miR-125b通過下調(diào)HAX-1的表達(dá)提高CD133+ SW480細(xì)胞對順鉑的敏感性

潘海強(qiáng)， 沈 鋒， 崔焌輝， 蔡 珂， 都志軍

(浙江省立同德醫(yī)院肛腸科，浙江 杭州 310012)

miR-125b通過下調(diào)HAX-1的表達(dá)提高CD133+SW480細(xì)胞對順鉑的敏感性

潘海強(qiáng)△， 沈 鋒， 崔焌輝， 蔡 珂， 都志軍

(浙江省立同德醫(yī)院肛腸科，浙江 杭州 310012)

目的： 探討miR-125b在CD133+結(jié)直腸癌細(xì)胞中發(fā)揮的作用并研究其是否和順鉑的體外治療有關(guān)。方法: 用RT-qPCR方法檢測miR-125b在常規(guī)SW480腫瘤細(xì)胞及CD133+SW480腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平。流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-125b和順鉑對SW480細(xì)胞系中CD133+細(xì)胞比例的影響。MTT法檢測miR-125b對順鉑殺傷CD133+SW480細(xì)胞能力的影響。利用生物信息學(xué)及Western blot方法驗(yàn)證miR-125b是否調(diào)節(jié)CD133+SW480細(xì)胞中HAX-1的表達(dá)。運(yùn)用JC-1染色、Annexin V染色及Western blot方法研究miR-125b影響順鉑療效的信號通路的效應(yīng)。結(jié)果: CD133+SW480細(xì)胞中的miR-125b表達(dá)水平顯著低于正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞系FHC和常規(guī)SW480腫瘤細(xì)胞。順鉑體外單獨(dú)治療能提高SW480細(xì)胞系中CD133+細(xì)胞的比例，然而聯(lián)用miR-125b模擬物后CD133+SW480細(xì)胞的比例顯著下降。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-125b可顯著增強(qiáng)順鉑對CD133+SW480細(xì)胞的殺傷活性。Western blot實(shí)驗(yàn)表明miR-125b的靶基因可能為HAX-1。miR-125b聯(lián)合順鉑可引起CD133+SW480細(xì)胞線粒體膜電位的喪失并誘導(dǎo)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)染HAX-1表達(dá)載體后miR-125b聯(lián)合順鉑對CD133+SW480細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)顯著降低。結(jié)論: miR-125b通過下調(diào)HAX-1的表達(dá)提高CD133+結(jié)直腸癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。

miR-125b; HAX-1; 細(xì)胞色素C; 順鉑; CD133+結(jié)直腸癌細(xì)胞

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織細(xì)胞群體中一群具有高度自我更新能力的腫瘤細(xì)胞，它們具有干細(xì)胞樣的特征且它們的致瘤性要顯著高于常規(guī)腫瘤細(xì)胞，有文獻(xiàn)報道CD133+腫瘤細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，是導(dǎo)致腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的重要因素，并且腫瘤干細(xì)胞對化療有較強(qiáng)的抵抗性[1-2]。結(jié)直腸癌是一種常見的消化道腫瘤，發(fā)病率和致死率都非常高[3]，對于不適宜進(jìn)行手術(shù)治療的晚期結(jié)直腸癌患者而言，化療是一項(xiàng)重要的治療手段。順鉑是治療結(jié)直腸癌的一線藥物，然而結(jié)直腸癌干細(xì)胞對順鉑的高度抵抗性往往造成化療的失敗[4]，因此采取新的方法提高結(jié)直腸癌干細(xì)胞對順鉑的敏感性具有十分重要的意義。

