VDUP1對乳腺癌細胞MCF-7增殖及遷移的影響

李建華， 徐利強， 倪修文， 孫亞云， 毛惠娜， 吳瑾惠

(嘉興市中心血站， 浙江 嘉興 314000 )

VDUP1對乳腺癌細胞MCF-7增殖及遷移的影響

李建華， 徐利強， 倪修文△， 孫亞云， 毛惠娜， 吳瑾惠

(嘉興市中心血站， 浙江 嘉興 314000 )

目的： 探討過表達/沉默維生素D3上調(diào)蛋白1(vitamin D3 up-regulated protein 1，VDUP1)基因?qū)θ巳橄侔┘毎礛CF-7增殖和遷移能力的影響及相關(guān)作用機制。 方法: 通過基因過表達/干擾技術(shù)上調(diào)/下調(diào)乳腺癌細胞系MCF-7中VDUP1基因的表達；實時熒光定量PCR檢測細胞中VDUP1的mRNA表達水平；CCK-8法、BrdU實驗和Transwell細胞遷移實驗分別用于檢測細胞增殖和遷移能力；Western blot檢測細胞中Akt、p-Akt、GSK3β和p-GSK3β的蛋白水平。 結(jié)果: 基因過表達/干擾技術(shù)可上調(diào)/下調(diào)乳腺癌細胞系MCF-7中VDUP1基因的表達；過表達VDUP1基因后，MCF-7的細胞活力、DNA合成和細胞遷移能力顯著降低(P<0.05)，而沉默VDUP1基因后，MCF-7的細胞活力、DNA合成和細胞遷移能力則顯著升高(P<0.05)。此外，過表達VDUP1基因可下調(diào)p-Akt和p-GSK3β的蛋白水平(P<0.05)，而沉默VDUP1基因的結(jié)果則相反。 結(jié)論: 改變VDUP1基因表達水平可影響MCF-7細胞的增殖和遷移能力，其作用機制可能與Akt/GSK3β信號通路有關(guān)。

維生素D3上調(diào)蛋白1； MCF-7細胞； 細胞增殖； 細胞遷移； Akt/GSK3β信號通路

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個多基因參與，多階段的復雜演化過程，其中涉及到多種原癌基因及抑癌基因等的異常表達[1-3]；深入探討其中涉及的基因功能，不僅有助于深化對乳腺癌發(fā)病機制的認識，且有助于篩選乳腺癌診療的新靶點。

維生素D3上調(diào)蛋白1(vitamin D3 upregulated protein 1，VDUP1)基因，即硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)結(jié)合基因，位于人染色體1q21上[4]。已有大量文獻報道VDUP1作為一種抑癌基因，在包括肝癌[4]、乳腺癌[5]等多種腫瘤中表達異常。研究表明，VDUP1是維持細胞內(nèi)部微環(huán)境穩(wěn)定的一種多功能蛋白，作為TRX的內(nèi)源性抑制劑，VDUP1可通過抑制TRX的活性廣泛參與調(diào)控細胞的增殖、凋亡及分化等病理生理過程[6-8]。然而有關(guān)VDUP1對乳腺癌細胞的具體作用研究甚少。本實驗采用基因過表達/干擾技術(shù)上調(diào)/下調(diào)乳腺癌細胞系MCF-7中VDUP1基因的表達，而后通過CCK-8法、BrdU實驗和Transwell細胞遷移實驗檢測MCF-7細胞的增殖及遷移能力的變化，初步探討VDUP1基因?qū)CF-7細胞相關(guān)生物學功能的影響，此外采用Western blot檢測相關(guān)蛋白表達的變化，進一步討論VDUP1基因調(diào)控MCF-7細胞的相關(guān)機制。

