小檗堿增強(qiáng)表柔比星誘導(dǎo)T24細(xì)胞G0/G1期阻滯的作用機(jī)制*

詹雄宇, 陳奇彪, 呂秀秀, 秦曉平, 陳建帆, 黃保元, 黃 君, 卓育敏△

(暨南大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院泌尿外科， 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系， 廣東 廣州 510632)

小檗堿增強(qiáng)表柔比星誘導(dǎo)T24細(xì)胞G0/G1期阻滯的作用機(jī)制*

詹雄宇1, 陳奇彪1, 呂秀秀2, 秦曉平1, 陳建帆1, 黃保元1, 黃 君1, 卓育敏1△

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院泌尿外科，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系， 廣東 廣州 510632)

目的： 探討小檗堿聯(lián)合表柔比星對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞周期的影響及相關(guān)作用機(jī)制。方法: 實(shí)驗(yàn)將膀胱癌T24細(xì)胞分為4組：對(duì)照組、表柔比星組、表柔比星+小檗堿組和小檗堿組，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活力，檢測(cè)藥物處理后對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖的抑制情況。用流式細(xì)胞術(shù)分析T24細(xì)胞周期分布并用Western blot法測(cè)定cyclin D1、CDK2、CDK4、P21和P27蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果: 小檗堿聯(lián)合表柔比星顯著抑制T24細(xì)胞的活力，存在時(shí)間依賴性,聯(lián)合用藥組的G0/G1期細(xì)胞比例增高，S期和G2期細(xì)胞比例降低,與單用藥物組及對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05)。聯(lián)合用藥上調(diào)細(xì)胞周期依賴性激酶抑制蛋白P27和P21蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)下調(diào)cyclin D1、CDK2及CDK4細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)水平。結(jié)論: 小檗堿增強(qiáng)表柔比星對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖的抑制及G0/G1期阻滯，其作用機(jī)制可能與上調(diào)P27及P21蛋白和抑制cyclin D1、CDK2及CDK4蛋白表達(dá)有關(guān)。

小檗堿； 表柔比星； T24細(xì)胞； 細(xì)胞周期阻滯

經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)(transurethral resection of bladder tumor，TURBT)是非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(non-muscle-invasive bladder cancer，NMIBC)的主要治療手段，但是術(shù)后會(huì)有很高的復(fù)發(fā)率，所以推薦所有患者進(jìn)行術(shù)后輔助性膀胱灌注治療[1]。表柔比星(epirubicin，Epi) 屬第三代蒽環(huán)類抗生素類抗腫瘤半合成化合物，常用于膀胱癌術(shù)后灌注化療[2]。研究表明表柔比星輔助膀胱灌注化療明顯降低NMIBC術(shù)后復(fù)發(fā)率。其主要產(chǎn)生的副作用是化學(xué)性膀胱炎，如膀胱刺激征、血尿和膀胱燒灼感等癥狀，常致病人儲(chǔ)尿時(shí)間縮短，藥物滯留膀胱時(shí)間縮短，從而影響治療效果,且其嚴(yán)重程度與灌注藥物濃度及頻率相關(guān)[3]。這些不良反應(yīng)限制了其在治療膀胱癌方面的廣泛應(yīng)用。因此，尋找一種對(duì)治療膀胱癌有更高療效，又能減輕其副作用的治療方法，具有十分重要的臨床意義。

小檗堿(berberine,Ber)在臨床上廣泛應(yīng)用于止瀉、抗炎和抗氧化[4]。近年來(lái)大量研究表明，小檗堿有抗癌作用且對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有毒性，能阻止腫瘤細(xì)胞增殖和殺死癌細(xì)胞，在乳腺癌、結(jié)直腸癌和膀胱癌中具有抗腫瘤活性[5]。 Tillhon 等[6]報(bào)道小檗堿能引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生G1和G2/M期阻滯，并具有劑量依賴性，其主要作用機(jī)制與增加蛋白P21和P27的表達(dá)，抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase， CDK)2、CDK4和細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)的表達(dá)，進(jìn)而降低cyclin-CDK復(fù)合體的活性有關(guān)。我們前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，小檗堿促進(jìn)阿霉素誘導(dǎo)的T24細(xì)胞凋亡[7];但是小檗堿聯(lián)合表柔比星對(duì)膀胱癌細(xì)胞周期有何影響，尚缺乏深入研究。因此本研究旨在觀察小檗堿聯(lián)合表柔比星對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響，并探討其作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