微小RNAs(microRNAs，miRNAs，miR)是一種細(xì)胞內(nèi)源性的非編碼單鏈RNA，它們能與目標(biāo)mRNA的3’UTR發(fā)生特異性結(jié)合，抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄并使之降解，從而調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的表達(dá)[5]。研究表明miRNA能調(diào)節(jié)約30%的蛋白質(zhì)編碼基因，因此miRNA在細(xì)胞各種生理活動中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等功能[6]。本研究的目的在于探討miR-125b是否能調(diào)節(jié)CD133+結(jié)直腸癌細(xì)胞對順鉑治療的敏感性。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞系FHC[7]和人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480購于ATCC。CD133+SW480細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，CD133陽性的結(jié)直腸癌細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞[8]。簡要步驟如下：收集SW480細(xì)胞并用生理鹽水洗3次。在單細(xì)胞懸液中加入CD133-FITC熒光抗體在冰上孵育40 min，孵育后用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀以CD133為標(biāo)記進(jìn)行分選。常規(guī)結(jié)直腸癌細(xì)胞系培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中；分選的CD133+SW480細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并加入青霉素(1×105U/L)和鏈霉素(100 mg/L)。所有細(xì)胞均在37 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通入5% CO2。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 順鉑、噻唑藍(lán)[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]和凋亡檢測試劑盒購于Sigma；線粒體分離試劑盒購于碧云天生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購于Gibco；蛋白提取液、以及兔抗人HAX-1、細(xì)胞色素C和β-actin抗體購于CST；CD133-FITC熒光抗體購于BD；miR-125b模擬物和陰性對照寡核苷酸(miR-NC)購于上海吉瑪生物；pcDNA3.1質(zhì)粒、Trizol試劑和Lipofectamine 2000購于Invitrogen；SYBR Green試劑購于TaKaRa；ECL試劑盒購于Pierce；JC-1購于Molecular Probes。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2 方法

2.1 熒光定量PCR檢測miR-125b的表達(dá) 將培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA用Trizol試劑按操作說明書進(jìn)行提取，之后以所提取的總RNA為模板，采用莖環(huán)法用miR-125b特異性引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。miR-125b的逆轉(zhuǎn)錄引物序列為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGGGACTC-3′。對miR-125b的定量PCR擴(kuò)增使用SYBR Green試劑并按其試劑說明書進(jìn)行操作，以U6 snRNA作為內(nèi)參照。

2.2 質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 將HAX-1基因cDNA全長序列以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構(gòu)建成HAX-1重組真核表達(dá)質(zhì)粒。使用Lipofectamine 2000按照試劑操作說明書步驟將2 mg/L HAX-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入CD133+SW480細(xì)胞中。

2.3 細(xì)胞活力檢測 將常規(guī)SW480細(xì)胞或CD133+SW480細(xì)胞按照每孔5×103接種在96孔板上，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計將50 nmol/L的miR-NC或miR-125b用Lipofectamine 2000試劑轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h，然后更換新鮮培養(yǎng)基再加(0～20 μmol/L)順鉑培養(yǎng)48 h。藥物處理完畢后加入20 mL MTT(5 g/L)培養(yǎng)4 h，移除孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入100 μL二甲亞砜，570 nm波長下測定吸光度(A)。細(xì)胞活力結(jié)果用實(shí)驗(yàn)組與對照組的A值比值表示。

2.4 CD133+SW480細(xì)胞所占比例測定 將SW480細(xì)胞按每孔2×106接種在6孔板上，分為對照組、miR-125b組、順鉑組和順鉑+miR-125b組。對照組為SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC培養(yǎng)72 h；順鉑組為SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC培養(yǎng)24 h后加入10 μmol/L的順鉑培養(yǎng)48 h；miR-125b組為SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-125b培養(yǎng)72 h；順鉑+miR-125b組為SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-125b培養(yǎng)24 h后加入10 μmol/L的順鉑培養(yǎng)48 h。藥物處理完畢后將細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，加入CD133抗體在暗處孵育20 min后將細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，計算CD133+的SW480細(xì)胞所占總的SW480細(xì)胞的比例。

2.5 線粒體分離 將CD133+SW480細(xì)胞按每孔2×106接種在6孔板上，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計將50 nmol/L的miR-NC、miR-125b及2 mg/L HAX-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入CD133+SW480細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h，然后更換新鮮培養(yǎng)基再加10 μmol/L的順鉑培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，之后用線粒體分離試劑盒按照說明書操作步驟將完整的線粒體從SW480細(xì)胞質(zhì)中分離出來。

