木槿組培快繁技術(shù)研究

王國(guó)熙

摘 要：該研究以木槿幼嫩莖段為外植體，研究了不同種類和濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)木槿組織培養(yǎng)過程的影響，建立了其離體快速繁殖的技術(shù)體系。試驗(yàn)結(jié)果表明：芽誘導(dǎo)的最適宜培養(yǎng)基為MS + 0.2mg·L-1 NAA + 4.0mg·L-1 6-BA，出芽率最高，為84.05%；增殖培養(yǎng)的最適宜的培養(yǎng)基為MS + 1.5mg·L-1 6-BA + 0.1mg·L-1 NAA；MS + 1.0mg·L-1 IBA + 0.1mg·L-1 NAA更適宜生根培養(yǎng)，生根率高達(dá)80.67%；移栽到腐殖土∶蛭石= 2∶1的基質(zhì)中，成活率高達(dá)82.93% 。

關(guān)鍵詞：木槿；幼嫩莖段；組織培養(yǎng)；快速繁殖

中圖分類號(hào) S687.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）11-0054-04

Research on Tissue Culture and Fast Propagation Technology of Hibiscus syriacus

Wang Guoxi

（Fujian Jinsen Group，Sanming 353300，China）

Abstract：Using young stem segment of Hibiscus syriacus as explants，influences of different plant growth regulator type and concentration on the progress of Hibiscus syriacus tissue culture were examined，and the fast propagation in vitro of Sapium sebiferum system was established. The results showed that the optimum medium formula of bud induction culture was MS+0.2mg·L-1 NAA+4.0mg·L-1 6-BA and the bud rate was the highest. The optimum culture medium for multiplication was MS+1.5mg·L-1 6-BA+0.1mg·L-1 NAA.The most suitable medium for rooting induction was MS+1.0mg·L-1 IBA+0.1mg·L-1 NAA，the highest rooting rate is 74.21%.When transplanted，combination of perlite and humus in a ratio of 2：1 as medium，the survival rates could reach 82.93%.

Key words：Hibiscus syriacus；Young stem segment；Tissue culture；Fast propagation

1 引言

木槿（Hibiscus syriacus），別名朝開暮落花，是錦葵科（Malvaceae）木槿屬的落葉灌木，株高3～6m。木槿原產(chǎn)我國(guó)中部地區(qū)和印度，是一種亞熱帶及溫帶的花木，適應(yīng)性強(qiáng)，我國(guó)從東北南部至華南各地均有栽培，性喜溫暖，也頗耐寒，華北和西北大部分地區(qū)都能露地越冬[1-2]。木槿枝葉繁茂，樹姿優(yōu)美，夏季開花，開花時(shí)滿樹花朵花色豐富，嬌艷奪目，花期長(zhǎng)達(dá)5個(gè)月，可以在花籬、綠籬及庭院布置，墻邊、水濱種植也很適宜，是園林綠化中夏、秋季的重要觀花灌木。此外，木槿對(duì)煙塵和二氧化硫、氯氣等有毒氣體的抵抗力很強(qiáng)，對(duì)灰塵、粉塵有很強(qiáng)的吸滯能力，可以在廠礦企業(yè)或大氣污染較嚴(yán)重的地區(qū)栽培，是優(yōu)良的環(huán)保樹種之一[3-4]。木槿的花與嫩葉均可食用，可加工成鮮菜或曬干菜食用，也可涼拌、炒制、做湯等。木槿除欣賞、抗污染及食用外，還有較高的藥用價(jià)值。全株入藥，能清涼利尿[5-6]。長(zhǎng)期以來，木槿的繁殖方法主要有分株、扦插和壓條等[7]，但其產(chǎn)苗量低，繁殖速度慢，市場(chǎng)短缺，價(jià)格高，用組織培養(yǎng)的方法可在短期內(nèi)獲得大批遺傳性穩(wěn)定的優(yōu)良種苗，使生產(chǎn)成本降低，為商品化生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)種苗[8-11]。因此，本研究擬建立木槿高效快繁的再生體系，以期為其組培快繁以及遺傳轉(zhuǎn)化育種開辟一條有效可行的途徑。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料 在連續(xù)晴天3d以上時(shí)，剪取木槿當(dāng)年生的生長(zhǎng)健壯且無病蟲害的未木質(zhì)化幼嫩枝條為試驗(yàn)材料。

