TGF-β受體1和p38MAPK在綿羊不同部位皮膚中的表達(dá)差異

曹校瑞，盧嘉茵，吳 瓊，程笳琪，牛 姝，赫曉燕

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801)

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TGF-β受體1和p38MAPK在綿羊不同部位皮膚中的表達(dá)差異

曹校瑞，盧嘉茵，吳 瓊，程笳琪，牛 姝，赫曉燕*

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801)

綿羊毛發(fā)的生長(zhǎng)速度因部位的不同而存在差異，綿羊腹股溝及耳部的毛發(fā)生長(zhǎng)速度慢，而背部的毛發(fā)生長(zhǎng)速度快長(zhǎng)。研究表明，多種因素會(huì)影響動(dòng)物毛發(fā)的生長(zhǎng)速度及其他性狀，其中MAPK信號(hào)通路在皮膚發(fā)育及毛發(fā)生長(zhǎng)過(guò)程中有一定的調(diào)控作用。應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)TGF-β受體1及p38MAPK在綿羊背部、耳部以及腹股溝部皮膚的表達(dá)水平與定位進(jìn)行研究，以探討TGF-β受體1及p38MAPK與綿羊毛發(fā)生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系。結(jié)果顯示，TGF-β受體1及p38MAPK在綿羊的背部、耳部與腹股溝部均有表達(dá)，且p38MAPK在背部表達(dá)量最多，耳部次之，腹股溝部最少；而TGF-β受體1在耳部毛囊中的表達(dá)量最高，腹股溝部次之，在背部毛囊中的表達(dá)量最低。研究結(jié)果提示，TGF-β受體1及p38MAPK可能與綿羊毛發(fā)的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。

TGF-β受體1；p38MAPK；綿羊；不同部位；生長(zhǎng)發(fā)育

動(dòng)物皮毛的生長(zhǎng)極為復(fù)雜，受到遺傳、外界環(huán)境、代謝、營(yíng)養(yǎng)等各種因素的影響[1-2]。遺傳因素作為皮毛生長(zhǎng)的決定性因素，許多基因都直接或者間接的影響動(dòng)物毛發(fā)生長(zhǎng)，目前發(fā)現(xiàn)200多種因子會(huì)影響綿羊的毛發(fā)生長(zhǎng)，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic,BMP)、WNT(wingless-relatedMMTV integration site WNT)、成纖維生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factors,FGF)、神經(jīng)因子(neurotrophins)、β-catenin、EDA/EDAR、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)等[3-5]。其中，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中，是真核細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)到細(xì)胞內(nèi)并引起細(xì)胞反應(yīng)的一類重要的信號(hào)通路，從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化，對(duì)動(dòng)物毛發(fā)的生長(zhǎng)和發(fā)育有著重要的作用[6]。TGF-β受體1是單次跨膜糖蛋白，屬絲/蘇氨酸激酶受體家族，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)等3個(gè)部分組成，是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要受體，其活化是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的起點(diǎn)，在MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中處于核心地位，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期，影響細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、黏附、遷移和凋亡等過(guò)程[7]。p38MAPK于1993年由Brewster等發(fā)現(xiàn)，Han等用高滲和內(nèi)毒素刺激小鼠肝臟細(xì)胞，分離純化出分子質(zhì)量為38 ku的酪氨酸磷酸化蛋白激酶——p38 MAPKs，目前的研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK參與了應(yīng)激反應(yīng)，并且在細(xì)胞凋亡、分化、增殖等方面扮演重要的角色，同時(shí)也參與炎癥反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)P38MAPK在細(xì)胞生長(zhǎng)周期的調(diào)控中發(fā)揮了重要的作用[8]。由文獻(xiàn)可知，綿羊不同部位毛發(fā)的生長(zhǎng)速度存在明顯差異，耳部、腹股溝部毛發(fā)生長(zhǎng)速度慢而背部毛發(fā)生長(zhǎng)速度快[9],但TGF-β受體1和p38MAPK是否與綿羊不同部位的生長(zhǎng)速度有關(guān)還不清楚。