2.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 將CD133+SW480細(xì)胞按每孔2×106接種在6孔板上，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計將50 nmol/L的miR-NC、miR-125b及2 mg/L HAX-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入CD133+SW480細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h，然后更換新鮮培養(yǎng)基再加10 μmol/L的順鉑培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，將細(xì)胞用生理鹽水洗滌2遍后用蛋白提取液提取總蛋白質(zhì)。將總蛋白質(zhì)用12.5% SDS-PAGE分離。分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用HAX-1、細(xì)胞色素C或β-actin單克隆抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的 II 抗孵育2 h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。另外，線粒體中細(xì)胞色素C的釋放率用細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C表達(dá)水平與線粒體中的細(xì)胞色素C的表達(dá)水平的比值表示。

2.7 細(xì)胞凋亡試驗(yàn) 將CD133+SW480細(xì)胞按每孔2×106接種在6孔板上，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計將50 nmol/L的miR-NC、miR-125b及2 mg/L HAX-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入CD133+SW480細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h，然后更換新鮮培養(yǎng)基再加10 μmol/L的順鉑培養(yǎng)48 h。之后將細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，按照凋亡試劑盒說明書步驟將碘化丙啶(propidium iodide，PI)和Annexin V加入細(xì)胞中孵育20 min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡，Annexin V陽性細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞。

2.8 線粒體膜電位檢測 將CD133+SW480細(xì)胞按每孔2×106接種在6孔板上，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計將50 nmol/L的miR-NC、miR-125b及2 mg/L HAX-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入CD133+SW480細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h，然后更換新鮮培養(yǎng)基再加10 μmol/L的順鉑培養(yǎng)48 h。之后將細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，加入5 μmol/L JC-1孵育20 min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD133+SW480細(xì)胞線粒體膜電位的變化，細(xì)胞的紅色熒光越強(qiáng)表明線粒體膜電位越高[9]。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示并用SPSS 15.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行處理。兩組間均數(shù)的比較采用 Student’st檢驗(yàn)，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較行Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-125b增強(qiáng)CD133+SW480細(xì)胞對順鉑的敏感性

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480的miR-125b表達(dá)水平顯著低于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系FHC。更為重要的是，分離出的CD133+SW480細(xì)胞與常規(guī)SW480細(xì)胞相比，其miR-125b的表達(dá)水平進(jìn)一步下降(圖1A)，提示miR-125b可能在CD133+結(jié)直腸癌細(xì)胞中發(fā)揮抑制作用。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CD133+SW480細(xì)胞對順鉑的敏感性顯著低于常規(guī)SW480細(xì)胞(圖1B)，表明CD133+SW480細(xì)胞對順鉑存在抵抗性。為了探討miR-125b是否與CD133+SW480細(xì)胞對順鉑的敏感性有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)在SW480細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物，熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物能顯著提高腫瘤細(xì)胞中的miR-125b表達(dá)水平(圖1C)。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示順鉑單獨(dú)治療能顯著提高SW480細(xì)胞系中CD133+細(xì)胞的比例，然而聯(lián)用miR-125b后，CD133+SW480細(xì)胞的比例顯著下降(圖1D)。同時，細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-125b能顯著提高順鉑對CD133+SW480細(xì)胞的殺傷活性(圖1E)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-125b能顯著降低CD133+SW480細(xì)胞對順鉑的抵抗性。

2 miR-125b調(diào)控CD133+SW480細(xì)胞HAX-1的表達(dá)

生物信息學(xué)(http://www.targetscan.org/)結(jié)果表明HAX-1 mRNA 3’UTR的第84～90位堿基序列(CUCAGGG)與miR-125b互補(bǔ)結(jié)合，提示HAX-1可能是miR-125b的靶點(diǎn)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CD133+SW480細(xì)胞的HAX-1表達(dá)水平顯著高于常規(guī)SW480細(xì)胞(圖2A)，結(jié)合圖1的結(jié)果，表明在結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-125b的表達(dá)水平與HAX-1呈負(fù)相關(guān)。通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在CD133+SW480細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-125b 模擬物后HAX-1的表達(dá)水平顯著下降(圖2B)，表明miR-125b能調(diào)節(jié)CD133+SW480細(xì)胞中HAX-1的表達(dá)水平。

Figure 1.miR-125b increased the sensitivity of CD133+SW480 cells to cisplatin. A: the expression of miR-125b was significantly down-regulated in the CD133+SW480 cells; B: the sensitivity to cisplatin in the CD133+SW480 cells was significantly lower than that in the routine SW480 cells; C: transfection with miR-125b mimics significantly increased the expression of miR-125b in tumor cells; D: miR-125b inhibited cisplatin-dependent enrichment of the CD133+SW480 cell population; E: miR-125b significantly enhanced the cytotoxicity of cisplatin to the CD133+SW480 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsFHC;#P<0.05vsroutine SW480 cells;△P<0.05vsmiR-NC group;＄P<0.05vscisplatin group.