材 料 和 方 法

1 材料

人乳腺癌細胞系MCF-7(中科院細胞庫)；VDUP1過表達質(zhì)粒及對照質(zhì)粒(Gene Copoeia)；VDUP1 siRNA及陰性對照siRNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；胰蛋白酶和CCK-8試劑(Sigma)；BrdU細胞增殖分析試劑盒(Chemicon)；DMEM培養(yǎng)基及Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco)；Transwell小室(Corning)；Lipofectamine 2000及相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)；抗Akt、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)、p-Akt、p-GSK3β抗體和HRP標記的抗兔 II 抗(Santa Cruz)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 人乳腺癌細胞系MCF-7常規(guī)貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱；待細胞生長至培養(yǎng)瓶的約80%時，胰蛋白酶常規(guī)進行消化，傳代。

2.2 細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中(密度為2×108/L)，待細胞生長融合至60%～80%，換無血清的培養(yǎng)基同步化12 h，隨后進行轉(zhuǎn)染。組別設置為空白對照(control)組、陰性對照(negative control siRNA，Neg)組、VDUP1 siRNA干擾組(siRNA組)、空質(zhì)粒(vector，Vec)組和VDUP1過表達組(VDUP1組)。將質(zhì)粒溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基中孵育5 min，同時另取Lipofectamine 2000溶入Opti-MEM培養(yǎng)基中孵育5 min；而后將兩者輕柔混合，室溫靜置20 min。然后將混合物加入各組細胞中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，更換為正常細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。提取細胞蛋白測定轉(zhuǎn)染效率并進行后續(xù)實驗分析。

2.3 CCK-8法和BrdU法檢測各組細胞的增殖水平 接種細胞于96孔板中(每孔2×103個)，處理后加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)22 h，隨后向每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。于450 nm波長處檢測各孔吸光度(A)值，每組設3個復孔。另設單孔只加入培養(yǎng)基不加入MCF-7細胞作為空白對照，計算各組細胞的細胞活力。另接種細胞至96孔板中(每孔1×103個)，處理后加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，隨后加入BrdU，共培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后倒出培養(yǎng)液，加入100 μL固定液，室溫孵育30 min，洗板3次。5% FBS封閉30 min。加入甲酰胺100 ℃下變性5 min，冷卻洗滌后加入抗小鼠BrdU單抗，陰性對照組加PBS。蘇木素襯染，顯微鏡下計數(shù)，重復實驗6次。

2.4 實時熒光定量PCR(qPCR)檢測轉(zhuǎn)染細胞中VDUP1的mRNA表達 收集各組細胞，總RNA的提取按照Trizol說明書進行，所提RNA經(jīng)紫外分光光度法測定A260值，并進行定量。建立反轉(zhuǎn)錄反應。VDUP1的上游引物為5’-ACTCGTGTCAAAGCCGTTAGGA-3’，下游引物為5’-AGCTCAAAGCCGAACTTGTACTCA-3’； GAPDH為內(nèi)參照，其上游引物為5’-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3’，下游引物為5’-GCGCCCAATACGACCAAATC-3’。PCR擴增條件為：90 ℃ 10 s； 92 ℃ 15 s， 60 ℃ 15 s， 74 ℃ 15 s， 40個循環(huán)。反應結(jié)束后，標準曲線和擴增曲線由PCR儀器自動生成，所得結(jié)果直接在熒光定量操作系統(tǒng)中進行比較分析，目標基因的相對定量用2-ΔΔCt法計算。

2.5 Transwell細胞遷移實驗 胰酶消化收集各組細胞后，用培養(yǎng)基重懸細胞后將細胞接種于Transwell小室的上室中(密度2×108/L)，同時在Transwell小室的下室內(nèi)加入常規(guī)培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出后，棄去上室培養(yǎng)液，用5%戊二醛4 ℃固定15 min；PBS沖洗3次，并用棉簽擦除上室表面的細胞，然后加0.1%結(jié)晶紫染色，PBS漂洗后置于倒置顯微鏡下觀察并拍照，計數(shù)染色細胞的個數(shù)(每組細胞計數(shù)5個視野取均值)。

