巖原鯉致病性維氏氣單胞菌的分離與鑒定

朱成科，劉桂嘉，張爭(zhēng)世，蒲德成，朱 龍，周朝偉，雷 駱，鄭宗林

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巖原鯉致病性維氏氣單胞菌的分離與鑒定

朱成科1，劉桂嘉1，張爭(zhēng)世1，蒲德成2，朱 龍1，周朝偉1，雷 駱1，鄭宗林1

目的 2016年6月從重慶永川某養(yǎng)殖場(chǎng)瀕臨死亡的巖原鯉內(nèi)臟分離到一株維氏氣單胞菌，分析其生物學(xué)特征，為預(yù)防和治療該病提供理論依據(jù)和參考。方法 從患病魚體獲得一株致病菌YY01，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性測(cè)定、16S rRNA和gyrB基因序列分析其分類地位；通過人工感染試驗(yàn)和毒力基因檢測(cè)確定其致病性，并同時(shí)開展藥物敏感試驗(yàn)篩選其敏感藥物。結(jié)果 病原菌16S rRNA與gyrB序列構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示該菌與維氏氣單胞菌同聚為一支，相似性在99%以上；結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性，確認(rèn)為維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)。人工感染試驗(yàn)結(jié)果顯示菌株YY01對(duì)巖原鯉的半致死量為5.06×104CFU/g。通過病原菌毒力基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，能從菌株YY01基因組中擴(kuò)增到氣溶素(Aer)、溶血素(Hly)、外膜蛋白(OmpA)和黏附素(Aha)4種毒力基因。藥敏試驗(yàn)表明菌株YY01對(duì)多粘霉素B、阿米卡星、先鋒霉素V等22種藥物敏感；對(duì)青霉素、羧芐西林等11種藥物耐藥。結(jié)論 所檢出的維氏氣單胞菌為巖原鯉的致病菌，該菌對(duì)巖原鯉有較強(qiáng)的致病性。

維氏氣單胞菌；巖原鯉；致病性；藥敏試驗(yàn)

Supported by the Ecological Fishery Industry Technology System of Chongqing (Nos. 40800115 and 40800216) and the Youth Foundation of Southwest University Rongchang Campus (No. 20700913) Corresponding author: Zheng Zong-lin, Email: zhengzonglin@126.com

巖原鯉(Procyprisrabaudi)又名巖鯉、黑鯉魚，隸屬鯉形目(Cypriniformes)，鯉科(Cyprinidae)，鯉亞科(Cyprininae)，原鯉屬(Procypris)，主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江中上游及其支流水域，屬雜食性底層魚類，其肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，少肌間刺，含肉率高，是上等的食用魚類，市場(chǎng)前景廣闊[1]。近年來，由于長(zhǎng)江中上游水體污染和過度捕撈，加上三峽樞紐等水利設(shè)施的興建，嚴(yán)重破壞了巖原鯉的棲息環(huán)境，其野生資源銳減，已被列為《中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書(魚類)》中的易危物種[2]。隨著重慶、四川、湖北、貴州等省市相繼開展了巖原鯉的人工繁殖和養(yǎng)殖技術(shù)研究，極大地推動(dòng)了巖原鯉養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。近年來，隨著養(yǎng)殖密度的加大，集約化程度的增高，巖原鯉養(yǎng)殖環(huán)境惡化，各種細(xì)菌性疾病、真菌性疾病和寄生蟲病頻發(fā)，嚴(yán)重困擾著巖原鯉養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。其中，細(xì)菌性疾病對(duì)巖原鯉危害最為嚴(yán)重，目前報(bào)道的主要有嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、腸形點(diǎn)狀氣單胞菌(A.punctataf.intestinalis)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)和柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcolumnare)等[3-4]。