圖1 miR-125b增強(qiáng)CD133+SW480細(xì)胞對順鉑的敏感性

3 miR-125b聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)CD133+SW480細(xì)胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-125b能顯著增強(qiáng)順鉑對CD133+SW480細(xì)胞線粒體膜電位的損傷，然而轉(zhuǎn)染HAX-1表達(dá)載體能顯著抑制miR-125b的這種協(xié)同作用(圖3A)，表明miR-125b能通過線粒體途徑增強(qiáng)順鉑對CD133+結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物活性。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示順鉑聯(lián)合miR-125b能顯著誘導(dǎo)CD133+SW480細(xì)胞中的細(xì)胞色素C從線粒體中釋放到細(xì)胞質(zhì)中(圖3B)，從而誘導(dǎo)CD133+SW480細(xì)胞發(fā)生凋亡(圖3C)。另外，轉(zhuǎn)染HAX-1表達(dá)載體后順鉑聯(lián)合miR-125b誘導(dǎo)的細(xì)胞色素C的釋放(圖3B)和凋亡(圖3C)的發(fā)生受到顯著抑制，表明miR-125b通過下調(diào)HAX-1的表達(dá)促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的線粒體途徑的凋亡。

討 論

研究表明miR-125b在多種腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用，如zhao等[10]發(fā)現(xiàn)miR-125b在膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)降低，同時過表達(dá)的miR-125b能抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和細(xì)胞周期。在卵巢癌細(xì)胞中，miR-125b被報道能通過下調(diào)EIF4EBP1基因的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[11]。此外，文獻(xiàn)報道m(xù)iR-125b在骨肉瘤細(xì)胞中能下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)而提高順鉑的抗腫瘤活性[12]，表明miR-125b可能與腫瘤的化療敏感性有關(guān)。在本研究中，體外實(shí)驗(yàn)顯示結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480中的miR-125b水平顯著低于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系FHC，提示miR-125b在結(jié)腸癌中同樣起腫瘤抑制作用，是一個抑癌因子，這與文獻(xiàn)報道一致。更為重要的是，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-125b在CD133+SW480細(xì)胞中異常低表達(dá)，提示miR-125b在這類腫瘤細(xì)胞中有重要的作用。

Figure 2.miR-125b regulated the expression ofHAX-1 gene. A: the expression of HAX-1 was significantly up-regulated in the CD133+SW480 cells; B: the expression of HAX-1 was down-regulated by miR-125b in the CD133+SW480 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsFHC cells;#P<0.05vsroutine SW480 cells;△P<0.05vsmiR-NC group;▲P<0.05vsmiR-125b group.

圖2 miR-125b調(diào)節(jié)HAX-1基因的表達(dá)

腫瘤干細(xì)胞對化療的低敏感性是造成腫瘤化療失敗的重要原因[13]，在本研究中，當(dāng)用順鉑單獨(dú)處理結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480后發(fā)現(xiàn)，SW480細(xì)胞系中CD133陽性的腫瘤細(xì)胞比例顯著提高，而CD133+的腫瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性顯著低于CD133-的腫瘤細(xì)胞，致使CD133+SW480細(xì)胞在順鉑治療后存活下來從而引起所占比例的升高。當(dāng)用miR-125b進(jìn)行聯(lián)合治療后，由于CD133+SW480細(xì)胞在miR-125b的作用下對順鉑的敏感性顯著提高，致使CD133+的腫瘤細(xì)胞所占比顯著下降，表明miR-125b能以CD133+的腫瘤細(xì)胞為靶點(diǎn)提高順鉑對結(jié)直腸癌的治療效果。