2.6 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達 離心收集各組經(jīng)相應處理的細胞，提取總蛋白并用BCA試劑盒測定蛋白濃度進行定量，每道加入80 μg蛋白進行SDS-PAGE，待藍色loading buffer泳出后，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5% 脫脂牛奶的PBS緩沖液封閉90 min，加入相應比例的 I 抗，4 ℃孵育過夜；復溫后再加入相應 II 抗，室溫孵育2 h，化學發(fā)光法顯影，定影并沖洗膠片。所得結(jié)果經(jīng)ImageJ軟件行蛋白半定量灰度分析。

3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組均數(shù)間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 qPCR檢測VDUP1的mRNA表達水平

各組細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后，采用qPCR檢測VDUP1的mRNA表達水平。結(jié)果顯示，與control組相比，VDUP1組中VDUP1的表達明顯升高，而siRNA組中VDUP1的 mRNA表達顯著降低，提示細胞轉(zhuǎn)染成功，見圖1。

2 過表達/沉默VDUP1基因后MCF-7細胞增殖能力的變化

過表達/沉默VDUP1基因后，采用CCK-8法檢測細胞活力變化。結(jié)果表明，與control 組相比，過表達VDUP1基因后，MCF-7細胞的活力顯著降低；而沉默VDUP1基因后，MCF-7細胞的活力顯著升高。BrdU實驗結(jié)果表明，過表達VDUP1基因后，MCF-7細胞的DNA合成顯著低于對照組；而沉默VDUP1基因后，MCF-7細胞的DNA合成顯著高于對照組，見圖2。

Figure 1.The mRNA expression levels of VDUP1 in the MCF-7 cells after transfected with plamid/siRNA. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖1 MAF-7細胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒/siRNA后VDUP1的 mRNA表達水平

Figure 2.The effects ofVDUP1 over-expression/knockdown on the proliferation of the MCF-7 cells. A: the cell viability was detected by CCK-8 assay; B: the cell proliferation was determined by BrdU assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2 過表達/沉默VDUP1基因?qū)CF-7細胞增殖的影響

3 過表達/沉默VDUP1基因后MCF-7細胞的遷移能力變化

過表達/沉默VDUP1基因后，Transwell遷移實驗檢測MCF-7細胞遷移能力的變化。過表達VDUP1基因可顯著降低MCF-7細胞的遷移能力，而沉默VDUP1基因則顯著增加其遷移能力，見圖3。

4 過表達/沉默VDUP1基因后MCF-7細胞中Akt/GSK3β信號通路活性的變化

過表達/沉默VDUP1基因后，Western blot法檢測細胞中Akt/GSK3β信號通路活性的變化。結(jié)果顯示：與control組相比，過表達VDUP1基因后，MCF-7細胞中p-Akt和p-GSK3β的蛋白水平顯著降低；而沉默VDUP1基因后，p-Akt和p-GSK3β的蛋白表達水平則顯著增加，見圖4。

Figure 3.The effects ofVDUP1 over-expression/knockdown on the migration ability of the MCF-7 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖3 過表達/沉默VDUP1基因?qū)CF-7細胞遷移能力的影響

Figure 4.The effects ofVDUP1 over-expression/knockdown on the protein levels of p-Akt and p-GSK3β in the MCF-7 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖4 過表達/沉默VDUP1基因?qū)CF-7細胞中p-Akt和p-GSK3β蛋白水平的影響

討 論

關(guān)于VDUP1基因在腫瘤中的作用，早期的研究顯示其是一種抑癌基因；隨著研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)VDUP1是TRX的內(nèi)源性抑制劑，不僅廣泛參與調(diào)控細胞的增殖、凋亡及分化等病理生理過程，還具有免疫調(diào)節(jié)作用，并參與炎癥反應及體內(nèi)抗氧化應激反應[9-11]。本研究在分子水平上，通過構(gòu)建過表達/沉默VDUP1基因的人乳腺癌MCF-7細胞探討VDUP1基因?qū)CF-7細胞增殖及遷移的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當過表達VDUP1基因時，MCF-7細胞的增殖與遷移能力顯著降低，而當沉默VDUP1基因后，MCF-7細胞的增殖與遷移能力則顯著增加，提示VDUP1基因可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。

