區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，用于實(shí)驗(yàn)室自主研制實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法檢測寨卡病毒核酸；在寨卡病毒保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，用于寨卡病毒的RT-PCR擴(kuò)增。引物和探針由上海生工合成，序列見表1。

表1 寨卡病毒核酸檢測引物探針
Tab.1 Primers and probes of Zika virus

引物/探針名稱PrimerandProbe序列(5-3')Alignment(5-3')擴(kuò)增片段AmplifiedfragmentZIKVA1fGGATTTGGAAACGAGAGTTTCC-PrM-M-E基因,預(yù)期擴(kuò)增片段1550bpZIKVA1rGAACCACTCCTTGTGAACCAZIKVupGTGACGCCACCATGAGCTATGAPrM基因,預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段115bpZIKVdpTGATGGCAGGTTCCGTACACAACZIKVProFAM-CCAAGTTGACGTCGTGTTGCACCAGCA-BHQ1

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 反應(yīng)體系和條件 參照鄭夔等寨卡病毒核酸實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測體系和條件進(jìn)行[8]。商品化寨卡病毒核酸檢測試劑盒按照說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 RT-PCR反應(yīng)體系和條件 RT-PCR反應(yīng)體系50 μL，包括無RNase水25.5 μL、10×RT-PCR緩沖液5 μL、2 mmol/L dNTPS 5 μL、25 mmol/L MgSO43 μL、酶0.5 μL、20 μmol/L ZIKVA1f 0.5 μL、20 μmol/L ZIKVA1r 0.5 μL、RNA 10 μL，同時(shí)設(shè)置陰、陽性對照。RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 1 min；50 ℃ 30 min，95 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min(35循環(huán))；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。最后取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.6 序列分析與軟件 用Lasergene軟件包中EditSeq對序列進(jìn)行整理并拼接。選取GenBank數(shù)據(jù)庫中43株寨卡病毒的基因組相應(yīng)序列下載作為參考序列，用MEGA5.0軟件鄰接法(Neighbour-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié) 果

2.1 病例樣本的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測 使用實(shí)驗(yàn)室自研試劑和商品化檢測試劑同時(shí)對病例血清和唾液樣本進(jìn)行寨卡病毒核酸實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測，兩套檢測試劑結(jié)果完全一致，病例的血清和唾液樣本均有典型擴(kuò)增曲線，其中唾液樣本Ct值約為28～30，血清樣本較弱，Ct值僅為38。

2.2 唾液樣本RT-PCR擴(kuò)增和序列測定 RT-PCR結(jié)果顯示，唾液樣本擴(kuò)增出了預(yù)期大小1 550 bp片段。Blast比對表明該片段與巴西寨卡病毒株(GenBank號KX197250)相應(yīng)序列的同源性有99%。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 基于擴(kuò)增的C-PrM-M-E基因序列構(gòu)建了寨卡病毒系統(tǒng)進(jìn)化樹。系統(tǒng)進(jìn)化樹分成亞洲和非洲譜系，該病例寨卡病毒株(命名Surinam-3640A1)屬亞洲譜系，與巴西寨卡病毒株(GenBank號KX197250和KY014697)、蘇里南寨卡病毒株(GenBank號KU312312)等位于同一分支(圖1)。

▲Surinam-3640A1表示該病例寨卡病毒▲Surinam-3640A1 represents Zika virus strain imported from Surinam case.圖1 寨卡病毒C-PrM-M-E基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic analysis based on C-PrM-M-E genes of Zika virus

2.4 廣東省CDC復(fù)核和病例發(fā)布 7月10日，廣東省CDC復(fù)核病例標(biāo)本，結(jié)果為寨卡病毒核酸陽性。根據(jù)病例流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)和病例標(biāo)本核酸檢測情況，廣東省衛(wèi)計(jì)委11日晚通報(bào)發(fā)布確診該病例感染寨卡病毒，也是廣東首例從蘇里南輸入的寨卡病毒病例。

3 討 論

早在2015年11月，南美洲蘇里南就向世界衛(wèi)生組織通報(bào)了6例寨卡病毒感染本土病例[9-10]。2015 年 12 月 1 日，質(zhì)檢總局根據(jù)2014年以來寨卡病毒在巴西、哥倫比亞、蘇里南等國本土區(qū)域流行以及新近上升態(tài)勢，預(yù)警疫情存在跨境傳播風(fēng)險(xiǎn)，發(fā)布《關(guān)于防止寨卡病毒感染疫情傳入我國的公告》(2015年第141號)，寨卡病毒進(jìn)入口岸衛(wèi)生檢疫視野[11]。截至2016年2月，荷蘭本土共確診了24例寨卡病毒感染輸入性病例，這些病例均有蘇里南或阿魯巴旅行史[12]。這說明自2015年底蘇里南已爆發(fā)寨卡病毒病疫情。截止2017年1月，廣東省已有15例輸入性寨卡病毒感染病例，其中13例來自委內(nèi)瑞拉[8]，1例來自中美洲危地馬拉，該病例是廣東首例、也是僅有1例蘇里南輸入性寨卡病毒感染病例。