2.2 方法

2.2.1 外植體消毒 將剪取的幼嫩枝條去除葉片，剪成2～3cm長(zhǎng)的小段，用濃度適中的洗衣粉浸泡30min，沖洗干凈，再在流動(dòng)水下沖洗2h。在超凈工作臺(tái)上先用75%酒精消毒20s，后用無菌水沖洗4次，再用0.1% HgCl2震蕩消毒8min，最后用無菌水沖洗5次，備用。

2.2.2 接種與芽體啟動(dòng)培養(yǎng) 在超凈工作臺(tái)上，用無菌濾紙吸去已消毒的外植體表面水分，將外植體剪成帶有1個(gè)腋芽的1～2cm左右的小段，接種于已配好的初代培養(yǎng)基上。初代培養(yǎng)以MS為基本培養(yǎng)基，蔗糖3%，瓊脂0.8%，用L9（34）正交試驗(yàn)探索不同濃度的NAA、6-BA、KT對(duì)芽體啟動(dòng)培養(yǎng)的影響。試驗(yàn)共9個(gè)處理，每個(gè)處理接種15瓶，重復(fù)3次。接種后每隔3d觀察一次，并記錄觀察結(jié)果，30d后統(tǒng)計(jì)出芽率和芽體的生長(zhǎng)情況，計(jì)算公式為：出芽率（%）=產(chǎn)生芽體的外植體個(gè)數(shù)/接種外植體個(gè)數(shù)×100。

2.2.3 不定芽增殖培養(yǎng) 將初代培養(yǎng)產(chǎn)生的不定芽剪成2～3cm長(zhǎng)的小段，接種于含有不同濃度的NAA和6-BA的增殖培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)以MS為基本培養(yǎng)基，蔗糖2.5%，瓊脂0.7%。試驗(yàn)共設(shè)8個(gè)處理，每個(gè)處理接種10瓶，重復(fù)4次。定期觀察不定芽的生長(zhǎng)狀況，培養(yǎng)25d后統(tǒng)計(jì)增殖率和增殖系數(shù)，增殖率（%）=產(chǎn)生叢生芽的外植體個(gè)數(shù)/接種時(shí)外植體總數(shù)×100，增殖系數(shù)=統(tǒng)計(jì)時(shí)不定芽總數(shù)/接種時(shí)外植體總數(shù)。

2.2.4 生根誘導(dǎo)培養(yǎng) 剪取在增殖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)健壯的不定芽，接種于生根培養(yǎng)基中。生根培養(yǎng)以1/2MS為基本培養(yǎng)基，蔗糖2%，瓊脂0.6%，添加不同濃度的IBA和NAA。共8個(gè)處理，每個(gè)處理接種10瓶，重復(fù)3次。培養(yǎng)30d后統(tǒng)計(jì)組培苗的生根率和平均生根數(shù)，并觀察其生長(zhǎng)情況，生根率（%）=生根的苗數(shù)/接種時(shí)的總苗數(shù)×100，平均生根數(shù)=不定根的總數(shù)/生根的苗數(shù)。

2.2.5 煉苗移栽 將已生根的組培苗在外界環(huán)境中閉瓶煉苗5d，開瓶煉苗4d，在開瓶煉苗期間，每天定時(shí)噴一次水。移栽前，先用鑷子將組培苗從瓶中取出，洗去附著在基部的培養(yǎng)基，沖洗干凈后移栽到已準(zhǔn)備好的基質(zhì)中，移栽基質(zhì)為珍珠巖、蛭石、腐殖土、沙子按不同比例混合。試驗(yàn)共設(shè)4種不同的混合基質(zhì)，每種基質(zhì)移栽15株，重復(fù)4次，。移栽后立即用0.1%的多菌靈溶液噴灑一次，溫度控制在20～25℃，濕度80%以上，定時(shí)澆水，常規(guī)管理。每3d觀察一次，并記錄觀察結(jié)果，移栽30d后統(tǒng)計(jì)成活率，成活率（%）=成活的苗數(shù)/移栽的總苗數(shù)×100。

2.2.6 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)室溫度為23±2℃，相對(duì)濕度為60%～80%，光照強(qiáng)度為1000～1500lx，光照時(shí)間為12h/d，培養(yǎng)基pH5.8，高壓鍋滅菌溫度為123℃，滅菌時(shí)間為20min。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同濃度的激素配比對(duì)芽體啟動(dòng)培養(yǎng)的影響 將木槿帶腋芽的嫩莖接入含不同濃度配比的培養(yǎng)基中，30d后統(tǒng)計(jì)的結(jié)果如表1所示。由表1可知：從萌芽率來看，第6個(gè)處理萌芽率最高，達(dá)84.05%；從總和（K）和均值（k）分析，0.2mg·L-1 NAA和4.0mg·L-1 6-BA均為誘導(dǎo)不定芽的最佳濃度；由極差R值的分析結(jié)果可知，R6-BA>RNAA>RKT，即6-BA對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響最大，NAA次之，KT的影響最小。因此，木槿不定芽啟動(dòng)培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為處理W6：MS+0.2mg·L-1 NAA+4.0mg·L-1 6-BA。