HAX-1是一種定位在線粒體外膜上的抗凋亡蛋白[14]。研究表明過表達(dá)的HAX-1能阻礙腫瘤細(xì)胞的凋亡途徑，抑制由藥物或其它環(huán)境因素引起的腫瘤細(xì)胞線粒體的損傷，因此包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的HAX-1往往過度表達(dá)[15]。為了研究miR-125b在結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞中的作用機(jī)制，作者通過TargetScan在線工具尋找miR-125b的靶點(diǎn)并用Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明在CD133+SW480腫瘤細(xì)胞中，HAX-1表達(dá)水平受miR-125b的調(diào)節(jié)。miR-125b聯(lián)合順鉑能顯著降低CD133+SW480細(xì)胞的線粒體膜電位，進(jìn)而促使細(xì)胞色素C這一凋亡誘導(dǎo)物質(zhì)[16]從線粒體中釋放到細(xì)胞質(zhì)中，導(dǎo)致CD133+SW480細(xì)胞發(fā)生顯著的凋亡。同時，HAX-1表達(dá)質(zhì)粒能減弱這種效應(yīng)，表明miR-125b可通過下調(diào)CD133+結(jié)直腸癌細(xì)胞HAX-1的表達(dá)水平促進(jìn)順鉑依賴的線粒體途徑的凋亡。

綜上所述，本研究證明了miR-125b能顯著提高CD133+結(jié)直腸癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。通過機(jī)制研究我們發(fā)現(xiàn)miR-125b通過下調(diào)HAX-1的表達(dá)促進(jìn)順鉑對CD133+腫瘤細(xì)胞線粒體的損傷作用進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞細(xì)胞色素C的釋放和凋亡的發(fā)生。這些研究為如何提高順鉑治療效果提供了新的思路和理論依據(jù)。

Figure 3.Combination of cisplatin and miR-125b induced mitochondrium-related apoptosis in the CD133+SW480 cells. A: miR-125b enhanced the cisplatin-induced decrease in mitochondrial membrane potential; B: miR-125b enhanced the cisplatin-induced release of cytochrome C; C: miR-125b enhanced the cisplatin-induced apoptosis in the CD133+SW480 cells.*P<0.05vsmiR-NC group;#P<0.05vscisplatin group;&P<0.05vscisplatin+miR-125b group.

圖3 miR-125b聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)CD133+SW480細(xì)胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡

[1] Reya T, Morrison SJ, Weissman IL, et al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells[J]. Nature, 2001, 414(6859):105-111.

[2] Chuthapisith S, Eremin J, Eremin O, et al. Breast cancer chemoresistance: emerging importance of cancer stem cells[J]. Surg Oncol, 2010, 19(1):27-32.

[3] 陳志輝, 宋新明,何裕隆, 等.結(jié)直腸癌原發(fā)灶中CXCR6的表達(dá)與臨床意義[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 28(5): 811-815.

[4] Zhou J, Li P, Guo X, et al. Salinomycin induces apoptosis in cisplatin-resistant colorectal cancer cells by accumulation of reactive oxygen species[J]. Toxicol Lett, 2013, 222(2):139-145.

[5] Nair N, Gongora E. MicroRNAs as therapeutic targets in cardiomyopathies: myth or reality? [J]. Biomol Concepts, 2014, 5(6):439-448.

[6] He H, Tian W, Jiang K, et al. MiR-944 functions as a novel oncogene and regulates the chemoresistance in breast cancer[J]. Tumour Biol, 2016, 37(2):1599-1607.

[7] Tao YJ, Li YJ, Xu L, et al. Antisense oligonucleotides against microRNA-21 reduced the proliferation and migration of human colon carcinoma cells[J]. Cancer Cell Int, 2015, 15:77.

[8] Dou J, Ni Y, Zhao F, et al. Decreasing lncRNA HOTAIR expression inhibits human colorectal cancer stem cells[J]. Am J Transl Res, 2016, 8(1):98-108.

[9] Prathapan A, Vineetha VP, Raghu KG. Protective effect ofBoerhaaviadiffusaL. against mitochondrial dysfunction in angiotensin II induced hypertrophy in H9c2 cardiomyoblast cells[J]. PLoS One, 2014, 9(4):e96220.