該病例入境時(shí)個(gè)人健康申報(bào)頭痛2 d，皮疹1 d，實(shí)驗(yàn)室檢測到唾液樣本中寨卡病毒載量較高，血清樣本寨卡病毒核酸檢測為弱陽性，這表明該病例的病毒血癥期快要結(jié)束，說明寨卡病毒在血清中持續(xù)時(shí)間較短，而可較長時(shí)間在尿液和唾液中檢出，與文獻(xiàn)報(bào)道報(bào)道結(jié)果一致[13-14]。提示若發(fā)現(xiàn)疑似病例時(shí)應(yīng)第一時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測以明確診斷，并且除血清標(biāo)本外應(yīng)盡量同時(shí)采集唾液和尿液樣本進(jìn)行檢測，有利于國境口岸無創(chuàng)傷性采樣的要求。

蘇里南屬于南美洲，毗鄰巴西北部，該病例C-PrM-M-E基因片段的測序結(jié)果表明其與巴西寨卡病毒株(GenBank號KX197250)相應(yīng)序列同源性高達(dá)99%，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示其與巴西病毒株(GenBank號KX197250和KY014697)、法屬玻里尼西亞病毒株(GenBank號KX447513和KX447519)等位于亞洲譜系的同一進(jìn)化分支，推測引起蘇里南疫情暴發(fā)的寨卡病毒與南美洲和太平洋島國疫源地的毒株相同。

建議有意向前往寨卡疫區(qū)的人員提前應(yīng)到當(dāng)?shù)貦z驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)了解目的地疫情情況，提高自我防護(hù)意識(shí)并做好個(gè)人防護(hù)，并特別提醒孕期婦女盡量避免前往寨卡病毒流行國家或地區(qū)[8]。目前我國正處于冬春交替之季，隨著入春后氣溫逐步回升，蚊蟲開始滋生，廣東等南方地區(qū)應(yīng)盡早做好防控準(zhǔn)備[15]。

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Laboratory diagnosis of the first imported case of Zika virus infection from Suriname into Guangdong，China

LIANG Jie-yi1, DAI Jun1, LI Dong-hong1, SHI Yong-xia1, HUANG Ji-cheng1,YUAN Shuai1, ZHENG Kui1, LI Xiao-bo1, ZHANG Xian-guang2, SONG Wei2, WU Hui-ming2

(1.InspectionandQuarantineTechnicalCenter,GuangdongEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Guangzhou510700,China;2.GuangdongEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Guangzhou510623,China)

We detected Zika virus (ZIKV) in a febrile case returning from Suriname and entry China from Guangzhou Baiyun International Airport Port. Serum and saliva samples were collected from a suspected case returning from Suriname. We detected ZIKV RNA using real-time fluorescence RT-PCR methods by both in-house reagent and commercial detection kits. RT-PCR detection was carried out with saliva sample and sequence analysis was performed. Phylogenetic tree was constructed to analyze the source of imported cases. Real-time fluorescent RT-PCR result showed that saliva was detected ZIKV RNA positive while for serum was weakly positive. A specific 1 500 bp fragment in size was amplified with saliva sample by RT-PCR. Sequence analysis showed 99% homologous to the corresponding sequence of Brazil ZIKV (GenBank No. KX197250). Phylogenetic tree indicated it was located on African lineage. According to the epidemiological investigation results, clinical manifestations and nucleic acid detection of case, the suspected case was confirmed to infect Zika virus, being the first case from Suriname into Guangdong Province.

Zika virus; real-time fluorescent RT-PCR; nucleic acid detection; phylogenetic analysis

Shi Yong-xia, Email: 93240850@qq.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.06.010

師永霞，Email: 93240850@qq.com

1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心衛(wèi)生檢疫實(shí)驗(yàn)室,廣州 510700； 2.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣州 510623

R373.1

A

1002-2694(2017)06-0523-04

2017-02-27 編輯：李友松

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2016A020247001)和廣東檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2016GDK58)聯(lián)合資助

Supported by the Science and Technology Planning Project of Guangdong province (Grant No. 2016A020247001), and the Science and Technology Planning Project of Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau(No.2016GDK58)