2016年6月，在重慶永川某養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)巖原鯉大批患病并出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象，患病魚主要臨床癥狀為：體表充血，肛門紅腫、外突，鰭條基部充血發(fā)紅，腹部腫脹，腹腔中大量紅色腹水，內(nèi)臟點(diǎn)狀出血，腸道充血等癥狀。本實(shí)驗(yàn)室研究人員從自然發(fā)病魚體內(nèi)臟實(shí)質(zhì)器官進(jìn)行了病原菌分離，并通過病原菌形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)定和分子生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定確定，該菌為維氏氣單胞菌(A.veronii)，同時(shí)進(jìn)行了病原菌藥物敏感性及毒力基因的檢測(cè)，以期為該病的致病機(jī)制和有效病害防控研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 病魚采自重慶市永川區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量為150-250 g，具有典型的臨床癥狀。健康巖原鯉購(gòu)自重慶市萬州區(qū)水產(chǎn)研究所，體長(zhǎng)為15.3±1.5 cm，體質(zhì)量為53.6±4.2 g，暫養(yǎng)于90×50×60 cm的水族缸中，試驗(yàn)用水為充分曝氣的自來水，水溫(26.5±1.0)℃，pH 7.0-7.5，觀察7 d確認(rèn)健康無異常后進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。

1.2 主要試劑和儀器 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(Oxoid公司)，細(xì)菌DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，PCR反應(yīng)體系(Takara公司)，pMD-19T(Takara公司)，API 20E試劑盒(Biomerieux公司)，藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司)；恒溫?fù)u床(江蘇省金壇市盛威實(shí)驗(yàn)儀器廠)，生化培養(yǎng)箱(寧波新芝生物科技股份有限公司)，核酸蛋白測(cè)量?jī)x(德國(guó)eppendef公司)，PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，DYY-8C型電泳儀(北京市六一儀器廠)，凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)等。

1.3 病原菌的分離與培養(yǎng) 選取患病癥狀典型的瀕臨死亡巖原鯉，在無菌操作臺(tái)中，用70%酒精棉球擦拭魚體，用接種環(huán)取其肝、脾、腎和腹水分別于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上進(jìn)行劃線，在28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌菌落生長(zhǎng)狀況，然后挑取形態(tài)一致的單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板中，再次純化培養(yǎng)24 h，將純化后的分離菌株用營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病原菌的形態(tài)觀察 將純化的菌株接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)特征。挑選單菌落經(jīng)革蘭氏染液染色后，在顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.5 人工感染試驗(yàn) 將分離菌株涂布接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，用0.65%無菌生理鹽水洗脫，參照麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌液濃度，稀釋成1.0×108CFU/mL、1.0×107CFU/mL、1.0×106CFU/mL、1.0×105CFU/mL的菌懸濁液。采用胸鰭注射法，每尾魚分別注射各濃度菌液0.2 mL，15尾/組。空白對(duì)照組注射等量0.65%無菌生理鹽水。接種后觀察魚的發(fā)病和死亡情況，對(duì)上述感染死亡的魚進(jìn)行致病菌分離鑒定和感染試驗(yàn)。

1.6 病原菌生理生化特征鑒定 參照ATB系統(tǒng)細(xì)菌自動(dòng)鑒定儀(法國(guó)Bio-merieux公司)API 20E試劑盒使用說明進(jìn)行細(xì)菌鑒定，鑒定結(jié)果參照參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[5]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[6]的標(biāo)準(zhǔn)判斷細(xì)菌的種類。

1.7 16S rRNA和gyrB序列的擴(kuò)增和測(cè)定

1.7.1 菌株DNA提?。簾o菌條件下，在5.0 mL的EP管中加入1.0 mL普通肉湯液體培養(yǎng)基，將單個(gè)活化的菌群接種在其中。于恒溫振蕩器中28 ℃，120 r/min培養(yǎng)6 h后，4 000 r/min離心1 min，棄上清液。參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取制備DNA。

1.7.2 16S rRNA和gyrBPCR擴(kuò)增：采用一對(duì)16S rRNA基因PCR擴(kuò)增的通用引物F-D1/R-D1。上游引物為F-D1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物為R-D1：5′-AAGGAGGTGATCCA GCCGCA-3′[7]。采用一對(duì)gyrB基因PCR擴(kuò)增的通用引物3F/14R。上游引物為3F：5′-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3′；下游引物為14R：5′-TTGTCCGGGTTGTACTCGTC-3′[8]。PCR用25 μL反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mM MgCl21.5 μL，10 mM dNTP 0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，rTaq酶(5 U/μL)0.25 μL，ddH2O 補(bǔ)足余下體積?；驍U(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共31個(gè)循環(huán)；最后，72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用TaKaRa公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收純化，pMD-19T載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆送上海英駿生物技術(shù)測(cè)序公司測(cè)序。