本試驗(yàn)采用同等條件下飼養(yǎng)3歲白色綿羊作為研究對(duì)象，利用免疫組織化學(xué)方法觀察TGF-β受體1和p38MAPK生長(zhǎng)因子在綿羊耳部、背部以及腹股溝部皮膚的分布，以探討TGF-β受體1和p38MAPK對(duì)綿羊毛發(fā)生長(zhǎng)發(fā)育的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物及取材 白色綿羊3只(編號(hào)①，②，③)，將其腹股溝部、耳部、背部剃毛后，用取皮器分別取其一塊組織樣品，立即將其置于Bouin氏固定液中，24 h后，通過(guò)洗滌、梯度酒精脫水、二甲苯透明、透蠟、包埋、修塊、切片、展片、貼片，制成7 μm厚的組織切片，用于免疫組織化學(xué)分析。

1.1.2 主要試劑與耗材 兔Streptavidin-HRP試劑盒(康維世紀(jì))，兔抗p38MAPK抗體(bs-0637R，abcam)，兔抗 TGF-β受體1抗體(bs-0637R，abcam)，蘇木精，中性樹脂，梯度酒精，二甲苯，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，氯化鈉等。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片的制備 常規(guī)方法制片，片厚7 μm。組織修整→脫水、透明→浸蠟→包埋→修塊→切片、展片、烤片，做好標(biāo)記，放入切片盒備用。

1.2.2 免疫組織化學(xué)試驗(yàn) 采用免疫組化試劑盒，按說(shuō)明書進(jìn)行試驗(yàn)。切片脫蠟與復(fù)水→封閉→滴加一抗(分別滴加兔抗p38MAPK抗體、兔抗 TGF-β受體1抗體)→孵育→PBS緩沖液沖洗→滴加二抗→PBS緩沖液沖洗→滴加SABC→PBS緩沖液沖洗→DAB顯色→蘇木精染色→封片，采集圖像，每個(gè)樣品取6張切片，每張切片選取5個(gè)視野。

1.2.3 圖像采集與數(shù)據(jù)分析 使用圖像分析軟件Image-proplus6.0，對(duì)制成的切片進(jìn)行觀察并進(jìn)行光密度測(cè)試，對(duì)每張切片采集的5個(gè)視野進(jìn)行測(cè)試，得出每個(gè)樣品的陽(yáng)性反應(yīng)平均光密度值。使用SPPS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過(guò)描述統(tǒng)計(jì)表分析得到每組值的均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β受體1在綿羊皮膚中的表達(dá)

結(jié)果顯示，TGF-β受體1陽(yáng)性免疫反應(yīng)物在綿羊耳部、背部、腹股溝部的皮膚毛囊中都有存在，而且分布在在外毛根鞘及其周圍更廣泛的區(qū)域,并且耳部表達(dá)最為明顯，背部和腹股溝部次之(圖1)。

2.2 p38MAPK在綿羊皮膚中的表達(dá)

結(jié)果顯示，p38MAPK陽(yáng)性免疫反應(yīng)物在綿羊耳部、背部、腹股溝部的皮膚毛囊中都有存在,而且在結(jié)締組織中也有表達(dá),并且背部表達(dá)最為明顯，耳部和腹股溝次之(圖2)。

2.3 圖像分析及統(tǒng)計(jì)結(jié)果

分別將TGF-β受體1及 p38MAPK表達(dá)在綿羊1、綿羊2、綿羊3的背部、腹股溝部和耳部組織中的情況利用圖像分析軟件和Spss軟件進(jìn)行分析(表1)。

表中數(shù)據(jù)表示TGF-β受體1和p38MAPK在綿羊背部、耳部、腹股溝部的光密度平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，不同的字母表示在統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果中，其數(shù)值不在同一列，表示差異顯著，相同字母表示差異不顯著。

