全反式維甲酸抑制大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化信號(hào)通路中Fosl1直接調(diào)控PPARγ2*

李 清， 鄒麗影， 曾嘉穎， 陳 潔， 李廷玉， 劉友學(xué)

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)研究室， 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際科技合作基地， 重慶400014)

全反式維甲酸抑制大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化信號(hào)通路中Fosl1直接調(diào)控PPARγ2*

李 清， 鄒麗影， 曾嘉穎， 陳 潔， 李廷玉， 劉友學(xué)△

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)研究室， 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際科技合作基地， 重慶400014)

目的： 研究激活蛋白1(AP-1)在全反式維甲酸(ATRA)抑制大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成脂分化信號(hào)通路中的調(diào)控機(jī)制。方法: 采用SD大鼠原代BMSCs，體外分離、培養(yǎng)和成脂誘導(dǎo)。油紅O染色鑒定細(xì)胞脂滴形成情況。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)脂肪細(xì)胞形成相關(guān)蛋白脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CD36)、脂滴包被蛋白(perilipin)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ2(PPARγ2)以及AP-1家族各成員(Fosl1、 Fosl2、 c-Fos、 c-Jun、 JunB、 JunD和FosB)的mRNA表達(dá)水平。Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)檢測(cè)相關(guān)蛋白(RARγ和Fosl1)與PPARγ2基因是否存在相互作用。結(jié)果: 油紅O染色顯示 ATRA處理組中細(xì)胞脂滴數(shù)量明顯減少。 BMSCs成脂誘導(dǎo)12 d后，與對(duì)照組相比，1 μmol/L ATRA處理組FABP、LPL、CD36、perilipin和PPARγ2的mRNA表達(dá)均顯著降低。RT-qPCR檢測(cè)AP-1家族各轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)結(jié)果顯示Fosl1在ATRA處理組成脂誘導(dǎo)第2天、第6天和第10天表達(dá)均顯著升高。Westren blot結(jié)果表明ATRA處理組Fosl1蛋白表達(dá)水平顯著升高，而PPARγ2蛋白表達(dá)降低。ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Fosl1蛋白可結(jié)合在PPARγ2基因啟動(dòng)子區(qū)域，而RARγ蛋白未直接結(jié)合在PPARγ2基因啟動(dòng)子區(qū)域。結(jié)論: ATRA可抑制BMSCs成脂分化及脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)，可能與其通過(guò)上調(diào)Fosl1直接結(jié)合PPARγ2基因啟動(dòng)子區(qū)域、下調(diào)PPARγ2表達(dá)有關(guān)。

全反式維甲酸； 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 成脂分化； 激活蛋白1； 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ2

肥胖的流行趨勢(shì)以驚人的速度增長(zhǎng)，導(dǎo)致的一系列嚴(yán)重的健康問(wèn)題已引起全世界的熱切關(guān)注。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2014年已超過(guò)19億人處于超重亞健康狀態(tài)，其中600萬(wàn)人是肥胖患者(http://www.who.int/topics/obesity/en/)。脂肪細(xì)胞的數(shù)量增多及體積增大是肥胖最重要的病理生理機(jī)制，作為脂肪組織最重要的組成成分，不僅具有儲(chǔ)存能量的功能，同時(shí)也是強(qiáng)大的內(nèi)分泌器官，分泌的多種細(xì)胞因子如脂聯(lián)素、瘦素、抵抗素等對(duì)組織能量代謝，胰島素敏感性及心血管功能都有深遠(yuǎn)的影響[1]。因此，了解脂肪細(xì)胞形成的分子調(diào)控機(jī)制，對(duì)于臨床預(yù)防肥胖及治療其相關(guān)的慢性疾病具有重要的指導(dǎo)意義。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)廣泛存在于人體各組織中，具備強(qiáng)大的多向分化潛能，可以向脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等分化[2-3]。大量學(xué)者研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化是由復(fù)雜而精細(xì)的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。其中最關(guān)鍵的分子相互作用發(fā)生在CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein，C/EBP)和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)家族的成員中[4-5]。大量研究表明，視黃酸(retinoic acid，RA)對(duì)飲食導(dǎo)致的肥胖起保護(hù)作用。本課題組曾發(fā)現(xiàn)，全反式維甲酸(all-transretinoic acid，ATRA)通過(guò)介導(dǎo)其受體RARγ可降低PPARγ2的表達(dá)，抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化，且RARγ蛋白直接與PPARγ2蛋白相互作用[6]而影響該轉(zhuǎn)錄因子的功能，進(jìn)而阻礙成脂信號(hào)通路的進(jìn)程。