1.7.3 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建：將菌株的16S rRNA和gyrB基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中的Blast進(jìn)行相似性比較。采用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自舉分析(bootstrap)進(jìn)行置信度檢測(cè)，自舉數(shù)集1000次。

1.8 病原菌毒力基因的檢測(cè) 以分離菌株的DNA為模板，對(duì)氣溶素基因(Aer)[9]、溶血素基因(Hly)[10]、外膜蛋白基因(OmpA)[11]和黏附素基因(Aha)[11]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列、退火溫度和片段大小見表1。在用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小，TaKaRa瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收純化，克隆并測(cè)序。

表1 相關(guān)毒力基因的引物序列
Tab.1 Sequence of oligonucleotide primers used in the study

毒力基因Virulencegene引物序列Oligonucleotidesequence退火溫度(℃)Annealingtemperature(℃)片段大小(bp)Productsize(bp)AerF:GAGCGAGAAGGTGACCACCAAGAAC56417R:TTCCAGTCCCACCACTTCACTTCACHlyF:ATTATCAAGCTTTTAAAACTGGCTC55432R:ATCAAGCTTTTAAAACTGGCTCTCGGCOmpAF:GCTATCCCGGCTCTGTTCGCATCT56903R:CAGCAGGGTTTCGTCAAGCAGGTCAhaF:GGCTATTGCTATCCCGGCTCTGTT58998R:CGGTCCACTCGTCGTCCATCTTG

1.9 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)采用K-B法進(jìn)行。將菌懸液制成1.0×108CFU/mL。用無菌棉簽蘸取菌懸液均勻涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，貼上藥敏紙片，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h測(cè)定抑菌圈直徑大小。參照說明書判斷藥物敏感性。

2 結(jié) 果

2.1 致病菌分離 從瀕臨死亡病魚肝、脾、腎分離到一株優(yōu)勢(shì)病原菌，編號(hào)為YY01。菌株YY01在普通肉湯液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)液中渾濁均勻。在普通肉湯瓊脂平板上28 ℃培養(yǎng)24 h，形成圓形、邊緣整齊、隆起、光滑濕潤(rùn)、灰白色至淡黃色，直徑在1.0-1.5 mm的菌落。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢可見革蘭陰性短桿菌，菌體大小為1.50×0.48 μm，兩端鈍圓或平直，多數(shù)單個(gè)排列。

2.2 人工感染試驗(yàn) 胸鰭基部注射菌株YY01后，攻毒后7 d各組巖原鯉死亡結(jié)果見表2。由表2可見，高濃度組(1.0×108CFU/mL)巖原鯉在2 d內(nèi)全部死亡，死亡率高達(dá)100%；1.0×107CFU/mL組在攻毒后7天內(nèi)累積死亡率為73.3%，對(duì)照組無魚體死亡，表明分離菌株具有較強(qiáng)的致病性。人工感染死亡的巖原鯉出現(xiàn)下頜、鰭基出血，腹部膨大，肛門紅腫，解剖后，腹部出現(xiàn)腹水，惡臭等癥狀，與自然發(fā)病巖原鯉癥狀和病變相似。并從人工感染瀕臨死亡的試驗(yàn)魚肝、脾臟和腹水中分離到一株優(yōu)勢(shì)菌，該菌形態(tài)學(xué)、生理生化特征和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果與菌株YY01一致，表明YY01是該病的病原菌。通過人工感染試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)改良寇氏法[12]計(jì)算出菌株YY01的半致死濃度LD50為：5.06×104CFU/g。

表2 菌株YY01對(duì)健康巖原鯉人工感染試驗(yàn)結(jié)果
Tab.2 Results of artificial infection of YY01 inProcyprisrabaudi

注射濃度Concentration(CFU/mL)魚數(shù)No.(n)感染7d內(nèi)每d死亡尾數(shù)Deathno.ineachday1234567死亡總數(shù)No.ofdeath(n)死亡率Mortalityrate/%1.0×108151140000015100.01.0×1071525310001173.31.0×106150210100426.71.0×10515000100016.70.65%NaCl15000000000.0