中性硫酸小檗堿購(gòu)自Sigma；表柔比星注射液購(gòu)自浙江海正藥業(yè)股份有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清、青霉素和鏈霉素為HyClone產(chǎn)品；本研究所用抗體購(gòu)自Cell Signalling Technology；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECL)購(gòu)自Millipore。

2 細(xì)胞及培養(yǎng)

人類膀胱癌T24細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心(編號(hào)：TcHu55)，用含1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 MTT法檢測(cè)T24細(xì)胞增殖抑制情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人膀胱癌T24細(xì)胞按1×107/L 密度接種到 96 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入小檗堿(0.5、1和2 μmol/L)和/或表柔比星(4 μmol/L)分別處理24 h及48 h，然后每孔加入 MTT 溶液(5 g/L) 10 μL，培養(yǎng) 4 h 后， 棄去上層培養(yǎng)基， 每孔加入二甲基亞砜 150 μL， 振蕩 10 min，待藍(lán)色結(jié)晶完全溶解后，在酶標(biāo)儀 490 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度(A) 值。計(jì)算藥物對(duì)T24細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%。根據(jù)MTT結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用Ber濃度確定為1 μmol/L。

3.2 細(xì)胞周期分布的檢測(cè) 收獲加藥處理24 h的細(xì)胞后用4 ℃ PBS洗滌1次，冷無(wú)水乙醇4 ℃固定過(guò)夜,然后再用PBS洗滌1次，離心，棄上清，加入500 μL含有RNase A的PBS液重懸細(xì)胞，在37 ℃溫箱避光孵育30 min，加入PI染液繼續(xù)避光孵育30 min，置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.3 Western blot 檢測(cè)T24細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá) 按照細(xì)胞蛋白分離和提取試劑盒說(shuō)明書的方法提取蛋白。BCA法檢測(cè)各組蛋白濃度，計(jì)算使用Western blot所需樣品濃度，分別將30 mg樣品蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜(PVDF膜)上。5%脫脂奶粉封閉后，加入cyclin D1、CDK2、CDK4、P21、P27單克隆抗體及內(nèi)參照GAPDH抗體在4 ℃環(huán)境下孵育過(guò)夜，次日TBST漂洗濾膜3次后，加入相應(yīng)的Ⅱ抗，并室溫封閉1 h，TBST漂洗濾膜，之后經(jīng)ECL孵育，然后曝光，用Scion Image分析軟件進(jìn)行目的蛋白條帶的灰度值分析，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參照 GAPDH 的灰度比值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，兩組數(shù)據(jù)間的比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小檗堿增強(qiáng)表柔比星抑制膀胱癌T24細(xì)胞增殖

不同濃度小檗堿(0.5、1和2 μmol/L)協(xié)同表柔比星(4 μmol/L)處理T24細(xì)胞24 h和48 h后，對(duì)細(xì)胞活力有明顯抑制作用。聯(lián)合藥物組對(duì)T24細(xì)胞抑制效果較單用藥物組明顯(P<0.05),且其作用具有明顯的時(shí)間依賴性。而小檗堿各組濃度之間，隨著濃度增加，時(shí)間延長(zhǎng)，其對(duì)T24細(xì)胞的增殖活性抑制無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖1。

2 細(xì)胞周期分布的檢測(cè)

PI 染色法檢測(cè)細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，小檗堿聯(lián)合表柔比星組較單用藥物組顯然有更多的細(xì)胞阻滯在G1期， 同時(shí)T24細(xì)胞在S期和G2/M期的數(shù)量減少，見(jiàn)圖2。

Figure 1.The viability of T24 human bladder cancer cells treated with Epi, with or without Ber for 24 h and 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEpi group;△P<0.05vs24 h.

