LPS體外誘導PRP產(chǎn)生PGE2模型的構建及HPLC-FD的優(yōu)化

朱翔宇，曹志方，楊雨輝，蔡熙姮，姜亞磊，陳 濤

(1.海南大學 農學院，海南?？?570228；2.海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室，海南海口 570228)

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LPS體外誘導PRP產(chǎn)生PGE2模型的構建及HPLC-FD的優(yōu)化

朱翔宇1，曹志方1，楊雨輝2*，蔡熙姮1，姜亞磊1，陳 濤1

(1.海南大學 農學院，海南?？?570228；2.海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室，海南?？?570228)

為了研究花生四烯酸(AA)代謝拮抗劑篩選的新方法，通過模擬體內AA代謝產(chǎn)生前列腺素E2(PGE2)的過程，建立一種新的體外脂多糖(LPS)誘導高濃度血小板血漿(PRP)懸液中AA代謝產(chǎn)生PGE2的炎癥模型，并對高效液相色譜-熒光衍生法(HPLC-FD)測定PGE2方法進行了優(yōu)化。結果表明，經(jīng)50℃水浴反應，衍生化程度最高， HPLC-FD檢測最佳條件為柱溫40℃、流動相為添加0.1% 三氟乙酸(TFA)的水∶乙腈(40∶60)，流速1 mL/min，Brmmc-PGE2的保留時間為6.562 min。體外模型試驗中LPS+AA誘導試驗組(157.476±36.104)ng/mL，LPS誘導空白對照組(11.416±2.034)ng/mL，而AA底物空白對照組中未檢測到PGE2。表明AA作為體外PGE2代謝模型的關鍵底物，在加入誘導物質LPS后，AA可大量代謝生成為PGE2。

前列腺素E2；脂多糖；高效液相色譜；衍生化；熒光檢測

前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)是PG家族眾多成員之一，是一種由花生四烯酸(arachidonic acid，AA)經(jīng)一系列代謝產(chǎn)生的前炎癥細胞因子[1]。其普遍存在于動物的組織和體液中，具有廣泛的生物學活性，其含量極微，除了在人精液中含量較高外,在其他組織和體液中含量大都在ng級(10-9) 以下[2]。傳統(tǒng)試驗中對PGE2的測定，多采用酶聯(lián)免疫試劑盒進行測定；雖然酶聯(lián)免疫法精密度高，但有著試劑盒價格昂貴、樣本要求高和不適合進行大批量樣本實驗的缺點。20世紀80年代以來國外科學家已對多種PGs的測定有不少報道[3-4]，隨著近年來高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)技術的發(fā)展，HPLC被應用于檢測PG家族化合物；然而正常組織和血液中PGE2的含量最高時也僅僅幾納克，這是HPLC在檢測PGE2時具有局限性的主要原因。高效液相熒光檢測(high performance liquid chromatography-fluorescence detection，HPLC-FD)是一種有效提高檢測效率和響應強度的方法，能夠將目標物質通過熒光衍生化轉化為具有熒光反應的次級衍生物進行測定，具有高準確度、高響應強度、更低檢測濃度的優(yōu)勢[5]。因此，本研究希望通過模擬體內花生四烯酸代謝產(chǎn)生PGE2的過程，建立一種新的體外脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)誘導高濃度血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)產(chǎn)生PGE2的模型，并進行了HPLC-FD測定PGE2方法的優(yōu)化研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 前列腺素E2對照品(純度≥93%)，購自Sigma公司；雙環(huán)己基-18-冠醚-6 、4-溴甲基-7-甲氧基香豆素(BrMMC)，購自Sigma公司，用乙腈稀釋，配成4 mmol/L的乙腈溶液(下面分別簡稱衍生試劑A液和B液)避光備用；脂多糖(LPS)和花生四烯酸(AA)標準品，購自Sigma公司；乙腈(色譜純)，購自TEDIA公司；三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)、二水檸檬酸三鈉、檸檬酸、葡萄糖，均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器 精密電子天平(XPE105)，購自METTLER TOLEDO公司；低溫離心機(Centrifuge 5810R)、高速離心機(Centrifuge 5418)，均購自Eppendorf公司；恒溫水浴鍋(HH-S4)，購自金壇市醫(yī)療儀器廠；隔膜真空抽濾機(GM-0.5A)，購自天津市津騰實驗設備有限公司；LC-20AD高效液相色譜儀，配有RF-20A熒光檢測器，SIL-20A自動進樣器，購自SHIMADZU 公司。