2.3 生理生化鑒定結(jié)果 菌株YY01的VP試驗(yàn)、MR試驗(yàn)和七葉靈水解陽性；產(chǎn)生吲哚，不能產(chǎn)生H2S；賴氨酸脫羧酶、氧化酶陽性，精氨酸雙水解酶陰性；能利用D-葡萄糖、D-甘露醇、蔗糖、麥芽糖和纖維二糖，不能利用阿拉伯糖、肌醇、衛(wèi)矛醇、乳糖、棉籽糖、木糖、鼠李糖、水楊苷，其生理生化特性見表3。經(jīng)ATB Expression生化自動(dòng)鑒定儀(IS32 STREP)軟件的分析結(jié)果，可初步鑒定分離菌株為維氏氣單胞菌。

2.4 基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 用細(xì)菌的16S rRNA和gyrB通用引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得預(yù)期條帶大小約為1 500 bp和1 200 bp(如圖2)，與預(yù)期的結(jié)果相一致。對(duì)目的條帶進(jìn)行割膠回收、純化、連接、轉(zhuǎn)化、挑選陽性克隆測(cè)序，菌株YY01所獲得的16S rRNA和gyrB序列片段大小分別為1 497 bp和1 084 bp。

菌株YY01 16S rRNA(登錄號(hào)：KY624577)與GenBank上登錄的維氏氣單胞菌(登錄號(hào)：AF099024和HQ407242)的相似性高達(dá)99.9%；菌株YY01gyrB基因(登錄號(hào)：KY624576)與GenBank上登錄的維氏氣單胞菌(登錄號(hào)：KR537458)的相似性高達(dá)100.0%。根據(jù)YY01菌株16S rRNA和gyrB基因序列與GenBank已登錄的其它氣單胞菌屬序列，并以霍亂弧菌(V.cholerae)和副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)為外類群，運(yùn)用MEGA4.0軟件分別建立系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，YY01均與維氏氣單胞菌聚為一支(支持率均為100%)，見圖2、圖3。

2.5 毒力基因的檢測(cè)結(jié)果 根據(jù)維氏氣單胞菌Aer、Hly、OmpA、Aha基因設(shè)計(jì)基因特性引物，進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，分別獲得大小約410 bp、430 bp、900 bp和1 000 bp的DNA片段(圖4)，與預(yù)期結(jié)果相符。從而進(jìn)一步說明引起巖原鯉患病的維氏氣單胞菌菌株YY01含有AerA、Hly、OmpA、Aha基因，從分子水平上說明該菌株具有較強(qiáng)的致病性，與人工回歸感染結(jié)果相一致。

表3 分離菌株YY01的生理生化特征
Tab.3 Biochemical and physiological characteristics of the isolated strain YY01

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目 Items結(jié)果Result實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目 Items結(jié)果ResultD-葡萄糖(D-glucose)+衛(wèi)矛醇(Galactitol)-D-甘露醇(D-mannitol)+乳糖(Lactose)-蔗糖(Sucrose)+棉籽糖(Raffinose)-阿拉伯糖(Arabinose)-木糖(Xylose)-肌醇(Inositol)-鼠李糖(Rhamnose)-賴氨酸脫羧酶(Lysdecarboxylase)+氧化酶(Oxidase)+精氨酸雙水解酶(Argdihydrolase)-脲酶(Urease)-鳥氨酸脫羧酶(Orndecarboxylase)-硫化氫(H2S)-苯丙氨酸脫氨酶(Phedeaminase)-吲哚(Indol)+七葉靈水解(Esculinhydrolyse)+水楊苷(Salicin)-丙二酸鹽(Malonate)-纖維二糖(Cellobiose)+麥芽糖(Maltose)+0%NaCl+VP(Voges-Proskauertest)+3%NaCl+MR(Methyl-Redtest)+6%NaCl-葡糖糖產(chǎn)氣(D-glucoseproducinggas)+8%NaCl-枸椽酸鹽(Citrate)-10%NaCl-

Notes: “+” indicates positive, “-” indicates negative.

M: DL2000 DNA maker; 1: gyrB; 2: 16S rRNA; 3: negative control圖1 病原菌株YY01的gyrB和16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of gyrB and 16S rRNA gene in strain YY01

圖2 菌株YY01 16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences.