激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)是調(diào)控細(xì)胞增殖分化的重要轉(zhuǎn)錄因子家族，由Fos蛋白(Fosl1、Fosl2和c-Fos)和Jun蛋白(c-Jun、JunB、JunD和FosB)組成[7]。近年來(lái)，一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)AP-1在調(diào)控脂肪細(xì)胞形成和成骨細(xì)胞功能中也扮演重要的角色。Hasenfuss等[8]發(fā)現(xiàn)，AP-1各家族成員通過(guò)形成同源及異源二聚體而調(diào)控PPARγ2，進(jìn)而影響肝細(xì)胞中脂質(zhì)代謝。過(guò)表達(dá)FosB的轉(zhuǎn)基因小鼠，其脂肪細(xì)胞形成和脂肪水平顯著降低[9]。而Wang等[10]用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecipitation，ChIP)發(fā)現(xiàn)，ATRA通過(guò)激活RARγ下調(diào)c-Fos在PPARγ2啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合能力，從而抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞系的成脂分化。但目前關(guān)于AP-1在ATRA抑制原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成脂分化通路中的作用，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道?；诒菊n題組的前期發(fā)現(xiàn)，本研究將繼續(xù)采用原代BMSCs，進(jìn)行體外成脂定向分化，進(jìn)一步研究ATRA抑制BMSCs成脂分化的分子機(jī)制，初探AP-1在ATRA抑制脂肪細(xì)胞分化信號(hào)通路中的調(diào)控機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

SD大鼠購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SYXK(渝) 2012-0015]，飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2 主要試劑

DMEM/F12、胎牛血清和胰酶均購(gòu)自Gibco；成脂誘導(dǎo)液和油紅O染料均購(gòu)自賽業(yè)公司；ChIP級(jí)別抗Fosl1抗體和抗RARγ抗體購(gòu)自Santa Cruz；總mRNA提取試劑盒、RIPA裂解液和BCA法蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自百泰克公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自TaKaRa；全反式維甲酸購(gòu)自Sigma；染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒為Millipore產(chǎn)品。所有引物由中國(guó)生工生物工程有限公司合成，見(jiàn)表1。

3 主要方法

3.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng) 采用2周齡SD大鼠，超凈工作臺(tái)中相對(duì)無(wú)菌條件下操作，分離出股骨和脛骨，用10 mL注射器吸取培養(yǎng)基沖洗出骨髓，吹打均勻并接種于培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基的組成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基加10%胎牛血清，置于5% CO2、37 ℃的細(xì)胞孵箱培養(yǎng)。采用全骨髓差速貼壁法獲得單細(xì)胞BMSCs，前24 h，48 h，72 h全量換液，棄去未貼壁細(xì)胞，此后每3 d全量換液1次，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)95%時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞2 min， 1 000 r/min離心5 min，棄去上清，按1×104/cm2密度接種于培養(yǎng)皿，40 min后更換培養(yǎng)基，棄掉未貼壁細(xì)胞。

3.2 原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化 取第3代BMSCs，按1×104/cm2密度接種于6 cm直徑培養(yǎng)皿。成脂誘導(dǎo)液分為誘導(dǎo)A液(成分包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10%胎牛血清、鏈霉素、谷氨酰胺、胰島素、地塞米松和異丁基-甲基黃嘌呤)和維持B液(成分包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10%胎牛血清、鏈霉素、谷氨酰胺和胰島素)。待細(xì)胞融合度達(dá)95%以上開(kāi)始進(jìn)行成脂誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)組分成脂分化培養(yǎng)基(adipogenic differen-tiation medium，ADM)對(duì)照組和1 μmol/L ATRA處理成脂分化培養(yǎng)基組(ADM+ATRA組)。第1天將普通培養(yǎng)基更換為成脂誘導(dǎo)液A液，第4天將A液更換成B液，24 h后重新將B液更換成A液。如此A液72 h，B液24 h，循環(huán)誘導(dǎo)直至脂滴形成。ATRA處理組在每次更換成脂誘導(dǎo)時(shí)均重新添加，余處理同對(duì)照組。

F: forward; R: reverse.