1.2 方法

1.2.1 體外LPS誘導PRP產(chǎn)生PGE2模型的構建

1.2.1.1 血液的前處理及模型的建立 取新鮮血液，第1次離心(1 000 r/min，15 min)，分離收集血清和PRP沉淀。將沉淀血漿PRP重溶于等體積的檸檬酸/葡萄糖溶液(27.35 g二水檸檬酸三鈉，0.147 g檸檬酸，27.74 g葡萄糖定容至1 000 mL)。再次離心得到沉淀，沉淀細胞重懸于原體積的Dulbecco's(DPBS)中，得到PRP懸液。

取PRP懸液650 μL/孔，置于48孔板中，均加入50 μL超純水和75 μL LPS溶液(終濃度為100 ng/mL，以DPBS代替LPS作為誘導空白對照組)，37 ℃溫孵15 min。再加入75 μL AA溶液(濃度為0.2 mmol/mL)刺激AA代謝(以等量DPBS緩沖液代替AA作為底物空白對照組)，37 ℃再次溫孵15 min。用0 ℃的0.1 mL的1 mol/L HCl溶液終止反應，轉入1.5 mL離心管，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 樣品前處理及衍生反應 樣品于37 ℃水浴溶解，置于15 mL離心管中，充分混勻后再加入4倍體積的乙酸乙酯，旋渦混合3 min進行提取。4 000 r/min離心10 min，取乙酸乙酯層并干燥除水，于室溫下用氮氣吹干，復溶于200 μL乙腈中，于-20 ℃下保存?zhèn)溆?。測定時,室溫下融化后加入衍生試劑進行衍生化處理。

1.2.2 高效液相色譜-熒光衍生法測定PGE2的方法

1.2.2.1 PGE2標準品濃度梯度設置及柱前衍生反應 取PGE2標準品1 mg溶于乙腈中定容至10 mL作為標準品母液，20℃保存?zhèn)溆?。以二倍稀釋法逐級稀釋，得到標準梯度濃度? 000、2 500、1 250、625、312、156 ng/mL的PGE2標準液。

取各濃度標準液1 mL，分別加入衍生試劑A液和B液各250 μL，再加入無水碳酸鉀10 mg，混勻后水浴中避光反應15 min。冷卻反應液，3 000 r/min離心10 min，取上層清液1 mL過0.22 μm濾膜后進樣10 μL測定。以PGE2的峰面積(A)為縱坐標,質量濃度(C)為橫坐標繪制標準曲線,計算回歸方程及相關系數(shù)。

1.2.2.2 衍生反應及色譜條件的優(yōu)化 Hypersil BDS C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)反向色譜柱；等梯度洗脫：流動相A為水，B為乙腈，均設置添加三個濃度(0%、0.01%、0.1%)的三氟乙酸(TFA)調節(jié)pH；激發(fā)波長313 nm，發(fā)射波長370 nm。柱溫箱預設最低溫度40 ℃；流速1.0 mL/min。

高效液相色譜-熒光衍生法測定前列腺素E2受多因素影響，根據(jù)檢測參數(shù)的設定，預設衍生溫度、柱溫、流動相中TFA添加量、流動相B% 4個考查因素，具體設定如表1所示。

廣西是一個多民族的以壯族為主體，地處我國西南邊陲的地區(qū)，在民族遷徙和千百年的融合中，廣西地區(qū)形成了具有自身特點的耳聾基因突變譜。因此對廣西地區(qū)耳聾高危人群、患病人群進行分子篩查，查找新致病突變、豐富耳聾突變分子譜，有助于本地區(qū)制定相應的耳聾基因篩查策略；指導人群篩查、遺傳咨詢和臨床診斷，并幫助高風險家庭進行產(chǎn)前診斷和醫(yī)學干預，才能達到提高出生人口素質的目標。

表1 考查因素預設值表

2 結果

2.1 柱前熒光衍生條件對結果的影響

PG家族化合物均無天然熒光,其結構中也缺乏與常見熒光衍生試劑結合的基團，故以4-溴甲基-6.7 -二甲氧基香豆素作為羧酸基團的光衍熒生試劑，在雙環(huán)己基-18-冠醚-6和碳酸鉀催化條件下，與PGE2上的羧基進行衍生化反應，生成具有熒光的PGE2-雙香豆素酯[6-8]。因此，衍生化程度對能否完全檢測PGE2影響很大。考察了不同衍生溫度對PGE2的熒光衍生程度的影響，結果表明(圖1)：采用水浴溫度50℃時，PGE2的檢測響應度最高，即衍生化程度最高。

