DAPT在ox-LDL損傷HUVECs過(guò)程中的細(xì)胞保護(hù)作用*

任開(kāi)新， 樊子旭， 游如春， 韓蔚珉， 張 然， 黃 銳， 閆國(guó)良， 張 業(yè)

(廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 福建 廈門(mén) 361102)

·短篇論著·

DAPT在ox-LDL損傷HUVECs過(guò)程中的細(xì)胞保護(hù)作用*

任開(kāi)新， 樊子旭， 游如春， 韓蔚珉， 張 然， 黃 銳， 閆國(guó)良?， 張 業(yè)?

(廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 福建 廈門(mén) 361102)

目的： 探究γ-分泌酶抑制劑N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT)在氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)模型中的細(xì)胞保護(hù)作用及其對(duì)Notch信號(hào)通路的調(diào)控。方法: 體外培養(yǎng)HUVECs，用ox-LDL處理HUVECs構(gòu)建細(xì)胞損傷模型。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、ox-LDL處理組、DAPT處理組和DAPT+ox-LDL處理組。用倒置相差顯微鏡觀察不同處理方法下細(xì)胞的形態(tài)變化；CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率；Western blot法檢測(cè)蛋白Notch1、Notch4和Jagged1的表達(dá)情況。結(jié)果: 體外培養(yǎng)HUVECs，倒置相差顯微鏡下發(fā)現(xiàn)ox-LDL處理組細(xì)胞死亡和碎片增多，經(jīng)DAPT預(yù)處理后，ox-LDL作用造成的細(xì)胞損傷死亡較少，細(xì)胞碎片較少。通過(guò)CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ox-LDL處理組細(xì)胞存活率降低，DAPT處理組細(xì)胞存活率升高，DAPT預(yù)處理后ox-LDL造成存活率降低的幅度變小。在ox-LDL作用下，Notch1和Jagged1蛋白表達(dá)量降低，Notch4表達(dá)量升高；而DAPT作用下Notch1和Jagged1表達(dá)量升高，Notch4表達(dá)量降低；ox-LDL與DAPT共同作用時(shí)蛋白接近正常水平。結(jié)論: ox-LDL對(duì)HUVECs具有損傷作用； DAPT減輕ox-LDL對(duì)HUVECs造成的損傷； DAPT保護(hù)HUVECs免受ox-LDL損傷的作用與Notch信號(hào)通路有關(guān)。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞； 氧化低密度脂蛋白； DAPT； Notch信號(hào)通路

血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管壁的主要屏障，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷時(shí)，會(huì)導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成，從而誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，此外，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的屏障作用缺失時(shí)，會(huì)引發(fā)血小板聚集、凝血，促進(jìn)血栓性疾病的發(fā)生[1-2]。目前許多研究發(fā)現(xiàn)氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)可以造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，是動(dòng)脈粥樣硬化等許多心血管疾病發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要因素[3]。有研究表明ox-LDL可以激活Notch信號(hào)通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞激活引起炎癥反應(yīng)[4]，我們由此推測(cè)兩者在血管內(nèi)皮細(xì)胞中也有一定的關(guān)聯(lián)。既往關(guān)于Notch信號(hào)通路在血管中的研究主要集中于新生血管發(fā)育與成熟的過(guò)程，但是缺乏在ox-LDL損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)程中是否具有保護(hù)作用的相關(guān)研究。同時(shí)，γ-分泌酶抑制劑N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phe-nylglycine t-butyl ester (DAPT)可以抑制Notch信號(hào)通路上的相關(guān)位點(diǎn)[5]。因此我們推測(cè)ox-LDL損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)可能與Notch信號(hào)通路有關(guān)聯(lián)，并且DAPT對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞可能具有一定的保護(hù)作用。本研究以體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)為研究模型，研究DAPT在ox-LDL損傷HUVECs過(guò)程中是否具有細(xì)胞保護(hù)作用，以及DAPT對(duì)Notch信號(hào)通路的調(diào)控情況。

材 料 和 方 法

1 材料

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(ATCC)由廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院器官移植研究所李成林博士惠贈(zèng)。

2 主要試劑

培養(yǎng)基DMEM/F-12購(gòu)自HyClone；人表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)購(gòu)自 PeproTech；anti-Notch1抗體、anti-Notch4抗體和anti-Jagged1抗體均購(gòu)自Abcam；氧化低密度脂蛋白購(gòu)自廣州奕源生物公司；DAPT購(gòu)自Sigma；Cell Counting Kit-8 (CCK-8)購(gòu)自Dojindo。