圖1 小檗堿聯(lián)合表柔比星對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖的抑制作用

3 Western blot檢測(cè)T24細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，小檗堿聯(lián)合表柔比星能明顯促進(jìn)P21和P27表達(dá)，同時(shí)抑制cyclin D1、CDK2和CDK4蛋白表達(dá)水平，見(jiàn)圖3、4。

討 論

小檗堿是一種常見(jiàn)的異喹啉類生物堿，近年來(lái)大量研究表明其具有抗腫瘤作用[6]。此外，表柔比星是臨床上常用的抗腫瘤藥物，但是其長(zhǎng)期高劑量的臨床應(yīng)用導(dǎo)致患者出現(xiàn)膀胱黏膜損傷及誘發(fā)心臟毒性，限制其廣泛應(yīng)用和遠(yuǎn)期效果[3]，兩者聯(lián)合作用于膀胱癌T24細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)壳吧形从袌?bào)道。

Figure 2.Ber promoted Epi-induced cell cycle arrest at G0/G1phase. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol (Con) group;#P<0.05vsEpi group.

圖2 小檗堿聯(lián)合表柔比星誘導(dǎo)T24細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期

Figure 3.Effect of Ber on P21 and P27 protein levels in Epi-treated T24 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol (Con) group；#P<0.05vsEpi group.

圖3 各組T24細(xì)胞P21和P27的表達(dá)情況

本研究結(jié)果表明小檗堿能增強(qiáng)表柔比星抑制膀胱癌T24細(xì)胞的增殖活力，具有時(shí)間依賴性。

細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成開(kāi)始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程，分為分裂間期與分裂期2個(gè)階段，其通過(guò)周期蛋白家族一系列DNA的表達(dá)調(diào)控而有序進(jìn)行，并嚴(yán)格按照G0/G1-S-G2-M的順序進(jìn)行。研究證實(shí)在細(xì)胞增殖周期表達(dá)期間存在一系列的調(diào)控因子，主要包括CDK、cyclin和CDK抑制劑(CDK inhibitor,CKI)，而CDK是整個(gè)細(xì)胞周期的調(diào)控中心，cyclin對(duì)CDK起正性調(diào)控作用，CKI對(duì)CDK起負(fù)性調(diào)控作用。P27蛋白對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控主要是通過(guò)對(duì)cyclin E-CDK2復(fù)合物活性的抑制，從而使得細(xì)胞周期停滯在G0/G1期[8]。有研究報(bào)道，小檗堿能夠下調(diào)G1期相關(guān)基因cyclin D1、cyclin E1、CDK2和CDK4的表達(dá),并上調(diào)負(fù)調(diào)控基因P27的表達(dá)[9-10]。本實(shí)驗(yàn)中Western blot結(jié)果顯示，小檗堿聯(lián)合表柔比星藥物組處理T24細(xì)胞后P27的表達(dá)上調(diào)，這與上述研究結(jié)果相一致，表明小檗堿聯(lián)合表柔比星可能通過(guò)上調(diào)P27的表達(dá)直接抑制cyclin-CDK復(fù)合物的激活，阻滯T24細(xì)胞周期G0/G1期進(jìn)入S期。

Figure 4.Effect of Ber on the protein expression of cyclin D1, CDK2 and CDK4 in T24 cells treated with Epi (4 μmol/L) for 24 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol (Con) group；#P<0.05vsEpi group.

圖4 各組T24細(xì)胞cyclin-CDK復(fù)合物的表達(dá)情況

Tashiro 等[11]研究發(fā)現(xiàn)cyclin D1可以通過(guò)激活CDK4或CDK6等作用，促進(jìn)DNA合成以及細(xì)胞周期中G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，Ber與Epi藥物聯(lián)合組G0/G1期細(xì)胞比例增高, S期和G2/M期細(xì)胞比例降低,與單用Epi組及對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明小檗堿能夠促進(jìn)表柔比星加強(qiáng)對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞周期抑制作用。而Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)小檗堿聯(lián)合表柔比星抑制T24細(xì)胞細(xì)胞周期中關(guān)鍵蛋白CDK2、CDK4和cyclin D1的表達(dá)水平和酶活性顯著降低，提示小檗堿能夠促進(jìn)表柔比星加強(qiáng)對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞周期抑制作用，其主要途徑是通過(guò)降低T24細(xì)胞的CDK和cyclin D1表達(dá)從而阻斷細(xì)胞從G1期向S期進(jìn)展,造成G1期細(xì)胞堆積。

