Ski在大鼠活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的變化*

趙 鑫， 寇江力， 郭永強， 蒲彥川， 周開升， 南 偉， 汪 靜， 伍亞民， 張海鴻

(1蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科， 2甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病研究重點實驗室， 甘肅 蘭州 730030； 3第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所三室， 創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點實驗室， 重慶 400042)

Ski在大鼠活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的變化*

趙 鑫1, 2， 寇江力1, 2， 郭永強1, 2， 蒲彥川1, 2， 周開升1, 2， 南 偉1, 2， 汪 靜2， 伍亞民3， 張海鴻1

(1蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，2甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病研究重點實驗室， 甘肅 蘭州 730030；3第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所三室， 創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點實驗室， 重慶 400042)

目的： 探究Ski在大鼠正常及活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)及隨時間變化的規(guī)律。方法: 提取大鼠大腦皮質(zhì)，分離星形膠質(zhì)細(xì)胞，體外培養(yǎng)。采用LPS刺激和細(xì)胞劃痕損傷2種方法活化星形膠質(zhì)細(xì)胞，均采用Western blot法檢測各個時點2種活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中Ski和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)蛋白表達(dá)情況，利用間接免疫熒光法檢測Ski蛋白在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)定位。結(jié)果: GFAP蛋白在星形膠質(zhì)細(xì)胞中固有表達(dá)，LPS活化和劃痕損傷后表達(dá)均上調(diào)。Ski在正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中呈低表達(dá)狀態(tài)，1 mg/L LPS活化星形膠質(zhì)細(xì)胞后，Ski表達(dá)開始增加，4 d時表達(dá)量最高(P<0.05)，6 d時開始下降，但仍高于未活化組；細(xì)胞劃痕損傷后Ski蛋白表達(dá)情況與上述情況高度一致。Ski在正常及LPS活化6 d星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)主要集中在胞核，LPS活化后2和4 d時在胞質(zhì)中出現(xiàn)明確的Ski表達(dá)。結(jié)論: Ski蛋白表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞，并在活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。由此，我們推測Ski蛋白可能調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化、增殖等過程。

Ski； 膠質(zhì)纖維酸性蛋白； 星形膠質(zhì)細(xì)胞； 膠質(zhì)瘢痕

脊髓損傷(spine cord injury，SCI)是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病，該疾病的神經(jīng)功能修復(fù)是目前醫(yī)學(xué)所面臨的重大難題[1]。而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞是數(shù)目最多的膠質(zhì)細(xì)胞，是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)細(xì)胞[2-3]。有研究指出，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓損傷急性修復(fù)期中扮演著重要的角色[4]。

近年來研究表明，Ski在創(chuàng)口愈合、肝臟再生、腫瘤的發(fā)生發(fā)展、血管平滑肌的增殖及骨骼肌的分化、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程、脊髓損傷等領(lǐng)域起至關(guān)重要的作用[5-6]。本課題組前期在體實驗研究已報道了Ski在脊髓損傷后脊髓組織中的表達(dá)變化規(guī)律[7-8]，但Ski在細(xì)胞水平的表達(dá)規(guī)律又如何呢？為此，本實驗在細(xì)胞水平研究Ski在活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律及細(xì)胞定位，為進一步探討Ski調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化、遷移及膠質(zhì)瘢痕的形成奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 動物

1～3天的新生健康SD大鼠，購于甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心。

2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基和胰蛋白酶(Gibco)；胎牛血清(PAN-Biotech GmbH)；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、多聚甲醛、Trition X-100和SDS(Sigma)；RIPA裂解液和BCA蛋白定量檢測試劑盒(碧云天)；小鼠抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein， GFAP)多克隆抗體和兔抗大鼠GFAP多克隆抗體(Proteintech)；抗Ski抗體(Santa Cruz)；小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(Proteintech)；山羊抗小鼠IgG和FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(Solarbio)；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋)；山羊封閉血清、DAPI溶液和PVDF膜(Solarbio)；ECL試劑盒(Millipore)。