關(guān)于VDUP1調(diào)控細胞病理生理過程的作用機制，大量研究表明，VDUP1是一種細胞內(nèi)信號分子，其作用主要是通過TRX來發(fā)揮的；VDUP1可與TRX活性區(qū)的2個半胱氨酸殘基相結(jié)合，抑制TRX的活性[12-13]。TRX是一種強力抗氧化劑，可通過抑制細胞凋亡信號ASK1-JNK/p38 MAPK信號通路調(diào)控細胞凋亡[14]；且抑制TRX-1還可促進Akt/GSK3β的活化，進而發(fā)揮心肌保護效應[15]。此外也有研究提示，VDUP1可通過抑制Akt的磷酸化調(diào)控人晶狀體上皮細胞的自噬[16]。Akt/GSK3β通路廣泛存在于細胞中，通過其磷酸化調(diào)控下游細胞增殖、凋亡及代謝等相關(guān)蛋白的表達，進而促進腫瘤細胞的增殖、加快細胞周期進程、調(diào)控腫瘤細胞耐藥性的發(fā)生[17-19]。本實驗結(jié)果顯示過表達VDUP1后，MCF-7細胞中p-Akt和p-GSK3β的蛋白表達顯著降低，而沉默VDUP1則p-Akt和p-GSK3β的蛋白表達顯著增加，提示VDUP1基因調(diào)控MCF-7細胞增殖及遷移可能與Akt/GSK3β信號通路有關(guān)，但是VDUP1與Akt/GSK3β信號通路之間的具體關(guān)系還有待進一步深入的研究。

綜上所述，本研究在分子水平上，通過構(gòu)建過表達/沉默VDUP1基因的人乳腺癌MCF-7細胞探討VDUP1的功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達VDUP1基因可抑制MCF-7細胞的增殖和遷移能力，沉默VDUP1基因則促進MCF-7細胞的增殖和遷移能力，其作用機制可能與Akt/GSK3β信號通路有關(guān)。這提示，VDUP1基因可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，有望成為乳腺癌診療的新靶點。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effects of VDUP1 on proliferation and migration of human breast cancer MCF-7 cells

LI Jian-hua, XU Li-qiang, NI Xiu-wen, SUN Ya-yun， MAO Hui-na, WU Jin-hui

(JiaxingBloodCenter,Jiaxing314000,China.E-mail:nixiuwen322904@163.com)

AIM: To investigate the effect of vitamin D3 up-regulated protein 1 (VDUP1) gene over-expression/knockdown on the proliferation and migration of human breast cancer MCF-7 cells and its related mechanisms.METHODS: Gene over-expression/interference techniques were used to up-regulate/down-regulate the expression of VDUP1 in the MCF-7 cells. The mRNA expression of VDUP1 was detected by qPCR. CCK-8, BrdU and Transwell assays were used to measure the cell viability, proliferation and migration, respectively. The protein levels of Akt, p-Akt, GSK3β and p-GSK3β were determined by Western blot.RESULTS: The mRNA expression of VDUP1 was up-regulated after transfection withVDUP1 over-expression plasmid (P<0.05), and down-regulated after transfection withVDUP1 siRNA (P<0.05). Over-expression ofVDUP1 significantly inhibited MCF-7 cell proliferation and migration (P<0.05), while knockdown ofVDUP1 enhanced cell proliferation and migration (P<0.05). Furthermore, over-expression ofVDUP1 up-regulated the protein levels of p-Akt and p-GSK3β (P<0.05). Inverse results were obtained after knockdown ofVDUP1. CONCLUSION: The viability and migration ability of MCF-7 cells are inhibited by over-expression ofVDUP1 but enhanced byVDUP1 knockdown, which may be related with Akt/GSK3β pathway.

Vitamin D3 up-regulated protein 1; MCF-7 cells; Cell proliferation; Cell migration; Akt/GSK3β pathway

1000- 4718(2017)06- 1060- 05

2017- 04- 01

2017- 04- 24

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.017

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