3 主要方法

3.1 HUVECs體外培養(yǎng) HUVECs培養(yǎng)在DMEM/F-12培養(yǎng)基中，其中含7%的優(yōu)質(zhì)胎牛血清和EGF 5 μg/L，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿時(shí)傳代，吸去培養(yǎng)液，用PBS輕柔洗2次，胰酶消化2～3 min，待細(xì)胞脫落后，加入適量培養(yǎng)基終止胰酶的消化作用，收集細(xì)胞于離心管中，離心1 000 r/min、3 min，棄上清，用新的培養(yǎng)基1 mL重懸細(xì)胞，按1∶5接種于新培養(yǎng)基中。

3.2 藥物處理和分組 (1)對(duì)照組：正常培養(yǎng)24 h；(2)DAPT處理組：待細(xì)胞貼壁后給予25 μmol/L DAPT作用24 h；(3)ox-LDL處理組：同一批細(xì)胞貼壁后12 h給予100 mg/L ox-LDL作用12 h；(4)DAPT+ox-LDL處理組：待同一批細(xì)胞貼壁后先給予25 μmol/L DAPT預(yù)處理12 h，再給予100 mg/L ox-LDL作用12 h。

3.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將貼壁長(zhǎng)滿的HUVECs用胰蛋白酶進(jìn)行消化，細(xì)胞懸液接種于直徑2 cm的培養(yǎng)皿，細(xì)胞密度1×105/L，每皿1 mL，按以上分組給藥。培養(yǎng)箱培養(yǎng)孵育后倒置相差顯微鏡下觀察。

3.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 胰酶消化HUVECs，以每孔8×103個(gè)接種于96孔板。按常規(guī)培養(yǎng)方式復(fù)蘇細(xì)胞活力2 h，待細(xì)胞貼壁后給藥，按分組給藥。藥物處理后用PBS洗去含藥培養(yǎng)基，每孔加入新培養(yǎng)基100 μL及CCK-8試劑10 μL，孵育120 min。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm處的吸光度(A)值，各組的A值取均數(shù)用于計(jì)算細(xì)胞存活率。計(jì)算公式：細(xì)胞存活率(%) =(藥物處理組A值-空白組A值)/(無(wú)藥物處理組A值-空白組A值)×100%。

3.5 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白變化 取HUVECs 1×108/L接種于10 cm培養(yǎng)皿，按分組給藥。培養(yǎng)后用RIPA裂解液，含1×cocktail裂解細(xì)胞，并用細(xì)胞刮子充分刮下貼壁細(xì)胞，收集后搖床上冰水浴搖晃45 min，12 000×g、4 ℃ 離心10 min取上清。取蛋白樣品5 μL，用BCA試劑盒測(cè)定樣品濃度。余下部分加入loading buffer 煮沸5 min，-20 ℃凍存，留待上樣。各個(gè)蛋白樣品取30 μg上樣，10% SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜 6 min×3次。室溫孵育 I 抗(Notch1 1∶2 000， Notch4 1∶1 000， Jagged1 1∶1 000)1 h，TBST洗膜6 min×3次。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗人IgG(Notch1 1∶2 000， Notch4 1∶250， Jagged1 1∶1 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜6 min×3次。加入現(xiàn)配制的ECL顯色液，避光2 min，貼膜曝光。以β-actin蛋白作為內(nèi)參照，用ImageJ灰度分析后行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 藥物對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

對(duì)照組的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞胞漿豐富，胞核大，細(xì)胞間連接緊密，邊界清楚，呈單層鋪路石狀排列，細(xì)胞呈多角形、梭形或卵圓形。ox-LDL處理組細(xì)胞分解死亡，細(xì)胞碎片增多。DAPT處理組和對(duì)照組無(wú)明顯區(qū)別，細(xì)胞排列緊密整齊。經(jīng)過(guò)DAPT預(yù)處理12 h后再給ox-LDL作用12 h組，細(xì)胞較ox-LDL組死亡較少，碎片較少，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The light-microscopic images of HUVECs 24 h after treatment (×200).