圖3 菌株YY01 gyrB基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on gyrB gene sequences

M: DL2000 DNA maker; 1：Aer；2：Hly；3：OmpA；4：Aha；5：negative control圖4 菌株YY01的毒力基因片段電泳結(jié)果Fig.4 PCR amplification of four virulence genes of strain YY01

2.6 藥敏試驗(yàn) 本試驗(yàn)檢測(cè)了YY01對(duì)40種抗生素(包括大環(huán)內(nèi)酯類、β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、硝基呋喃類、磺胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、氯霉素類、林可霉素類和其它類抗生素)的藥物敏感性，見表4。結(jié)果顯示YY01對(duì)多粘霉素B、阿米卡星、先鋒霉素V、呋喃妥因和呋喃唑酮等22種藥物敏感；對(duì)鏈霉素、妥布霉素、慶大霉素、先鋒霉素Ⅵ、利福平等8種藥物中度敏感；對(duì)青霉素、羧芐西林等10種藥物耐藥。

3 討 論

菌株YY01的形態(tài)學(xué)特性和生理生化的檢測(cè)結(jié)果與維氏氣單胞菌非常相似，且維氏氣單胞菌區(qū)別氣單胞菌屬其它細(xì)菌的主要特征為賴氨酸脫羧酶陽性、精氨酸雙水解酶陰性[13]。結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[5-6]進(jìn)行種類鑒定，初步確定該病原菌為維氏氣單胞菌(A.veronii)。但菌株YY01苯丙氨酸脫氨酶、水楊苷和纖維二糖陰性與維氏氣單胞菌模式菌株ATCC35624存在差異，其原因可能是同一種細(xì)菌在不同地域分離獲得，存在個(gè)體差異引起[14]。為了進(jìn)一步確定分離菌株的分類地位，本研究采取了細(xì)菌的16S rRNA和gyrB。16S rRNA基因進(jìn)化速率緩慢，功能保守，被稱為細(xì)菌“分子化石”，常用于細(xì)菌的分類鑒定[15]，但對(duì)同屬親緣關(guān)系較近的種間關(guān)系分辨率不夠[16]。gyrB基因?qū)儆谛畔⑼分信cDNA復(fù)制、限制、修飾和修復(fù)有關(guān)的蛋白編碼基因，對(duì)細(xì)菌DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制很重要[17]。研究發(fā)現(xiàn)gyrB基因相對(duì)于16S rRNA具有較高的替換率，并且作為蛋白編碼基因，特別適合親緣關(guān)系較近的菌種區(qū)別和鑒定[8]。本研究分離到了菌株YY01gyrB基因與登錄已知維氏氣單胞菌相似性高達(dá)99.0%以上，而與氣單胞菌屬其它菌種相似性低于95.0%，結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果，鑒定分離菌株為維氏氣單胞菌(A.veronii)。因此，在病原菌的鑒定過程中，將細(xì)菌形態(tài)學(xué)和生理生化特性結(jié)合分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合，鑒定結(jié)果更精確。