由方差分析結(jié)果可知，細(xì)胞分裂素6-BA對(duì)木槿不定芽誘導(dǎo)達(dá)顯著水平，F(xiàn)值最大，為50.52，NAA對(duì)不定芽的誘導(dǎo)也達(dá)到了顯著水平（F=31.76），而KT對(duì)芽體啟動(dòng)培養(yǎng)無顯著影響。用LSD多重比較進(jìn)一步分析NAA和6-BA對(duì)木槿初代培養(yǎng)的影響，結(jié)果表明：0.2mg·L-1 NAA與0.1mg·L-1 NAA、0.5mg·L-1 NAA的誘導(dǎo)效果均有顯著性差異，6-BA3個(gè)水平之間的誘導(dǎo)效果差異性顯著，其中4.0mg·L-1 6-BA對(duì)芽體誘導(dǎo)的效果最好，1.0mg·L-1 6-BA誘導(dǎo)效果最差。

3.2 不同激素處理對(duì)不定芽增殖的影響 初代培養(yǎng)產(chǎn)生的不定芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)后，所得結(jié)果如表2所示。由表2可知，第7個(gè)處理的增殖率最高，為82.99%，同時(shí)增殖系數(shù)也最大，為3.79，此時(shí)苗木表示長(zhǎng)勢(shì)好，叢生芽粗壯且出芽多。當(dāng)NAA濃度一定時(shí)，添加不同濃度的6-BA，由分析數(shù)據(jù)可知，隨著6-BA濃度的升高，增殖率和增殖系數(shù)均出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)6-BA濃度為1.5mg·L-1 時(shí)，增殖率和增殖系數(shù)同時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)6-BA濃度不變，NAA濃度變化時(shí)，由上述結(jié)果可知，隨著NAA濃度的升高，增殖率和增殖系數(shù)也隨之升高，當(dāng)NAA為0.1mg·L-1 時(shí)，二者均達(dá)到了最大值。

從增殖率來看，8個(gè)處理之間的培養(yǎng)結(jié)果有顯著性差異，其中處理7的增殖率顯著地高于其它處理，為最好的激素組合，而處理1的增殖率顯著地低于其它處理，為最差的激素組合。就增殖系數(shù)而言，處理3、處理5與其它處理的培養(yǎng)效果差異性顯著，同樣地，處理7為最好的激素組合。

綜上分析，處理7：MS+1.5mg·L-1 6-BA+0.1mg·L-1 NAA為木槿不定芽增殖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基。

3.3 不同激素處理對(duì)生根培養(yǎng)的影響 剪取生長(zhǎng)健壯的叢生苗，接種于生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30d后統(tǒng)計(jì)的結(jié)果如表3所示。從表3可知，8個(gè)不同的處理均誘導(dǎo)出了不定根，其中處理7的生根率最高，達(dá)80.67%，且平均生根數(shù)也最多，為5.08條/株，根系粗壯，側(cè)根也多，組培苗生長(zhǎng)旺盛，葉色濃綠，長(zhǎng)勢(shì)良好。單獨(dú)添加NAA或者IBA，組培苗均能生根，但是單獨(dú)使用IBA比單獨(dú)使用NAA的效果要好，生根率和平均生根數(shù)都相對(duì)較高，組培苗的生長(zhǎng)情況也相對(duì)較好。當(dāng)IBA濃度一定時(shí)，添加不同濃度的NAA，隨著NAA濃度的升高，生根率和平均生根數(shù)均先上升后下降，當(dāng)NAA濃度為0.1mg·L-1時(shí)，生根率和平均生根數(shù)都最高。當(dāng)NAA濃度不變、IBA濃度變化時(shí)，隨著IBA濃度的升高，生根率和平均生根數(shù)均升高，說明IBA對(duì)根的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用。由表3分析結(jié)果可以看出，8個(gè)處理的生根培養(yǎng)結(jié)果均達(dá)到了顯著性水平，其中處理2的生根率顯著性低于其它處理，為最低，根細(xì)弱，側(cè)根少，組培苗的長(zhǎng)勢(shì)也不容樂觀。處理7的平均生根數(shù)顯著性高于其他處理，產(chǎn)生的側(cè)根多，根粗壯，苗的長(zhǎng)勢(shì)也最好。綜上分析，處理7：MS+1.0mg·L-1 IBA+0.1mg·L-1 NAA為木槿組培苗誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基。