3 主要方法

3.1 新生大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的提取、純化及體外培養(yǎng) 取新生1～2 d內(nèi)的SD大鼠乳鼠在75%乙醇中浸泡消毒，-20 ℃冰箱中冷凍麻醉5 min。剪斷雙側(cè)頸動脈放血，沿“人字縫”將頭皮剪開外翻，再沿頭顱后正中線剪開顱骨，取出雙側(cè)大腦皮質(zhì)，放入D-Hanks液中，漂洗2遍。用眼科尖鑷仔細(xì)剝離腦膜。把剝離好的腦皮質(zhì)放入盛有胰酶的皿器中，剪碎腦皮質(zhì)，用1 mL移液器輕柔吹打至組織塊消散，置入37 ℃溫箱輔助胰酶充分消化腦皮質(zhì)3 min。將消化后的腦皮質(zhì)移至15 mL離心管中，向離心管補加完全培養(yǎng)基4 mL，1 500 r/min離心8 min。棄上清液，再加入12%完全培養(yǎng)基(DMEM/FBS)4 mL，制成細(xì)胞懸液，將其移至培養(yǎng)瓶中。放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。之后每隔3 d用含12%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基換液，培養(yǎng)6～8 d，待細(xì)胞融合貼滿瓶壁，封口后放入37 ℃恒溫旋轉(zhuǎn)搖床(190 r/min)，除去懸浮細(xì)胞和貼壁不牢的細(xì)胞，6 h后取出，進行傳代培養(yǎng)即可獲得純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞。

3.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定及純度計數(shù) GFAP作為星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白[9-10]，采用GFAP細(xì)胞免疫熒光染色法對星形膠質(zhì)細(xì)胞進行純度鑒定，在熒光顯微鏡高倍視野(×200)下隨機選取5個視野進行純度計數(shù)。星形膠質(zhì)細(xì)胞純度=每一觀察視野內(nèi)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。純度達(dá)到96%以上的星形膠質(zhì)細(xì)胞符合本實驗要求。

3.3 LPS活化細(xì)胞模形的建立及其分組 將處于對數(shù)生長期的星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機分為2組：空白對照組；LPS單一刺激組。LPS單一刺激組再分6個亞組，采用濃度為0.001、0.01、0.1、1、10和100 mg/L的LPS分別作用于細(xì)胞8 h。采用Western blot法檢測各組GFAP蛋白的表達(dá)量。將處于對數(shù)生長期的星形膠質(zhì)細(xì)胞重新隨機分為2組：空白對照組；LPS單一刺激組。單一刺激組再分4個亞組，取LPS終濃度為1 mg/L，刺激后繼續(xù)培養(yǎng)時間分別為2、4、6和8 d。采用Western blot法檢測各組Ski蛋白的表達(dá)量。各組均設(shè)3個皿。

3.4 細(xì)胞劃痕損傷模形的建立 參考文獻[11-12]建立細(xì)胞損傷模形的方法并加以改良。將純化后的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞傳代接種于6孔板中培養(yǎng)，直至細(xì)胞長滿融合。采用預(yù)先設(shè)計好的標(biāo)準(zhǔn)模版，其上劃有縱、橫網(wǎng)格線(間距均為3 mm)，將其放置在培養(yǎng)板的底部，吸掉培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液并用PBS液輕柔沖洗2遍后，在超凈工作臺中用200 μL微量移液器吸頭嚴(yán)格按照預(yù)先設(shè)計好的標(biāo)準(zhǔn)模版線條均勻用力制成縱、橫損傷路徑。之后，用PBS清洗細(xì)胞以去除損傷的細(xì)胞碎片，劃傷寬度約為1 mm，補加新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)天數(shù)(0、1、2、4、6、8和10 d)后在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞反應(yīng)，拍照后提取總蛋白。確保同一批次實驗內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷程度和范圍一致。