表4 菌株YY01的藥敏試驗(yàn)結(jié)果
Tab.4 Sensitivity of strain YY01 to antibiotics

抗生素種類Classesofantibiotics藥物名稱Drugs紙片含量/μgDose:g/disc判斷標(biāo)準(zhǔn)AssessmentcriteriaRIS抑菌圈直徑/mmDiameterofinhibition/mm敏感性Sensitivity大環(huán)內(nèi)酯類Macrolidesgroup紅霉素Erythromycin15≤1314-22≥2313R交沙霉素Josamycine15≤1314-22≥2310R吉他霉素Kitasamycin15≤2122-30≥3112Rβ-內(nèi)酰胺類β-lactamgroup頭孢他啶Ceftazidime30≤1415-17≥1829S頭孢哌酮Cefoperazone75≤1516-20≥2130S先鋒霉素ⅣCephalosporinⅣ30≤1415-17≥1822S先鋒霉素VCephalosporinV30≤1415-17≥1820S哌拉西林Piperacillin100≤1718-20≥2124S氨曲南Aztreonam30≤1516-21≥2233S頭孢曲松Ceftriaxone30≤2525-26≥2737S先鋒霉素ⅥCephalosporinⅥ30≤1415-17≥1817I青霉素Penicillin10≤1920-27≥280R羧芐西林Carbenicillin100≤1920-22≥230R氨芐西林Ampicillin10≤1314-16≥170R阿莫西林Amoxicillin10≤1819-25≥260R四環(huán)素類Tetracyclinesgroup四環(huán)素Tetracycline30≤1414-20≥2128S米諾環(huán)素Minocycline30≤1415-17≥1828S強(qiáng)力霉素Doxycycline30≤1415-18≥1928S硝基呋喃類Nitrofuransgroup呋喃唑酮Furazolidone300≤1415-16≥1722S呋喃妥因Nitrofurantoin300≤1415-16≥1721S磺胺類Sulfonamidesgroup復(fù)方新諾明Cotrimoxazole23.75≤2324-32≥3320R磺胺甲基異惡唑Benzenesul-fonamide250≤1415-23≥2416I氨基糖苷類Aminoglycosidesgroup阿米卡星Amikacin30≤1415-16≥1717S慶大霉素Gentamicin10≤1213-14≥1514I妥布霉素Tobramycin10≤1213-14≥1514I新霉素Neomycin30≤1213-16≥1716I卡那霉素Kanamycin30≤1314-17≥1817I鏈霉素Streptomycin10≤1112-14≥1512I喹諾酮類Quinolonesgroup環(huán)丙沙星Ciprofloxacin5≤1516-20≥2137S培氟沙星peflacin10≤2324-25≥2632S左氧氟沙星Levofloxacin5≤1314-16≥1733S吡哌酸Pipemidicacid30≤2122-28≥2930S氧氟沙星Ofloxacin5≤1213-15≥1634S諾氟沙星Norfloxacin10≤1213-16≥1735S氯霉素類Chloromycetinsgroup氯霉素Chloromycetin30≤1213-17≥1830S氟苯尼考Florfenicol30≤1213-17≥1829S林可霉素類Lincomycingroup林可霉素Lincolmensin2≤2324-30≥310R其它類抗生素Othersantibioticsgroup多粘霉素BPolymyxinB300≤89-11≥1212S利福平Rifampicin5≤1617-19≥2018I桿菌肽Bacitracin10≤89-12≥130R

S: Sensitive; I: Intermediate; R: Resistant.

維氏氣單胞菌(A.veronii)亦被稱為維羅納氣單胞菌，普遍存在于海水、淡水、污水和土壤中，是一種重要的人—畜—魚共患致病菌[18]，在人免疫力低下時(shí)，維氏氣單胞菌可引發(fā)腹瀉、腦膜炎和敗血癥等病癥[19-20]。李偉杰等[21]報(bào)道了該菌能引起狐貍(Vulpesvulpes)腹瀉等疾病，嚴(yán)重的將致其死亡。維氏氣單胞菌也是對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物造成危害較大的病原菌，潘曉藝等[22]報(bào)道了該菌能引起青蝦(Macrobrachiumnipponense)掉肢、軟殼、肝胰腺發(fā)黃和肌肉水腫等癥狀，導(dǎo)致大量死亡。房海等[23]從瀕臨死亡的中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)肝胰臟中分離到該菌，病蟹體腔內(nèi)積水，鰓暗灰色，肝胰腺呈淺黃等癥狀。團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)、框鏡鯉(Cyprinuscarpio)、西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)、斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalunespunctatus)等養(yǎng)殖魚類感染該菌后，主要表現(xiàn)潰瘍、出血和腹水等癥狀[18, 24-26]。此外，國(guó)內(nèi)還有該菌引起大鯢(Andriasdavidianus)[27]和中華鱉(Trionyxsinensis)[28]感染死亡的研究報(bào)道。

維氏氣單胞菌致病機(jī)制較為復(fù)雜，目前研究表明該菌能產(chǎn)生黏附素、細(xì)胞毒素、腸毒素、氣溶素和溶血素等毒力因子，這些毒力因子相互作用在水產(chǎn)動(dòng)物感染過程中起著重要作用[29]。因此研究病原菌的毒力基因在探討該菌致病機(jī)制尤為重要，據(jù)報(bào)道，Aer、Hly、OmpA、Aha為維氏氣單胞菌重要毒力基因，其中，氣溶素(Aer)可以使全身臟器廣泛出血，并破壞宿主細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，產(chǎn)生氣溶素是氣單胞菌具有致病性的重要標(biāo)志之一[9,18]；溶血素(Hly)是基因組DNA編碼的毒力因子，形成共聚后插入細(xì)胞膜上，形成管道，導(dǎo)致溶血[10]；外膜蛋白(OmpA)在增強(qiáng)細(xì)菌粘附作用，維持外模結(jié)構(gòu)、逃避宿主殺傷起到重要作用[30]；黏附素(Aha)能促進(jìn)細(xì)菌粘附、侵襲以及對(duì)宿主防御機(jī)能的抵抗[31]?？傊@些毒力基因在病原菌粘附、侵襲、增殖、抵抗機(jī)體防御和釋放毒素過程中有著重要作用，本研究從致病菌株YY01檢測(cè)到上述4種毒力基因，表明菌株YY01為較強(qiáng)致病菌株，這與人工感染試驗(yàn)相佐證，且從分子生物學(xué)層面進(jìn)一步確認(rèn)分離到的病原菌為維氏氣單胞菌(A.veronii)。