目前認(rèn)為P21幾乎可以和每一種cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，廣泛抑制各種cyclin-CDK復(fù)合物，如cyclin D1-CDK4、cyclin E-CDK2和cyclin A-CDK2[12]。已有研究證明P21的過(guò)表達(dá)可使細(xì)胞周期阻滯于G1期、G2期或S期，其機(jī)制主要是抑制cyclin E/CDK2及cyclin D1/CDK4等細(xì)胞周期相關(guān)cyclin-CDK復(fù)合物的活性，阻滯于G1期或G2/M期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞修復(fù)DNA損傷[13]。 Yan 等[14-15]研究發(fā)現(xiàn)小檗堿能夠通過(guò)上調(diào)P21的表達(dá)，介導(dǎo)caspase-9-caspase-3的內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞G1期細(xì)胞周期的阻滯和凋亡。我們?cè)谘芯拷Y(jié)果顯示，小檗堿聯(lián)合表柔比星藥物組較單用藥物組處理T24細(xì)胞后P21蛋白的表達(dá)水平上調(diào)，表明其可能通過(guò)上調(diào)P21的表達(dá)，阻滯T24細(xì)胞周期于G1期，但G2/M期是否發(fā)生阻滯尚未明確。

綜上所述，小檗堿能增強(qiáng)表柔比星抑制人T24細(xì)胞增殖的作用，具有時(shí)間依賴性效應(yīng)。小檗堿能增強(qiáng)表柔比星誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞G0/G1期阻滯的作用，其機(jī)制可能與其上調(diào)P27及P21蛋白的表達(dá)水平，抑制cyclin D1、CDK2及CDK4等細(xì)胞周期相關(guān)cyclin-CDK復(fù)合物的活性有關(guān)，這些結(jié)果為治療膀胱癌和其它腫瘤提供新的策略和思路。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Berberine promotes epirubicin-induced G0/G1phase arrest in T24 bladder cancer cells

ZHAN Xiong-yu1, CHEN Qi-biao1, Lg Xiu-xiu2, QIN Xiao-ping1, CHEN Jian-fan1, HUANG Bao-yuan1, HUANG Jun1, ZHUO Yu-min1

(1DepartmentofUrology,TheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofPathophysiology,SchoolofBasicMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tzhuoyumin@126.com)

AIM: To observe the effects of the combination of berberin and epirubicin on the cell cycle of T24 bladder cancer cells and the underlying mechanisms. METHODS: The cancer cells were exposed to epirubicin in the presence or absence of different concentrations of berberin. The viability of the cancer cells was determined by MTT assay. The cell cycle distribution was detected by flow cytometry, and the protein levels of cyclin D1, CDK2, CDK4, P21 and P27 were detected by Western blot. RESULTS: Berberine markedly enhanced the inhibitory effect of epirubicin on the viability of T24 cells and promoted epirubicin-induced cell cycle arrest at G0/G1phase as compared with the negative control cells. Epirubicin increased the protein expression of P27 and P21, both of which were enhanced by treatment with berberin. In contrast, berberin exposure further decreased the protein expression of cyclin D1, CDK2 and CDK4 in epirubicin-treated T24 cells.CONCLUSION: Berberine significantly promotes epirubicin-induced G0/G1phase arrest in human bladder cancer cells by up-regulating P27 and P21 expression and inhibiting the expression of cyclin D1, CDK2 and CDK4.

Berberine; Epirubicin; T24 cells; Cell cycle arrest

1000- 4718(2017)06- 1048- 05

2016- 12- 23

2017- 03- 28

暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院科研培育專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(No. 2014105)

R730.23； R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.015

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