3.3 油紅O染色 取成脂誘導(dǎo)14 d細(xì)胞，PBS洗2遍，加入4%中性甲醛溶液，室溫下固定細(xì)胞30 min。用蒸餾水按3∶2比例稀釋油紅O染料，過(guò)濾器去除雜質(zhì)備用。棄去甲醛溶液后，PBS洗2遍，加入油紅O工作液，室溫下染色30 min。棄掉油紅O，PBS洗3遍，之后于倒置顯微鏡下觀察脂滴染色情況，并拍照。加入異丙醇500 μL溶解脂滴中染料，置于室溫下5 min，吸出200 μL至96孔板，酶標(biāo)儀測(cè)量油紅O吸光度。

3.4 總mRNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用高純度總mRNA提取試劑盒，按說(shuō)明書(shū)逐步提取總mRNA。測(cè)量mRNA濃度，采用PrimeScript Buffer逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲取cDNA。采用real-time PCR試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為： 95 ℃ 30 s； 95℃ 5 s， 60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)； 65 ℃ 30 s。GAPDH為目的基因作為參考進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化再進(jìn)行比較，循環(huán)閾值(Ct)為參數(shù)，基因改變倍數(shù)為2-ΔΔCt，其中ΔCt=CtTarget-CtGAPDH。所用引物由生工生物有限公司合成。

3.5 蛋白提取和Wersten blot實(shí)驗(yàn) 采用RIPA裂解液提取總蛋白。用BCA蛋白濃度測(cè)量法在酶標(biāo)儀上測(cè)定蛋白濃度。10% SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，上樣量為每孔20～25 μg。選用0.45 μm PVDF膜在低溫下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。含5%胎牛血清的PBST常溫下封閉1 h。加入PBST稀釋的目的蛋白 I 抗(Fosl1和PPARγ2)，稀釋比例均為1∶1 000，內(nèi)參照為β-actin，I 抗稀釋比例為1∶5 000，置于4 ℃冰箱搖床孵育過(guò)夜。次日，加入 II 抗(稀釋比例為1∶5 000)常溫下孵育1 h，放于蛋白成像系統(tǒng)內(nèi)，將ECL發(fā)光液均勻滴加并覆蓋在PVDF膜上，曝光并拍照， ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

3.6 染色質(zhì)免疫共沉淀 采用EZ-ChIP試劑盒。取成脂誘導(dǎo)的原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，加137.5 mL 37%甲醛至含5 mL成脂誘導(dǎo)液的培養(yǎng)皿中，室溫下固定10 min。收集細(xì)胞，分裝成300 μL每管，超聲儀中裂解DNA后行普通PCR凝膠電泳，紫外燈下顯影并拍照確認(rèn)DNA片段集中在200～1 000 bp范圍。取10 μL DNA裂解液作為Input組，其它IP管加入目的蛋白 I 抗及蛋白G瓊脂糖珠進(jìn)行交聯(lián)，放置4 ℃冰箱搖床孵育過(guò)夜。次日，取出Input管及IP管，置于65 ℃水浴解交聯(lián)，每管中加入4 μL 0.5 mol/L EDTA、8 μL 1 mol/L Tris-HCl和1 μL的蛋白酶K，并于45 ℃孵育1～2 h。每200 μL的DNA樣品管(Input管和IP管)加入1 mL的binding reagent “A”，將其中的600 μL混合液轉(zhuǎn)移到帶過(guò)濾管的收集管中，(10 000～15 000)×g離心30 s，棄掉濾過(guò)的液體，將剩余600 μL液體重復(fù)此步驟。加500 μL的binding reagent “B”收集管中，(10 000～15 000)×g離心30 s后棄去濾過(guò)液。加入50 μL的洗脫緩沖液“C”到白色濾膜的中心，(10 000～15 000)×g離心30 s，收集管中的洗脫液即純化的DNA。對(duì)純化的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，具體方法同上述。PPARγ2啟動(dòng)子引物：上游引物序列為5’-CACTGGGAAGTTGGAGAAGGAA-3’，下游引物序列為5’-TCTGGGGATTTGTGATGTTGAA-3’。