3.5 Western blot實驗 觀察上述各組細(xì)胞生長情況，收集各組細(xì)胞提蛋白。用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2遍，用RIPA裂解液裂解30 min，細(xì)胞刮匙刮下細(xì)胞，在4 ℃低溫離心機中以轉(zhuǎn)速14 000 r/min離心15 min，收集上清，棄沉淀，加入30 μL(上清液的1/3)蛋白上樣液，開水煮沸3 min。BCA試劑盒測定總蛋白濃度，將其存放于-80 ℃冰箱保存待用。提取的蛋白質(zhì)行10% SDS-PAGE(濃縮膠90 V，分離膠120 V)，將分離好的蛋白電轉(zhuǎn)至甲醇浸透好的PVDF膜上，采用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST(10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5， 150 mmol/L NaCl， 0.5% Tween 20)洗滌10 min×3次，附加 I 抗 [兔抗大鼠GFAP多克隆抗體(1∶300)、兔抗大鼠Ski多克隆抗體(1∶100)和小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(1∶5 000)]，4 ℃冰箱中反應(yīng)過夜；TBST洗膜(方法同前)；附加II 抗[辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗兔或抗小鼠IgG(1∶5 000)]，室溫下反應(yīng)2 h；TBST洗膜(方法同前)；滴加ECL發(fā)光液，在GE凝膠成像系統(tǒng)中測量各目的條帶的灰度值，以目的蛋白的灰度值與內(nèi)參照β-actin蛋白條帶的灰度值之比反應(yīng)目的蛋白的表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

3.6 免疫熒光染色檢測GFAP和Ski蛋白的表達(dá) 通過免疫熒光染色法分析各活化時點(0、2、4和6 d)Ski蛋白的表達(dá)規(guī)律及細(xì)胞亞定位，觀察Ski蛋白細(xì)胞亞定位及其是否隨活化時間的延長而發(fā)生改變。用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度，將原代純化后的細(xì)胞以同一細(xì)胞濃度接種到蓋玻片上，貼壁后用1 mg/L LPS活化星形膠質(zhì)細(xì)胞，4 d后倒掉舊的培養(yǎng)基，用PBS清洗2遍，多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌2遍，Trition X-100通透20 min，PBS洗滌2遍，滴加山羊封閉血清，37 ℃下封閉30 min，然后吸凈封閉液，勿洗，加入 I 抗 [小鼠抗大鼠GFAP多克隆抗體(1∶300)和兔抗大鼠Ski多克隆抗體(1∶100)]，將玻片置于濕盒中，于4 ℃冰箱中孵育過夜。PBS洗滌2遍，避光下加 II 抗 [山羊抗小鼠IgG(1∶300)和FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶300)]，37 ℃溫箱中避光孵育90 min，PBS洗滌2遍，避光下附加DAPI，室溫孵育20 min，PBS洗滌2遍。甘油封片。熒光顯微鏡下觀察。陰性對照用PBS代替 I 抗。胞核及胞漿中出現(xiàn)紅色或綠色熒光為陽性細(xì)胞，陰性對照細(xì)胞不出現(xiàn)熒光。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。每組數(shù)據(jù)來自3次獨立的實驗，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，均數(shù)間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 體外培養(yǎng)SD大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及純度鑒定

首次傳代純化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下觀察可見細(xì)胞傳代培養(yǎng)12 h后基本貼壁生長，細(xì)胞輪廓清晰，可見細(xì)胞突起較多，且胞突之間有交叉連接，胞體形態(tài)多樣，多數(shù)呈星形；活化后的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，如細(xì)胞胞體肥大，胞突增粗、形狀不規(guī)則等(圖1)。待正常細(xì)胞密度合適，給予免疫熒光化學(xué)染色，熒光顯微鏡下可見星形膠質(zhì)細(xì)胞更為清晰的形態(tài)學(xué)特征，且胞核呈圓形或橢圓形。通過其純度計算公式，得出星形膠質(zhì)細(xì)胞純度平均值為98%。特異性標(biāo)記抗原GFAP為紅色熒光，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核為藍(lán)色熒光，均清晰可辨(圖2)。

Figure 1.Appearance comparison between normal and activated astrocytes (×200).

圖1 星形膠質(zhì)細(xì)胞活化前后形態(tài)的對比

Figure 2.Evaluation of the astrocyte purity by GFAP expression detection (×200).

圖2 通過檢測GFAP表達(dá)鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞純度

2 劃痕損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化

劃痕造成星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后，劃傷區(qū)域的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體及胞突完全消失，損傷周圍部分細(xì)胞的胞突斷裂，并退縮回胞體，遠(yuǎn)隔損傷區(qū)域的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變。隨著損傷時間的延長，損傷區(qū)周圍細(xì)胞體積增大，細(xì)胞突起增粗，4 d后細(xì)胞突起彼此交織，形成網(wǎng)狀聚集，見圖3。

Figure 3.Appearance of astrocytes after scratch injury (×200).