3 討論

羊毛的生長(zhǎng)基礎(chǔ)是毛囊，眾多研究顯示，與毛囊生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)的200多種分子中，MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑占到分子總數(shù)的19.53%[10]。研究顯示，MAPK與褪黑素存在著較為復(fù)雜的關(guān)系，趙德超等在進(jìn)行褪黑素埋植試驗(yàn)中檢測(cè)并發(fā)現(xiàn)，在諸多因子中，MAPK受褪黑素的影響最大[11]。1983年，Rose等通過(guò)埋植褪黑素誘發(fā)水貂冬毛提早生長(zhǎng)，后來(lái)的一些學(xué)者經(jīng)過(guò)努力研究，證明了褪黑素確實(shí)能誘導(dǎo)例如小鼠及安哥拉兔等提早生毛,證明褪黑素可以調(diào)節(jié)動(dòng)物毛發(fā)的生長(zhǎng)；常子麗等通過(guò)持續(xù)埋植褪黑發(fā)現(xiàn)持續(xù)埋植褪黑素對(duì)羔羊粗毛有變細(xì)的趨勢(shì)，而且有增加產(chǎn)絨量的趨勢(shì)，促使毛發(fā)提前生長(zhǎng)。而TGF-β受體1及p38MAPK作為絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的重要成員，同時(shí)也參與了褪黑素在某些疾病中的作用機(jī)制。TGF-β通路參與眾多生理生化過(guò)程，已有研究表明在動(dòng)物毛囊發(fā)育和被毛生長(zhǎng)過(guò)程中，TGF-β相關(guān)因子等參與了調(diào)控。TGF-β受體1是通路中的Ⅰ型受體，來(lái)自細(xì)胞外的信號(hào)分子與TGF-βRⅡ結(jié)合后，使得TGF-β受體1發(fā)生磷酸化并且形成四聚體，將信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理活動(dòng)，進(jìn)而影響動(dòng)物毛發(fā)的生長(zhǎng)發(fā)育。p38MAPK作為一種重要的信號(hào)通路，能夠迅速地對(duì)外界的刺激作出反應(yīng)，并及時(shí)與其他信號(hào)通路共同合作，避免機(jī)體的損傷。同時(shí)以上的討論也提示我們，p38MAPK也可能是影響毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)因子，鑒于它與褪黑素之間的關(guān)系以及目前的研究，p38MAPK可能對(duì)動(dòng)物毛發(fā)的生長(zhǎng)發(fā)育有著較大影響。由文獻(xiàn)推測(cè)，TGF-βRI及p38MAPK可能是影響毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的重要因子。

A1、B1、C1.分別表示綿羊耳部、腹股溝部和背部的陽(yáng)性結(jié)果; a1、b1、c1.分別表示綿羊耳部、腹股溝部和背部的陰性結(jié)果

A1,B1,C1.Respectively represent the positive results of sheep ear,groin and back; a1,b1,c1. Respectively represent the negative results of sheep ear,groin and back