3.7 啟動(dòng)子序列查找和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè) 采用NCBI網(wǎng)站的基因數(shù)據(jù)庫(kù)，查找大鼠PPARγ2基因(Chromosome 4-NC_005103.4)原始序列。找出該基因的轉(zhuǎn)錄起始密碼子ATG，以ATG為起點(diǎn)，取范圍內(nèi)2 000個(gè)堿基序列作為啟動(dòng)子區(qū)域序列。利用Jaspar軟件和PROMO軟件預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Fosl1及RARγ在PPARγ2基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)。參考預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)并采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)啟動(dòng)子引物序列。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPad Prism 5.0軟件。圖中數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，兩組間均數(shù)的比較獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ATRA抑制BMSCs向脂肪細(xì)胞分化

BMSCs成脂誘導(dǎo)14 d后，通過(guò)倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)， 1 μmol/L ATRA處理組細(xì)胞中脂滴數(shù)量明顯少于對(duì)照組。油紅O染色對(duì)BMSCs成脂情況進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，未給與ATRA處理的對(duì)照組細(xì)胞形成的脂滴形態(tài)更加圓潤(rùn)，且數(shù)量明顯增多。用異丙醇溶解脂滴中的油紅染料，并在酶標(biāo)儀上測(cè)定兩組油紅O染料的吸光度， ATRA處理組較對(duì)照組明顯減低(P<0.01)。這表明ATRA能顯著抑制BMSCs向脂肪細(xì)胞分化，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The effect of ATRA on adipogenic differentiation of primarily cultured BMSCs (oil red O staining, ×200). Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsADM group.

圖1 油紅O染色鑒定ATRA對(duì)BMSCs成脂分化的影響

2 ATRA對(duì)成脂分化中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA及蛋白表達(dá)的影響

成脂誘導(dǎo)12 d后，收集對(duì)照組及1 μmol/L ATRA處理組細(xì)胞樣本。RT-qPCR及Western blot檢測(cè)BMSCs成脂分化中脂肪細(xì)胞形成及脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)。與對(duì)照組相比，核心轉(zhuǎn)錄因子PPARγ2的mRNA表達(dá)水平顯著降低 (P<0.01)，其蛋白表達(dá)水平也較對(duì)照組顯著下降。ATRA處理組BMSCs成脂分化中脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白FABP、LPL、CD36和perilipin表達(dá)均顯著下調(diào) (P<0.05)。這表明ATRA抑制關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ2的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)了成熟脂肪細(xì)胞形成相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，見(jiàn)圖2。

3 ATRA抑制BMSCs成脂分化過(guò)程中對(duì)AP-1 mRNA及蛋白水平的影響

為探討AP-1在成脂分化中的調(diào)控機(jī)制，收集對(duì)照組及1 μmol/L ATRA處理組成脂誘導(dǎo)第2天、第6天和第10天的細(xì)胞樣本。RT-qPCR檢測(cè)AP-1家族各轉(zhuǎn)錄因子的mRNA水平。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，F(xiàn)osl1的mRNA表達(dá)在成脂誘導(dǎo)第2天、第6天和第10天均顯著升高(P<0.01)。FosB和JunB表達(dá)在第2天上升(P<0.05)，其他時(shí)點(diǎn)無(wú)顯著差異。c-Fos、c-Jun和JunD 的mRNA表達(dá)在兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。結(jié)果表明，F(xiàn)osl1在ATRA處理后mRNA水平顯著上升。為進(jìn)一步證實(shí)，用Western blot檢測(cè)蛋白水平變化，采用ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ATRA處理后，F(xiàn)osl1蛋白表達(dá)顯著升高。RT-qPCR和Western blot結(jié)果表明Fosl1在ATRA作用后表達(dá)顯著上調(diào)，提示Fosl1可能是參與BMSCs成脂分化的一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，見(jiàn)圖3。

Figure 2.The effects of ATRA on the mRNA expression of adipocyte-associated proteins (FABP, LPL, CD36, perilipin and PPARγ2) and the protein expression of PPARγ2 in late stage of BMSC adipogenic differentiation. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01P<0.01vsADM group.