圖3 劃痕損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)

3 LPS誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP蛋白表達(dá)的最適濃度

如圖4所示，各分組變量為LPS濃度，與正常對照組相比，隨著LPS濃度的升高，GFAP在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)。當(dāng)濃度為0.01 mg/L時，GFAP蛋白表達(dá)少量升高，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；當(dāng)濃度大于0.01 mg/L時，GFAP表達(dá)上調(diào)程度與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且濃度為1 mg/L時，GFAP表達(dá)量最高；當(dāng)LPS濃度為10和100 mg/L時，GFAP蛋白表達(dá)量較1 mg/L有所降低，但仍高于對照組。

Figure 4.The effects of different doses of LPS on the protein level of GFAP in the astrocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mg/L.

圖4 不同濃度LPS對星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP蛋白表達(dá)的影響

4 LPS誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP和Ski蛋白表達(dá)的時相變化

用1 mg/L LPS分別作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞0、2、4、6和8 d，經(jīng)過不同時間的誘導(dǎo)活化，Ski和GFAP的表達(dá)量不同。如圖5所示，LPS誘導(dǎo)0～4 d這一時間段，Ski和GFAP蛋白表達(dá)量逐步增加，在4 d這一時間點達(dá)到峰值(P<0.05)；活化時間4～6 d時，Ski蛋白表達(dá)量又呈現(xiàn)快速下降趨勢，但Ski蛋白表達(dá)量仍高于對照組，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，活化時間為8 d時，Ski蛋白表達(dá)量仍高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。

Figure 5.The effects of LPS (0.1 mg/L) exposure for different stimulation time on the protein expression of Ski and GFAP in the astrocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 d.

圖5 0.1 mg/L LPS作用不同時間對星形膠質(zhì)細(xì)胞Ski和GFAP蛋白表達(dá)的影響

5 劃痕損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP和Ski蛋白表達(dá)的時相變化

劃痕損傷后經(jīng)過不同時間(0、1、2、4、6、8和10 d)，星形膠質(zhì)細(xì)胞Ski和GFAP的表達(dá)量不同。如圖6所示，劃痕損傷0～6 d這一時段，Ski和GFAP蛋白表達(dá)量逐步增加，在6 d這一時點達(dá)到峰值(P<0.05)；活化時間6～10 d時， Ski和GFAP蛋白表達(dá)量又呈現(xiàn)同步下降趨勢，但兩者蛋白表達(dá)量仍高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Ski和GFAP表達(dá)情況同LPS活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)果高度一致。

Figure 6.The effects of scratch injury for different time on the protein expression of Ski and GFAP in the astrocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 d.

圖6 不同作用時間的劃痕損傷對星形膠質(zhì)細(xì)胞Ski和GFAP蛋白的影響

6 免疫熒光染色

在免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果顯示，Ski在正常星形膠質(zhì)細(xì)胞及活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，在對照組中，Ski表達(dá)較弱，主要位于胞核，胞質(zhì)中無明顯表達(dá)；在活化時間為2 d時，Ski表達(dá)較對照組有所增強，且胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯表達(dá)；活化4 d時，胞體明顯增大，胞核和胞質(zhì)中的表達(dá)明顯增加；活化6 d時，Ski表達(dá)較4 d有所下降，胞質(zhì)中的表達(dá)信號強度再次減少，隨著活化時間的繼續(xù)延長，Ski蛋白在胞質(zhì)與胞核中的表達(dá)逐漸降低，且胞質(zhì)降低要先于胞核，見圖7。

討 論

脊髓損傷致癱率極高，因脊髓損傷導(dǎo)致?lián)p傷部位以下運動與感覺功能喪失的患者逐年增多，且預(yù)后較差，脊髓損傷的病理變化是由多種因素介導(dǎo)的復(fù)雜過程[13]。因此脊髓損傷的修復(fù)成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)科研及臨床工作者研究的熱點、難點。