圖1 藥物對(duì)細(xì)胞形態(tài)影響

2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ox-LDL組細(xì)胞存活率下降，DAPT處理組細(xì)胞存活率升高，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；經(jīng)過(guò)DAPT預(yù)處理后加入ox-LDL的細(xì)胞與ox-LDL處理組相比存活率升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，而與對(duì)照組相比，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖2。

3 Western blot法檢測(cè)蛋白變化

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Jagged1和Notch1在DAPT影響下表達(dá)降低，在ox-LDL影響下表達(dá)增加，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，而經(jīng)過(guò)DAPT預(yù)處理后，ox-LDL對(duì)Jagged1和Notch1表達(dá)的影響變小，與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；相反地，蛋白Notch4在DAPT影響下表達(dá)升高，在ox-LDL影響下表達(dá)降低，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，而經(jīng)過(guò)DAPT預(yù)處理后，ox-LDL對(duì)Notch4表達(dá)的影響變小，與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖3。

Figure 2.The viability of the HUVECs treated with DAPT, ox-LDL and in combination. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsDAPT group;#P<0.05vsox-LDL group.

圖2 DAPT干預(yù)條件下ox-LDL對(duì)HUVECs存活率的影響

Figure 3.The changes of protein expression of Notch1, Notch4 and Jagged1. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsDAPT group;#P<0.05vsox-LDL group.

圖3 藥物對(duì)蛋白表達(dá)的影響

討 論

內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是許多心血管疾病的始動(dòng)環(huán)節(jié)，如動(dòng)脈粥樣硬化，血栓形成等，而已有的研究表明ox-LDL是誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能受損的重要因素。因此研究ox-LDL對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制以及尋找保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受ox-LDL損傷具有重要意義。

我們以不同濃度的ox-LDL處理HUVECs，發(fā)現(xiàn)隨著濃度增加，ox-LDL對(duì)細(xì)胞的損傷程度逐漸加大，與相關(guān)研究結(jié)果一致[6]。對(duì)于ox-LDL損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制，以往研究發(fā)現(xiàn)其通過(guò)與細(xì)胞上的凝集素樣氧化性低密度脂蛋白受體-1結(jié)合而使血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[7-8]。其中，ox-LDL可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活NF-κB，降低內(nèi)皮型一氧化氮合酶活性，減少一氧化氮生成，同時(shí)增加乳酸脫氫酶和白細(xì)胞介素-8的釋放和環(huán)氧化酶-2的表達(dá)，引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[9-10]。但是目前國(guó)內(nèi)外缺乏關(guān)于ox-LDL對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷過(guò)程中Notch信號(hào)通路影響的研究。

Notch信號(hào)通路廣泛存在幾乎所有細(xì)胞，調(diào)控著不同細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，對(duì)不同的器官組織發(fā)揮不同效應(yīng)[11-12]。Notch 信號(hào)通路在相鄰細(xì)胞之間通過(guò)配體與受體相互結(jié)合而影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，人源細(xì)胞中配體包括Delta樣配體(Dll1、3、4)與Jagged(Jagged1、2)，受體包括Notch1～4[13]。近來(lái)研究表明，Notch信號(hào)通路和動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展也有密切關(guān)系[14]。同時(shí)也有研究表明在ox-LDL刺激巨噬細(xì)胞過(guò)程中，Notch信號(hào)通路受體Notch1升高，可以增加NF-κB的活性，從而損傷巨噬細(xì)胞[15]。因此我們推斷在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷過(guò)程中，ox-LDL與Notch信號(hào)通路存在相關(guān)聯(lián)系，而Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT可以保護(hù)HUVECs免受ox-LDL損傷。

我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)DAPT可以減少ox-LDL造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷形成的細(xì)胞碎片，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率發(fā)現(xiàn)DAPT能提高ox-LDL作用下HUVECs的存活率，由此驗(yàn)證了我們之前的推斷，即在ox-LDL損傷HUVECs的模型中，DAPT可以起到保護(hù)細(xì)胞，減少細(xì)胞損傷的作用。