圖2 ATRA對(duì)BMSCs成脂分化晚期脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白(FABP、LPL、CD36和perilipin)及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ2表達(dá)的影響

4 ChIP-qPCR檢測(cè)RARγ和Fosl1與PPARγ2基因是否存在相互作用

為進(jìn)一步探討ATRA介導(dǎo)的RARγ對(duì)PPARγ2基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，我們采用ChIP-qPCR技術(shù)。該實(shí)驗(yàn)主要是用目的蛋白ChIP級(jí)別抗體(RARγ和Fosl1)，通過(guò)蛋白G瓊脂糖珠交聯(lián)至目的基因(PPARγ2)染色質(zhì)上，沉淀然后純化后得到DNA。首先我們用RARγ抗體去交聯(lián)PPARγ2啟動(dòng)子作為免疫沉淀組(IP組)，Input組作為定量對(duì)照，IgG組作為陰性對(duì)照。ChIP-qPCR結(jié)果顯示， IP組(ADM組和ADM+ATRA組)與陰性對(duì)照組(IgG組)無(wú)顯著差異，未擴(kuò)增出PPARγ2啟動(dòng)子區(qū)域序列，提示RARγ蛋白并未結(jié)合在PPARγ2啟動(dòng)子上直接調(diào)控其表達(dá)。

ATRA處理組中，F(xiàn)osl1在mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平均顯著上升，而AP-1作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)細(xì)胞增殖分化起關(guān)鍵作用，為進(jìn)一步證實(shí)Fosl1對(duì)成脂分化信號(hào)通路的影響，我們采用ChIP-qPCR技術(shù)檢測(cè)Fosl1是否可直接作用于PPARγ2基因并下調(diào)其表達(dá)。用Fosl1抗體去沉積PPARγ2基因序列作為免疫沉淀組(IP組)，Input組作為定量對(duì)照，IgG組作為陰性對(duì)照。RT-qPCR結(jié)果顯示，IP組(ADM組和ADM+ATRA組)提取純化的DNA中擴(kuò)增出PPARγ2基因啟動(dòng)子區(qū)域序列。且與對(duì)照組相比，ATRA處理組PPARγ2啟動(dòng)子序列表達(dá)增高(P<0.01)，提示Fosl1轉(zhuǎn)錄因子能夠直接結(jié)合在PPARγ2基因上調(diào)控其表達(dá)，見(jiàn)圖4。

討 論

維生素A是最早被發(fā)現(xiàn)的脂溶性維生素，其生理功能有維持人體正常視覺(jué)功能[11]，促進(jìn)免疫球蛋白合成[12]，維護(hù)生殖系統(tǒng)上皮細(xì)胞穩(wěn)定性[13]。近年來(lái)，維生素A及其活性代謝產(chǎn)物RA新的生物學(xué)功能不斷被發(fā)現(xiàn)，包括調(diào)節(jié)能量代謝、胰島素敏感性及脂質(zhì)代謝[14-15]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，低血清視黃醇濃度是肥胖的危險(xiǎn)因素[16]。肥胖大鼠模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，給與維生素A補(bǔ)充飲食可明顯降低其體重，同時(shí)校正胰島素抵抗[17]。此外，維生素A誘導(dǎo)的體重減輕影響脂質(zhì)代謝。長(zhǎng)期喂養(yǎng)富含維生素A飼料的高膽固醇肥胖大鼠，可以糾正其血漿高密度脂蛋白水平和降低的血漿膽固醇水平[18]。ATRA作為維生素A最重要的活性代謝產(chǎn)物，已被證實(shí)為脂肪細(xì)胞分化的抑制劑。

Figure 3.The effects of ATRA on the mRNA and protein expression of AP-1 family members (Fosl1, FosB, Fosl2, JunB, JunD, c-Fos and c-Jun) in BMSC adipogenic differentiation. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsADM group.