3.4 不同基質(zhì)處理對(duì)組培苗移栽成活的影響 將已經(jīng)生根的組培苗經(jīng)過閉瓶煉苗和開瓶煉苗后，移栽到不同的基質(zhì)中，一個(gè)月后統(tǒng)計(jì)的結(jié)果如表4所示。從表4可以看出，4種不同基質(zhì)的移栽成活率差異顯著，其中第2個(gè)處理的成活率顯著高于其他處理，達(dá)82.93%，為最高；第3個(gè)處理的成活率最低，出現(xiàn)了黃化現(xiàn)象，苗的長(zhǎng)勢(shì)最差。在相同條件下，腐殖土比沙子的的成活率高，小苗的生長(zhǎng)情況也相對(duì)較好；當(dāng)腐殖土或沙子不變時(shí)，蛭石的成活率比珍珠巖要高，且苗的長(zhǎng)勢(shì)也比后者好。綜上分析，腐殖土和蛭石的移栽成活率最高，葉色濃綠，苗又高又壯，長(zhǎng)勢(shì)最好，第2個(gè)處理基質(zhì)：腐殖土∶蛭石=2∶1更適合木槿組培苗的生長(zhǎng)。

4 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)研究表明，在木槿不定芽啟動(dòng)培養(yǎng)的過程中，MS+0.2mg·L-1 NAA+4.0mg·L-1 6-BA誘導(dǎo)的出芽率最高，芽體飽滿且粗壯，生長(zhǎng)最好；在不定芽增殖階段，用MS+1.5mg·L-1 6-BA+0.1mg·L-1 NAA培養(yǎng)效果最好，增殖率和增殖系數(shù)均為最高，誘導(dǎo)出的叢生芽最多，芽健壯；MS+1.0mg·L-1 IBA+0.1mg·L-1 NAA更適宜木槿組培苗的生根培養(yǎng)，生根率高達(dá)80.67%，誘導(dǎo)出的側(cè)根最多，根粗實(shí)；生根后的組培苗經(jīng)過煉苗后，移栽到不同的基質(zhì)中，其生長(zhǎng)情況差異也很大，其中腐殖土：蛭石=2∶1的成活率最高，小苗的葉色濃綠，高大且健壯，生長(zhǎng)最好。

一般認(rèn)為，外植體在分化的過程中對(duì)外源激素的需求量取決于其內(nèi)源激素的平衡，當(dāng)外加的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素濃度和比例平衡了外植體內(nèi)源生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的時(shí)候，才能使器官的發(fā)生達(dá)到預(yù)期的目的[12-13]。在初代培養(yǎng)中，NAA和6-BA對(duì)不定芽的誘導(dǎo)均有顯著性影響，高濃度的6-BA更適宜不定芽的發(fā)生，說明細(xì)胞分裂素在芽體啟動(dòng)培養(yǎng)中起到了關(guān)鍵作用，但高濃度的6-BA對(duì)不定芽的增殖具有抑制作用，生長(zhǎng)素NAA能促進(jìn)叢生芽的發(fā)生，說明在增殖培養(yǎng)時(shí)，不定芽對(duì)生長(zhǎng)素的需求量要高于細(xì)胞分裂素。

IBA主要的生理作用是促進(jìn)根源基的形成，誘導(dǎo)不定根的發(fā)生[14]，因此單獨(dú)使用IBA就能誘導(dǎo)組培苗生根，添加了NAA后，不定根粗壯，且苗生長(zhǎng)更好，說明二者配合使用效果更好。組培苗主要以異養(yǎng)為主，莖葉幼嫩，其組織發(fā)育不佳，對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)能力極差，因此，組培苗移栽的關(guān)鍵是要讓其逐漸適應(yīng)，增強(qiáng)抗性，以獲得自養(yǎng)能力而提高移栽成活率。腐殖土疏松，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，更利于植物的生長(zhǎng)，而蛭石透氣性好，并有利于保濕排水，可防止移栽苗根莖部霉?fàn)€，二者混合的基質(zhì)效果更好。移栽后，適度保濕，可防止幼苗失水萎蔫，利于提高移栽成活率。

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（責(zé)編：張宏民）