DAPT通過(guò)抑制γ-分泌酶使Notch受體胞內(nèi)段(Notch intracellular domain，NICD)水解和釋放，導(dǎo)致游離NICD減少，NICD對(duì)下游通路的激活減少，從而發(fā)揮效應(yīng)[16]。在我們研究中，通過(guò)對(duì)蛋白Notch1、Notch4和Jagged1的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在ox-LDL與DAPT各自影響下，蛋白表達(dá)量增減完全相反，因此說(shuō)明ox-LDL與DAPT在血管內(nèi)皮細(xì)胞的Notch信號(hào)通路上影響是完全相反的。據(jù)Pedrosa 等[17]研究表明，Jagged1對(duì)于平衡體內(nèi)血管內(nèi)皮的生長(zhǎng)和成熟具有重要作用，在傷口愈合過(guò)程中，Dll4/Notch1信號(hào)途徑會(huì)抑制血管內(nèi)皮的覆蓋和血管生長(zhǎng)，但這個(gè)過(guò)程又會(huì)激活Jagged1，Jagged1卻可以通過(guò)Jagged1/Notch4信號(hào)途徑抵消這種作用，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞成熟后血管生長(zhǎng)，從而促進(jìn)傷口愈合。結(jié)合我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為ox-LDL可能通過(guò)Dll4/Notch1信號(hào)途徑使HUVECs損傷，同時(shí)會(huì)抑制具有平衡作用的Jagged1/Notch4信號(hào)途徑，進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷，由于受體Notch4表達(dá)被抑制，使得相應(yīng)配體Jagged1反饋性升高。同理，DAPT可以抑制Dll4/Notch1信號(hào)途徑，減少細(xì)胞損傷，通過(guò)激活Jagged1/Notch4信號(hào)途徑而使HUVECs增殖成熟，使損傷血管壁再內(nèi)皮化。因此DAPT可以拮抗ox-LDL對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，同時(shí)保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞再生和成熟，對(duì)保護(hù)血管壁的完整性有重要意義。

對(duì)于Notch信號(hào)通路，仍存在許多機(jī)制尚未明確，可能在ox-LDL影響下，Notch信號(hào)通路的其它蛋白亦會(huì)發(fā)生不同改變。由于還存在不依賴經(jīng)γ-分泌酶水解過(guò)程的非經(jīng)典Notch信號(hào)通路，DAPT不能完全阻斷Notch信號(hào)通路下游靶基因的表達(dá)，其它的配體受體通路發(fā)揮的作用有待進(jìn)一步研究[18]。

總之，通過(guò)我們的研究可以得出以下結(jié)論： ox-LDL可以通過(guò)激活Notch信號(hào)通路使血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，DAPT對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，DAPT通過(guò)調(diào)控Notch信號(hào)通路拮抗ox-LDL對(duì)HUVECs造成的損傷。

(致謝：感謝廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室；感謝廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)；感謝廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院器官移植研究所李成林博士；感謝廈門(mén)大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院黃楨翔老師。)

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

DAPT attenuates ox-LDL-induced human umbilical vein endothelial cell injury

REN Kai-xin, FAN Zi-xu, YOU Ru-chun, HAN Wei-min, ZHANG Ran, HUANG Rui, YAN Guo-liang, ZHANG Ye

(MedicalCollegeofXiamenUniversity,Xiamen361102,China.E-mail:zhangye@xmu.edu.cn； 79720905@qq.com)

AIM: To investigate the effect ofN-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) on the Notch signaling pathway in a model of oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL)-induced human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) damage. METHODS: HUVECs were divided into control group, ox-LDL group, DAPT group and ox-LDL+DAPT group. The morphological changes of the HUVECs with different treatments were observed under light microscope. The viability of the HUVECs was measured by CCK-8 assay. The protein expression levels of Notch1, Notch4 and Jagged1 were determined by Western blot. RESULTS: ox-LDL induced great damage to the HUVECs, evidenced by increased cell death and debris in the culture. However, the cell damage was abolished by adding DAPT into the culture. The viability of the HUVECs was increased by co-treatment with DAPT and ox-LDL. ox-LDL treatment significantly decreased the protein expression levels of Notch1 and Jagged1, and elevated Notch4. However, these changes were totally reversed by DAPT. None of these proteins showed significant change in the HUVECs co-treated with DAPT and ox-LDL as compared with control group.CONCLUSION: ox-LDL is able to induce HUVEC damageinvitro. DAPT attenuates ox-LDL-induced damage in the HUVECs by regulating the Notch signaling pathway.

HUVECs; Oxidized low-density lipoprotein; DAPT; Notch signaling pathway

1000- 4718(2017)06- 1125- 05

2016- 10- 17

2017- 03- 30

廈門(mén)大學(xué)校長(zhǎng)基金本科生項(xiàng)目(No.CXB2014010)

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.027

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△通訊作者 張 業(yè) Tel: 0592-2188670； E-mail: zhangye@xmu.edu.cn； 閆國(guó)良 Tel: 0592-2187157； E-mail: 79720905@qq.com