圖3 ATRA對(duì)BMSCs 成脂分化中AP-1家族成員(Fosl1、FosB、Fosl2、JunB、JunD、c-Fos和c-Jun)表達(dá)的影響

將攜帶綠色熒光蛋白的BMSCs注射到肥胖大鼠體內(nèi)，在脂肪組織內(nèi)攜帶熒光標(biāo)記的細(xì)胞被鑒定為脂肪細(xì)胞[19]。本研究及其他研究表明BMSCs在體外誘導(dǎo)能成功向脂肪細(xì)胞分化。為了更好地保持BMSC成脂分化的微環(huán)境，實(shí)驗(yàn)中我們均采用原代BMSC。本課題組前期發(fā)現(xiàn)ATRA可顯著抑制BMSC向脂肪細(xì)胞分化，該過(guò)程中RARγ表達(dá)上調(diào)，而PPARγ2表達(dá)下降，Co-IP實(shí)驗(yàn)證明RARγ蛋白與PPARγ2蛋白相互作用[5]。這只能表明在細(xì)胞生理狀態(tài)下，RARγ蛋白通過(guò)與PPARγ2蛋白結(jié)合擾亂了其生物功能，導(dǎo)致該轉(zhuǎn)錄因子成脂分化后續(xù)靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯受到影響，進(jìn)而阻礙了成脂分化程序的正常進(jìn)行，但并不能解釋PPARγ2表達(dá)下調(diào)的原因。在本實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)成脂分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ2下調(diào)原因進(jìn)行了進(jìn)一步探究。

ATRA通過(guò)其核受體RARs與RXRs通過(guò)形成異二聚體結(jié)合在靶基因的特定結(jié)合原件(RARE)上對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控[20]。在ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，我們通過(guò)Jaspar及PROMO軟件進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)。為進(jìn)一步證實(shí)，我們采用RARγ抗體去沉積PPARγ2基因序列，設(shè)計(jì)PPARγ2啟動(dòng)子區(qū)域引物未擴(kuò)增出目的基因。結(jié)果提示，RARγ并沒(méi)有通過(guò)結(jié)合在PPARγ2啟動(dòng)子上直接調(diào)控其表達(dá)。Wang等[10]在ATRA抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂分化的研究中，也未發(fā)現(xiàn)RARγ受體與PPARγ2基因之間的直接相互作用。有研究表明，ATRA通過(guò)激活其核受體可以直接調(diào)控靶基因，且存在間接調(diào)控的機(jī)制，如間接通過(guò)AP-1來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的調(diào)控[21]。AP-1是細(xì)胞核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子,具有RNA聚合酶活性，

Figure 4.ChIP-qPCR for detecting the interactions between relevant proteins (RARγ and Fosl1) andPPARγ2 gene in ATRA-induced inhibition of BMSC adipogennic differentiation. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsIgG1 group；△△P<0.01vsIgG2 group；##P<0.01vsADM group.

圖4 ATRA抑制BMSCs 成脂分化中相關(guān)蛋白(RARγ和Fosl1)與PPARγ2基因相互作用的檢測(cè)