藥敏試驗(yàn)表明菌株YY01對(duì)β-內(nèi)酰胺類中的頭孢他啶等7種抗生素、四環(huán)素等3種四環(huán)素類抗生素、呋喃唑酮等2種硝基呋喃類抗生素、對(duì)環(huán)丙沙星等6種喹諾酮類抗生素、對(duì)氯霉素等2種氯霉素類抗生素敏感；對(duì)紅霉素等3種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、β-內(nèi)酰胺類中的青霉素等4抗生素、對(duì)慶大霉素等5種氨基糖苷類抗生素耐藥，此結(jié)果為巖原鯉防治該病提供了科學(xué)依據(jù)。但藥敏試驗(yàn)結(jié)果與從青蝦(M.nipponense)[22]、框鏡鯉(C.carpio)[24]、西伯利亞鱘(A.baerii)[25]和中華鱉(T.sinensis)[28]體內(nèi)分離到的維氏氣單胞菌藥敏特性不盡相同，這可能是菌株不同來源、不同區(qū)域及抗生素藥物使用史等原因有關(guān)。因此在該病實(shí)際防治過程中，應(yīng)該參照分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)結(jié)合國(guó)家允許的漁用藥物準(zhǔn)則(NY5071-2002，無公害食品、漁用藥物使用準(zhǔn)則[S])，選擇最有效的藥物開展治療，謹(jǐn)防菌株抗藥性的產(chǎn)生。

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Identification of a pathogenicAeromonasveroniiisolated from rock carp,Procyprisrabaudi

ZHU Cheng-ke1, LIU Gui-jia1, ZHANG Zheng-shi1, PU De-cheng2, ZHU Long1,ZHOU Chao-wei1, LEI Luo1, ZHENG Zong-lin1

(1.DepartmentofFisheriesinRongchangCampus,SouthwestUniversity,Chongqing402460,China;2.AgricultureCommitteeofWuxi,Chongqing405899,China)

In June 2016, a disease among the cultured rock carp (Procyprisrabaudi) in Yongchuan of Chongqing Municipality occurred. The aim of this study was to investigate biological characteristics and provide reference forAeromonasveroniiidentification diagnosis and treatment. Pathogenic bacteria strain YY01 from the dying fishes were examined and isolated. Strain YY01’s taxonomic status was identified by observing the morphology, studying the physiological and biochemical characters and sequencing the 16S rRNA and housekeeping genegyrB. Its pathogenicity was checked by artificial infection experiment and virulence genes. Furthermore, effective medicine was detected by drug sensitivity. The 16S rRNA andgyrBgene sequence of the strain YY01 was more than 99% homology with that ofAeromonasveronii, suggesting that the pathogen wasAeromonasveronii, which was also identified by the results of biochemical analysis. The LD50of strain YY01 to rcok carp was 5.06×104CFU/g. Four virulence genes were detected from YY01, including aerolysin (aer), hemolysin (Hly), Outer Membrane Protein Gene A (OmpA) and adhesion (Aha) genes. Antibiotic sensitivity assays showed that among 40 antibiotics tested, 22 were sensitive and 11 were resistant. In conclusion, the strain YY01 is identified asAeromonasveroniiand it is proved to have strong pathogenicity.

Aeromonasveronii;Procyprisrabaudi; pathogenity; antibiotic susceptibility test

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.06.011

鄭宗林，Email: zhengzonglin@126.com

1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)水產(chǎn)系，重慶402460； 2.巫溪縣農(nóng)業(yè)委員會(huì)，重慶405899

R378

A

1002-2694(2017)06-0527-09

2017-02-27 編輯：李友松

重慶市生態(tài)漁業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(No.40800115，40800216)和西南大學(xué)榮昌校區(qū)青年基金(No.20700913)聯(lián)合資助