一般認(rèn)為，SCI后膠質(zhì)瘢痕的形成與損傷刺激、局部缺血微環(huán)境、代謝異常及炎癥反應(yīng)等因素有關(guān)[14]。根據(jù)文獻[15-19]采用LPS活化星形膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP的上調(diào)，模擬脊髓損傷后的活化態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞。本次研究結(jié)果顯示，LPS以濃度依賴的方式上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP蛋白的表達(dá)，當(dāng)濃度為1 mg/L時，GFAP蛋白表達(dá)最高；當(dāng)LPS濃度為10 mg/L時，GFAP蛋白表達(dá)量較1 mg/L有所降低，與既往研究相符[20]。

c-Ski 作為進化保守蛋白，與多種細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在多種細(xì)胞生長中具有重要的調(diào)控作用[6]；有研究發(fā)現(xiàn)，Ski在神經(jīng)系統(tǒng)中可以調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)胚胎發(fā)育、施萬細(xì)胞增殖及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等神經(jīng)系統(tǒng)病理變化過程[21]。本實驗是在細(xì)胞水平上研究Ski在活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律及細(xì)胞定位，為進一步探討Ski調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化、遷移及膠質(zhì)瘢痕的形成奠定基礎(chǔ)。

GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白[9-10]。有研究報道[22-23]，在正常的CNS中，星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP蛋白表達(dá)水平較低，當(dāng)星形膠質(zhì)細(xì)胞受到輕微的外界刺激時，GFAP蛋白表達(dá)水平開始上升，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)同期開始肥大；當(dāng)星形膠質(zhì)細(xì)胞受到強烈刺激，并發(fā)嚴(yán)重膠質(zhì)化時，GFAP表達(dá)顯著增高，同時伴有細(xì)胞的增生；GFAP作為星形膠質(zhì)細(xì)胞重要的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白，對星形膠質(zhì)細(xì)胞的生物活性起到重要的調(diào)節(jié)作用，GFAP表達(dá)水平隨著星形膠質(zhì)細(xì)胞活化程度的增高而表達(dá)上升。因此GFAP的表達(dá)水平可反映星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化程度。本研究結(jié)果顯示，在通過LPS誘導(dǎo)或細(xì)胞劃痕損傷活化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，GFAP蛋白表達(dá)量早期逐步上升的，同以往研究結(jié)果一致[22]，標(biāo)志星形膠質(zhì)細(xì)胞活化成功。

另外，本研究結(jié)果顯示Ski蛋白在活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)具有時間依賴性。在正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中，Ski蛋白處于持續(xù)低表達(dá)狀態(tài)；1 mg/L LPS誘導(dǎo)細(xì)胞活化后，Ski蛋白表達(dá)逐漸增高，4 d時Ski蛋白表達(dá)達(dá)到高峰，6 d時開始下降，但仍高于未活化組；此規(guī)律與GFAP蛋白在活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律高度一致。此外，通過細(xì)胞劃痕損傷來進一步體外模擬活化星形膠質(zhì)細(xì)胞，在劃痕損傷0～6 d這一時間段，Ski蛋白表達(dá)量逐步增加，在6 d這一時間點達(dá)到峰值；活化時間6～10 d時， Ski蛋白表達(dá)量又呈現(xiàn)下降趨勢，但Ski蛋白表達(dá)量仍高于對照組；同樣，Ski表達(dá)規(guī)律與GFAP蛋白在活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律高度一致。因此我們推測，Ski可能調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化、肥大、增殖及膠質(zhì)瘢痕形成。

通過免疫熒光發(fā)現(xiàn)，正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中，Ski蛋白主要聚集在胞核，胞質(zhì)表達(dá)較少；在活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中，胞質(zhì)中開始出現(xiàn)Ski蛋白，6 d時胞質(zhì)中Ski蛋白又再次減少。我們知道，蛋白質(zhì)的功能通常與其在細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位相關(guān)，因此，通過其活化前后Ski蛋白亞定位的變化，我們可以推斷，Ski在星形膠質(zhì)細(xì)胞活化過程中起重要的調(diào)控作用。蛋白在細(xì)胞內(nèi)的亞定位問題，是細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究的中心問題，了解Ski蛋白的定位從而有助于我們探索其生物學(xué)功能。

Figure 7.The immunolocalization and change of Ski in the astrocytes (×400).