可調(diào)節(jié)下游含有AP-1 DNA 結(jié)合位點(diǎn)的靶基因表達(dá)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和增殖的中樞。近年來(lái)研究報(bào)道，AP-1在調(diào)控脂肪形成和成骨細(xì)胞功能中起重要作用[8,10]。有研究表明，視黃酸核受體對(duì)靶基因的作用為下調(diào)時(shí)，可通過(guò)介導(dǎo)AP-1來(lái)作用[22]。但AP-1在原代BMSCs成脂分化中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用RT-qPCR檢測(cè)了AP-1家族各轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)的變化，結(jié)果表明ATRA處理組中Fosl1 mRNA和蛋白水平表達(dá)顯著升高，提示Fosl1可能是RA抑制成脂分化信號(hào)通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子。Wertern blot進(jìn)一步證實(shí)ATRA處理組Fosl1蛋白水平也顯著上調(diào)。國(guó)外學(xué)者Hasenfuss等[8]發(fā)現(xiàn)，AP-1參與脂肪性肝病中脂質(zhì)代謝機(jī)制，其中轉(zhuǎn)錄因子Fosl1是最為關(guān)鍵的調(diào)節(jié)蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Fosl1基因小鼠可出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂[23]。為探究Fosl1是否可作用于關(guān)鍵基因PPARγ2，并參與ATRA抑制BMSC成脂分化信號(hào)通路中，本實(shí)驗(yàn)采用ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)，利用Fosl1抗體沉積PPARγ2基因序列，用PPARγ2啟動(dòng)子引物可以擴(kuò)增出目的啟動(dòng)子區(qū)域序列，表明Fosl1可以結(jié)合在PPARγ2基因啟動(dòng)子上直接調(diào)控其表達(dá)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)在ATRA抑制原代BMSC向脂肪細(xì)胞分化中脂質(zhì)代謝主要基因均顯著下調(diào)。ChIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RARγ并沒(méi)有直接結(jié)合在PPARγ2的啟動(dòng)子區(qū)域，而ATRA顯著上調(diào)Fosl1/AP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)，且Fosl1直接結(jié)合在PPARγ2的啟動(dòng)子區(qū)域， 提示ATRA可能通過(guò)上調(diào)Fosl1來(lái)調(diào)控成脂分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ2的表達(dá)，從而發(fā)揮成脂抑制作用。本研究尚存在一些不足，如過(guò)表達(dá)及沉默F(xiàn)osl1驗(yàn)證其功能等，需要更長(zhǎng)遠(yuǎn)和深入的研究。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Fosl1 regulates PPARγ2 in ATRA-induced inhibition of adipogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells

LI Qing, ZOU Li-ying, ZENG Jia-ying, CHEN Jie, LI Ting-yu, LIU You-xue

(Children’sNutritionResearchCenter,ChildrenHospitalofChongqingMedicalUniversity,KeyLaboratoryofChildDeve-lopmentandDisorders,MinistryofEducation,ChinaInternationalScienceandTechnologyCooperationBaseforChildDeve-lopmentandCriticalDisorders,Chongqing400014,China.E-mail:lyxliu@126.com)

AIM: To investigate the molecular mechanism of activator protein-1 (AP-1) regulating all-transretinoic acid (ATRA)-induced inhibition of adipogenic differentiation of rat primary bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). METHODS: Primary cultured BMSCs were used for induction of adipogenesisinvitro. The mRNA expression of fatty acid-binding protein (FABP), lipoprotein lipase (LPL), CD36, perilipin, peroxisome proliferator-activated receptor gamma-2 (PPARγ2) and AP-1 family members (Fosl1, Fosl2, c-Fos, c-Jun, JunB, JunD and FosB) was detected by RT-qPCR. The protein expression was determined by Western blot. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay was performed to detect interactions between relevant proteins (RARγ and Fosl1) andPPARγ2 gene. RESULTS: Oil red O staining showed decreases in fat droplet formation and absorbance of the dye-triglyceride complex in ATRA treatment group. After 12 d adipogenic differentiation, compared with control group, the mRNA expression of FABP, LPL, CD36, perilipin and PPARγ2 was reduced by ATRA. In ATRA treatment group, the mRNA expression of Fosl1 was significantly increased on day 2, 6 and 10. The protein expression of Fosl1 also significantly increased in ATRA treatment group. ChIP-qPCR showed that the Fosl1 protein directly bound to thePPARγ2 promoter， while RARγ did not bind to thePPARγ2 promoter. CONCLUSION: ATRA inhibits BMSC adipogenic differentiation and reduces the expression of fat cell forming-related proteins. The mechanism may be associated with up-regulation of Fosl1 which directly bind toPPARγ2 promoter.

All-transretinoic acid; Bone marrow mesenchymal stem cells; Adipogenic differentiation; Activator protein-1; Peroxisome proliferator-activated receptor γ2

1000- 4718(2017)06- 1104- 08

2017- 02- 20

2017- 05- 09

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 30571565)

R58； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.024

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