[10] Zhao X, He W, Wu D, et al. MiRNA-125b inhibits proliferation and migration by targeting SphK1 in bladder cancer[J]. Am J Transl Res, 2015, 7(11):2346-2354.

[11] Lee M, Kim EJ, Jeon MJ. MicroRNAs 125a and 125b inhibit ovarian cancer cells through post-transcriptional inactivation of EIF4EBP1[J]. Oncotarget, 2016, 7(8):8726-8742.

[12] Wang F, Yu D, Zhao T, et al. MiR-125b functions as a tumor suppressor and enhances chemosensitivity to cisplatin in osteosarcoma[J]. Technol Cancer Res Treat, 2016, 15(6):NP105-NP112.

[13] Zhang HL, Wang P, Zhang SD, et al. c-Myc regulation of ATP-binding cassette transporter reverses chemoresistance in CD133+colon cancer stem cells[J]. Sheng Li Xue Bao, 2016, 68(2):171-178.

[14] Trebinska A, H?gstrand K, Fadeel B, et al. Exploring the anti-apoptotic role of HAX-1 versus BCL-XLin cytokine-dependent bone marrow-derived cells from mice[J]. FEBS Lett, 2014, 588(17):2921-2927.

[15] Li X, Jiang J, Luo X, et al. Expression of HAX-1 in colorectal cancer and its role in cancer cell growth[J]. Mol Med Rep, 2015, 12(3):4071-4078.

[16] Kwegyir-Afful AK, Ramalingam S, Njar VC, et al. Galeterone and VNPT55 induce proteasomal degradation of AR/AR-V7, induce significant apoptosis via cytochrome c release and suppress growth of castration resistant prostate cancer xenograftsinvivo[J]. Oncotarget, 2015, 6(29):27440-27460.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

miR-125b increases sensitivity of CD133+colorectal cancer cells to cisplatin by down-regulating HAX-1 expression

PAN Hai-qiang, SHEN Feng, CUI Jun-hui, CAI Ke, DU Zhi-jun

(DepartmentofProctology,TongdeHospitalofZhejiangProvince,Hangzhou310012,China.E-mail:tongdepanhaiqiang@163.com)

AIM: To investigate the role of miR-125b in regulating the sensitivity of CD133+colorectal cancer cells to cisplatin. METHODS: The expression of miR-125b was detected by RT-qPCR in the routine SW480 cells and CD133+SW480 cells. Flow cytometry analysis was performed to measure the percentage of CD133+cell population in the SW480 cell line treated with miR-125b and cisplatin. MTT assay was performed to evaluate the effect of miR-125b on the cisplatin-induced cell death in the CD133+SW480 cells. Bioinformatics and Western blot were performed to determine whether the expression of HAX-1 was regulated by miR-125b. JC-1 staining, Annexin V staining and Western blot analysis were used to study the pathway of apoptosis in the CD133+SW480 cells co-treated with miR-125b and cisplatin. RESULTS: The expression of miR-125b was significantly lower in the CD133+SW480 cells than that in the routine SW480 cells and normal colonic epithelial FHC cells. Treatment with cisplatin alone increased the percentage of CD133+SW480 cell population. However, miR-125b significantly inhibited the enrichment of CD133+cell population induced by cisplatin. In addition, the results of MTT assay showed that the anti-tumor effect of cisplatin was significantly enhanced when the miR-125b was transfected into the CD133+SW480 cells. The results of Western blot indicated that theHAX-1 gene was the target of miR-125b. Furthermore, the apoptosis induced by the combination of miR-125b and cisplatin was dependent on the dysfunction of mitochondrial membrane, leading to the release of cytochrome C into the cytoplasm and the subsequently activation of apoptosis in the CD133+SW480 cells. CONCLUSION: miR-125b increased the sensitivity of CD133+colo-rectal cancer cells to cisplatin by down-regulating the expression of HAX-1.

miR-125b; HAX-1; Cytochrome C; Cisplatin; CD133+colorectal cancer cells

1000- 4718(2017)06- 1053- 07

2016- 10- 24

2017- 01- 12

R730.23; R735.7

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.016

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel： 0571-89972372; E-mail： tongdepanhaiqiang@163.com