圖7 Ski在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的免疫熒光定位及其變化

脊髓損傷后，星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性進入活化狀態(tài)，主要表現(xiàn)為胞體增生肥大、突起變粗、分支增多，并向損傷區(qū)域遷移聚集，進而形成膠質(zhì)瘢痕[24]。膠質(zhì)瘢痕對脊髓損傷神經(jīng)修復(fù)作用存在雙面性。早期研究表明[25]，脊髓損傷修復(fù)的關(guān)鍵是提供軸突生長的通道，軸突在脊髓內(nèi)能夠生長，但生長的軸突必須穿過斷端膠質(zhì)瘢痕才能到達(dá)遠(yuǎn)端，獲得運動功能的恢復(fù)。相關(guān)研究證實[26]，膠質(zhì)瘢痕的形成對神經(jīng)功能的恢復(fù)是不利的，膠質(zhì)瘢痕形成后可作為致密的物理屏障，妨礙神經(jīng)軸突的再生。近期有研究發(fā)現(xiàn)[27]，早期膠質(zhì)瘢痕的形成發(fā)揮著重要積極的作用，如阻止有害因子的擴散，限制炎癥的擴散，減少損傷區(qū)域面積，保護周圍神經(jīng)組織，恢復(fù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。研究調(diào)控膠質(zhì)瘢痕生成的最佳時間窗，以充分發(fā)揮膠質(zhì)瘢痕的積極作用，減少其負(fù)面影響，是本課題組今后研究的重點。

綜上所述，Ski蛋白表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞，且在活化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)明顯增高，結(jié)合GFAP蛋白在活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律與Ski表達(dá)規(guī)律的一致性，我們推測Ski可能作為新的信號分子，調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化、增殖等過程，并以此調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘢痕的形成過程。但其活化機制仍需要進一步研究。

[1] Yu WY, He DW. Current trends in spinal cord injury repair[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2015, 19(18):3340-3344.

[2] Sofroniew MV, Vinters HV. Astrocytes: biology and pathology[J]. Acta Neuropathol, 2010, 119(1):7-35.

[3] Dossi E, Vasile F, Rouach N. Human astrocytes in the diseased brain[J]. Brain Res Bull, 2017. Feb13.[Epub ahead of print].

[4] Faulkner JR, Herrmann JE, Woo MJ, et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury[J]. J Neurosci, 2004, 24(9):2143-2155.

[5] 周開升， 朱彥東， 張海鴻， 等. Ski在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用及機制的研究進展[J]. 中國康復(fù)理論與實踐, 2016, 22(7):797-800.

[6] Bonnon C, Atanasoski S. c-Ski in health and disease[J]. Cell Tissue Res, 2012, 347(1):51-64.

[7] 周開升，朱彥東，趙 鑫，等. Ski在大鼠脊髓損傷后不同時間的表達(dá)變化[J]. 中國康復(fù)理論與實踐, 2016, 22 (9):1015-1019.

[8] Zhou K, Nan W, Feng D, et al. Spatiotemporal expression of Ski after rat spinal cord injury[J]. Neuroreport, 2017， 28(3)：149-157.

[9] Middeldorp J, Hol EM. GFAP in health and disease[J]. Prog Neurobiol, 2011, 93(3):421-443.

[10]周朱瑛, 陳秀麗, 李光乾. 黃芩苷對驚厥持續(xù)狀態(tài)幼年大鼠海馬GFAP和NF-κB表達(dá)的影響[J]. 中國病理生理雜志， 2015， 31(8):1510-1515.

[11]黃衛(wèi)東， 劉曉斌， 張越林， 等. 機械劃割至體外培養(yǎng)神經(jīng)元創(chuàng)傷性損傷模形的建立[J]. 陜西醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 41(1):3-8.

[12]林 亨， 陳 兵， 黃梓雄， 等. 劃痕損傷對大鼠腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB表達(dá)及繼發(fā)性死亡的影響[J]. 廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2014, 32(4):442-445.

[13]Kim YH, Ha KY, Kim SI. Spinal cord injury and related clinical trials[J]. Clin Orthop Surg, 2017, 9(1):1-9.

[14]Pekny M, Wilhelmsson U, Pekna M. The dual role of astrocyte activation and reactive gliosis[J]. Neurosci Lett, 2014, 565:30-38.

[15]Sofroniew MV. Astrogliosis[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2014, 7(2):a020420.

[16]Catorce MN, Gevorkian G. LPS-induced murine neuroinflammation model: main features and suitability for pre-clinical assessment of nutraceuticals[J]. Curr Neuropharmacol, 2016, 14(2):155-164.

[17]Tarassishin L, Suh HS, Lee SC. LPS and IL-1 differentially activate mouse and human astrocytes: role of CD14[J]. Glia, 2014, 62(6):999-1013.