1.毛母質(zhì)細(xì)胞;2.內(nèi)根鞘;3.外根鞘

1.Hair matrix cell;2.Inner root sheath; 3.Outer root sheath

圖1 TGF-β受體1在綿羊1耳部、背部和腹股溝部皮膚中的表達(dá)情況

Fig.1 Expression of TGF-β R1 in 1 sheep ears,back and groin skin

前期觀察發(fā)現(xiàn)，綿羊背部的毛發(fā)生長(zhǎng)速度最快，而腹股溝部的毛發(fā)生長(zhǎng)速度次之，耳部的毛發(fā)生長(zhǎng)速度最慢。本試驗(yàn)中，TGF-β受體1及p38MAPK在綿羊背部、耳部及腹股溝部均有表達(dá)，但表達(dá)量存在明顯差異。TGF-β受體1在耳部的相對(duì)表達(dá)量高于腹股溝部，腹股溝部的表達(dá)量高于背部，TGF-β受體1與毛發(fā)的生長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)，提示TGF-β受體1可能抑制了毛發(fā)的生長(zhǎng)。p38MAPK在綿羊背部的表達(dá)量高于耳部，耳部的表達(dá)量高于腹股溝部，p38MAPK與綿羊毛發(fā)的生長(zhǎng)速度呈正相關(guān)，表達(dá)量越多，毛發(fā)生長(zhǎng)速度越快，反之越慢，提示p38MAPK可能促進(jìn)毛發(fā)的生長(zhǎng)。而TGF-β受體1與p38MAPK對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)的確切作用、二者在毛發(fā)生長(zhǎng)調(diào)控中是否存在相互關(guān)系等還有待于后續(xù)研究的證明。

免疫組織化學(xué)研究結(jié)果顯示，TGF-β受體1在綿羊耳部的表達(dá)量最多，腹股溝部次之，背部最少，TGF-β受體1與毛發(fā)的生長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)，提示TGF-β受體1可能抑制毛發(fā)生長(zhǎng)；而p38MAPK在綿羊背部的表達(dá)量最多，耳部次之，腹股溝部最少，p38MAPK與綿羊的毛發(fā)生長(zhǎng)呈正相關(guān)，提示p38MAPK可能促進(jìn)毛發(fā)的生長(zhǎng)。

A2、B2、C2.分別表示綿羊耳部、腹股溝部和背部的陽(yáng)性結(jié)果;a2、b2、c2.分別表示綿羊耳部、腹股溝部和背部的陰性結(jié)果

1.毛乳頭;2.毛母質(zhì);3.內(nèi)根鞘;4.外根鞘;5.皮脂腺

A2,B2,C2.Respectively represent the positive results of sheep ear,groin and back; a2,b2 and c2. Respectively represent the negative result of sheep ear,groin and back

1.Hair papilla hair matrix; 2.Inner root sheath; 3.Inner root sheath; 4.External root sheath; 5.Sebaceous gland

圖2 p38MAPK在綿羊1耳部、背部和腹股溝部皮膚中的表達(dá)情況

Fig.2 Expression of p38MAPK in 1 sheep ears,back and groin skin

表1 TGF-β受體1及p38MAPK在3只綿羊背部、耳部、腹股溝部的平均光密度值

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Differential Expressions of TGF-βR1 and p38MAPK in Different Part of Sheep Skin

CAO Xiao-rui1,LU Jia-yin1,WU Qiong1,CHENG Jia-qi1,NIU Shu1,HE Xiao-yan1
(CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu，Shanxi，030801,China)

There are differences on hair growth and development in the different parts of sheep.The hairs in groin and ear grow slowly.However,the back hairs grow fast.Some study showed that a lots factors influence animal hair growth speed and other structure characteristics,and MAPK signal pathway has a regulatory role in the development of skin and hair growth process,which TGF-βR1and p38MAPK have very important promote faction to the sheep hair growth.In order to explore the relationship between TGF-βR1,p38MAPK and sheep hair growth,the expression levels and localization of TGF-βR1and p38MAPK in skin hair follicle of sheep’s back ,ear and groin were examined by immunohistochemical technique.The results showed that TGF-βR1 and p38MAPK proteins were expressed in the sheep’ back,ear and groin,and the back up to the amount of p38MAPK expression,followed by ear,groin was the least,but the exprestsion of TGF-βR1in the ear hair follicles in the inguinal area was the highest,the lowest expression in the hair follicle of the back.The results suggested that TGF-βR1and p38MAPK may be related to the growth and development of sheep hair.

TGF-βR1; p38MAPK; sheep; differnt parts; growth and development

2016-10-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172283)

曹校瑞(1993-)，男，山西翼城人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物毛發(fā)生長(zhǎng)分子機(jī)制研究。*通訊作者

S852.16

A

1007-5038(2017)06-0024-05