圖1 不同衍生溫度對PGE2衍生化程度的影響

2.2 流動相的選擇

2.2.1 流動相酸堿度對分離結果的影響 在反相HPLC中色譜峰拖尾是一個普遍的現(xiàn)象，峰拖尾可以引起分離度降低，靈敏度減弱，精密度和定量變差降低，而加入對電子具有競爭性的酸性添加劑可消除拖尾現(xiàn)象[9]。分別考察了添加0%、0.01%、0.1%三個濃度TFA的水和乙腈作為流動相對PGE2的分離情況，并對整個出峰范圍和峰型進行了比較。結果表明(表2)：采用添加了0.1% TFA的流動相時，整個方法的精確度最高，且色譜圖中各峰分離情況最好，PGE2的峰型無拖尾現(xiàn)象。

表2 流動相中AcCl3不同添加量對精確度及峰型的影響

2.2.2 流動相不同比例對分離結果的影響 通過改變B泵有機相的比例設置，考查了混合后乙腈濃度分別為50%、55%、60%、65%、70% 5個標準進行等梯度洗脫。結果表明(圖2)，當乙腈濃度≥55%時即可完全分離各有效峰，且隨著乙腈濃度比例的增大，色譜峰的保留時間縮短，但各峰之間的分離度將越差。通過對各峰分離情況及保留時間的分析考慮，乙腈濃度為55%～60%時均可在10 min內出峰，且各峰分離良好，為最佳流動相濃度比例范圍。

圖2 不同比例的流動相對PGE2分離情況的影響

島津LC-20AD型高效液相色譜儀可設置的最低柱溫為40 ℃，并考慮BDS色譜柱的耐受溫度，設置了室溫、40 ℃、45 ℃、50 ℃和55 ℃進行比較。結果表明(圖3)，室溫下因機器內溫度變化大，多次測定的保留時間偏差較大，故不考慮以常溫作為檢測溫度；而預設柱溫后，儀器內部溫度穩(wěn)定，出峰時間均在6 min～7 min內，溫度對保留時間的影響是以0.031 min/℃減少。綜合結果及對儀器損耗、保護柱子等多方面考慮，設置柱溫40 ℃即可保證保留時間的穩(wěn)定和檢測效率。

2.4 方法的線性范圍、精密度與檢出限

通過對衍生溫度、柱溫、流動相pH、流動相比例四個因素進行考查，選擇最優(yōu)檢測條件。本法檢測的線性范圍較寬，擬合標準曲線回歸方程，其中x為待測組分標準溶液的濃度，y為相應的色譜峰面積(圖4)。并以3倍信噪比計算PGE2的最低檢出限，得出最佳檢測方法如表3所示。對整個濃度梯度范圍的標準品進行了日內、日間差異測定。結果表明(表3)，整個濃度梯度的標準品測定，日內精密度低于7.0%，日間精密度低于4.4%。

圖3 不同柱溫對PGE2保留時間的影響(N=4)

圖4 PGE2液相熒光檢測色譜圖

2.5 模型構建的結果

本試驗分為誘導試驗組、誘導空白對照組和底物空白對照組，通過優(yōu)化后的檢測方法，對PRP懸液中PGE2的表達情況進行了測定，其中誘導試驗組(157.476±36.104) ng/mL，誘導空白對照組(11.416±2.034)ng/mL，而底物空白對照組中未檢測到PGE2。表明AA作為體外PGE2代謝模型的關鍵底物，在加入誘導物質LPS后，AA可大量代謝生成為PGE2。

表3 最佳檢測方法的各項參數(shù)

3 討論

本模型從花生四烯酸代謝系統(tǒng)入手，包括由環(huán)氧酶催化形成的前列腺素內過氧化物，這種不穩(wěn)定、半衰期短的內過氧化物在血栓素異構酶的作用下立即生成血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)，TXA2也很不穩(wěn)定，隨即形成穩(wěn)定的非酶水解產(chǎn)物血栓素B2(thromboxane B2，TXB2)。環(huán)氧酶抑制劑可降低TXB2的形成，特異性抑制血栓素異構酶，可立即導致前面所述的內過氧化物的堆積，這一過程是由于其化學性質不穩(wěn)定性而并不是非酶催化的PGE2前體物生成的結果[10-12]。因而，TXA2-異構酶的抑制可導致PGE2的生成，而TXB2峰值減少。

因此，該模型可作為花生四烯酸代謝拮抗藥物的篩選模型，根據(jù)代謝途徑及物質轉化途徑，可發(fā)展為AA、PGE2、TXB2同時進行定性與定量測定，并進一步研究拮抗劑抑制途徑和抑制對象，為抗炎活性成分的初步篩選提供一種快速、精準、簡單的有效手段。

表4 各濃度的日內、日間精密度

圖5 各組PGE2的表達量情況

[1] Hartzell C J,Andersen N H.Mass spectrometric fragmentation patterns for the Syn and Anti isomers of PGE2and PGD2-methyloxime methyl esters and their analogs[J].Biomed Mass Spectromet,1985,12(7):303-308.