[18]Heiman A, Pallottie A, Heary RF, et al. Toll-like receptors in central nervous system injury and disease: a focus on the spinal cord[J]. Brain Behav Immun, 2014, 42:232-245.

[19]Zhang J, Feng G, Bao G, et al. Nuclear translocation of PKM2 modulates astrocyte proliferation via p27 and -catenin pathway after spinal cord injury[J]. Cell Cycle, 2015, 14(16):2609-2618.

[20]Gong P, Xu X, Shi J, et al. Phosphorylation of mitogen- and stress-activated protein kinase-1 in astrocytic inflammation: a possible role in inhibiting production of inflammatory cytokines[J]. PLoS One, 2013, 8(12):e81747.

[21]Atanasoski S, Notterpek L, Lee HY, et al. The protooncogene Ski controls Schwann cell proliferation and myelination[J]. Neuron, 2004, 43(4):499-511.

[22]Hol EM, Pekny M. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system[J]. Curr Opin Cell Biol, 2015, 32:121-130.

[23]Wu YH, Wang HJ, Wang X. 大鼠原發(fā)性腦干損傷后S100B和GFAP的表達(dá)變化[J]. 法醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 31(1):11-14.

[24]Jure I, Pietranera L, De Nicola AF, et al. Spinal cord injury impairs neurogenesis and induces glial reactivity in the hippocampus[J]. Neurochem Res, 2017 Mar 13. [Epub ahead of print]

[25]Fawcett J. Repair of spinal cord injuries: where are we, where are we going?[J]. Spinal Cord, 2002, 40(12):615-623.

[26]Barnabé-Heider F, G?ritz C, Sabelstr?m H, et al. Origin of new glial cells in intact and injured adult spinal cord[J]. Cell Stem Cell, 2010, 7(4):470-482.

[27]Liu Z, Xin H, Chopp M. Reactive astrocytes promote axonal remodeling and neurological recovery after stroke[J]. Neural Regen Res, 2014, 9(21):1874-1875.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Changes of Ski expression levels in rat activated astrocytes

ZHAO Xin1, 2, KOU Jiang-li1, 2, GUO Yong-qiang1, 2, PU Yan-chuan1, 2, ZHOU Kai-sheng1, 2, NAN Wei1, 2, WANG Jing1, 2, WU Ya-min3, ZHANG Hai-hong1

(1DepartmentofOrthopedics,SecondHospitalofLanzhouUniversity,2KeyLaboratoryofBoneandJointDiseasesofGansuProvince,Lanzhou730030,China;3StateKeyLaboratoryofTrauma,BurnsandCombinedInjury,TheThirdDepartmentofResearchInstituteofSurgery,DapingHospital,ThirdMilitaryUniversity,Chongqing400042,China.E-mail:zhanghaihong1968@sina.com)

AIM: To explore the time-dependent change of Ski protein expression in normal and activated astrocytes in rats. METHODS: The astrocytes were obtained from rat cerebral cortex and culturedinvitro. The astrocytes were treated with LPS and scratch injury for activation. Western blot analysis was used to determine glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Ski protein levels in activated astrocytes at a series of time points. The indirect immunofluorescence staining method was performed to detect the location of Ski protein in the astrocytes. RESULTS: The protein of GFAP was naturally expressed in the astrocytes, beginning to increase after treated with LPS and scratch injury. Little protein expression of Ski in the normal astrocytes was observed. The Ski protein expression began to increase after treated with 1 mg/L LPS, peaked at 4 d (P<0.05) and then deceased, but was stills higher than that in the normal cells. The protein expression level of Ski after scratch injury was highly consistent with above mentioned. Ski was mainly observed in the nucleus of the normal cells and the cells treated with LPS for 6 d, while it was observed in the cytoplasm 2 and 4 d after treated with LPS. CONCLUSION: The protein of Ski is expressed in the astrocytes, and the expression level is increased in activated astrocytes， mainly located in the nucelus. Ski may plays an essential roles in the processes of activation and proliferation of astrocytes.

Ski; Glial fibrillary acidic protein; Astrocytes; Glial scar

1000- 4718(2017)06- 0968- 07

2017- 01- 10

2017- 04- 10

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 30772299)

R741； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.002

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