[2] Linssen P,Nthe-Schonk A,Wessels H,et al.Determination of cytosine arabinoside triphosphate in leukemic cells by isocratic high-performance anion-exchange column chromatography[J].J Chromatogr,1982,232(2):424-9.

[3] Amin M.Simultaneous determination of prostaglandins (PG) E2,A2and B2and stability studies of PGE2in pharmaceutical preparations by ion-pair reversed phase HPLC[J].Pharmaceutica Acta Helvetiae,1989,64(2):45-50.

[4] Gréen K,Kimball F A,B A,Thornburgh,et al.Quantitative determination of 9-deoxo-16,16-dimethyl-9-methylene-PGE2in human plasma by GC-MS,RIA and HPLC[J].Prostaglandins,1980,20(4):767-780.

[5] 楊 沛.新型高靈敏熒光試劑在高效液相色譜中的應用研究[D].遼寧大連：中國科學院大連化學物理研究所,2001.

[6] 呂湘林,汪秀云.前列腺素分析測定方法的現(xiàn)狀[J].藥學學報,1985(8):633-640.

[7] 楊秋生,金有豫,王津生.血栓素B2的高效液相熒光測定及刺五加提取物的抗血小板作用[J].首都醫(yī)學院學報,1991(3):171-179.

[8] 謝珍茗,施文兵,劉 嵐,等.熒光試劑柱前衍生高效液相色譜-熒光檢測生物檢材中的氟乙酸鈉[J].分析科學學報,2007(6):685-688.

[9] 黃 虎,金京玉,李元宰.多糖衍生物手性固定相上采用酸性或堿性添加劑的流動相拆分β受體阻滯劑對映體[J].色譜,2009(4):467-471.

[10] Weithmann K U,Jeske S,Schlotte V.Effect of leflunomide on constitutive and inducible pathways of cellular eicosanoid generation.[J].Agents Actions,1994,41(3-4):164-170.

[11] Smith W L,Meade E A,Dewitt D L.Pharmacology of prostaglandin endoperoxide synthase isozymes-1 and -2.[J].Annals New York Acad Sci,1994,714(714):136-42.

[12] Vane S J.The evolution of non-steroidal anti-inflammatory drugs and their mechanisms of action[J].Drugs,1987,33(S):18-27.

Construction of LPS-induced PGE2ProductioninVitroModel from PRP and Optimization of HPLC With Fluorescence Derivatization Method

ZHU Xiang-yu1,CAO Zhi-fang1,YANG Yu-hui2,CAI Xi-heng1,JIANG Ya-lei1,CHEN Tao1
(1.CollegeofAgriculture,HainanUniversity,Hainan,Haikou,570228,China；2.HainanKeyLabofTropicalAnimalReproduction&BreedingandEpidemicDiseaseControl，Hainan,Haikou,570228,China)

To study the new method of arachidonic acid(AA)metabolic antagonist screening,this article established a new inflammatory modelinvitrolipopolysaccharides(LPS)-induced platelet-rich plasma(PRP)suspension of AA metabolism of prostaglandin E2(PGE2),through the simulation of the metabolism of AA PGE2production in the process,and optimized HPLC with fluorescence derivative method for determination of PGE2.The results showed that By 50℃ water bath reaction,the highest degree in derivatization and HPLC-FD test best conditions were the column temperature 40 ℃,the flow of water to add 0.1% trifluoroacetic acid(TFA):acetonitrile(40∶60),the flow rate of 1 mL/min,Brmmc-PGE2retention time was 6.562 min.Invitromodel,LPS+AA induced test group (157.476±36.104) ng/mL,LPS induced blank control group (11.416±2.034) ng/mL,but PGE2wasn’t detected in AA substrates blank control group.It showed that AA as the key substrateinvitrometabolism of PGE2model,will become the large number of PGE2after adding LPS induced material.

PGE2; LPS; HPLC; derivatized; fluorescence detection

2016-05-31

海南省科技廳“產(chǎn)學研一體化”項目(cxy20150021)

朱翔宇(1995-)，內蒙古人，男，本科，主要從事獸醫(yī)藥理學研究。*通訊作者

S852.2

A

1007-5038(2017)06-0033-05