吹掃捕集-熱脫附-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析不同產(chǎn)地香樟葉精油成分及抑菌活性比較

王 進(jìn)，曹先爽，宋 麗，丁兆青，湯 鋒，岳永德

（國際竹藤中心，國家林業(yè)局竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室，北京 100102）

吹掃捕集-熱脫附-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析不同產(chǎn)地香樟葉精油成分及抑菌活性比較

王 進(jìn)，曹先爽，宋 麗，丁兆青，湯 鋒，岳永德

（國際竹藤中心，國家林業(yè)局竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室，北京 100102）

采用吹掃捕集-熱脫附-氣相色譜-質(zhì)譜法，分析3 個不同產(chǎn)地（廣西、江西和安徽）的香樟葉精油成分差異，比較3 種香樟葉精油對植物病原真菌的抑制活性。結(jié)果表明，從3 種不同產(chǎn)地香樟葉精油中檢出揮發(fā)性成分的數(shù)量依次為：江西香樟22 種，安徽香樟20 種，廣西香樟16 種。3 種香樟葉精油的共有成分主要為萜烯類化合物，相對含量不小于1%的共有成分為月桂烯、β-石竹烯和芳樟醇。芳樟醇的相對含量在3 個產(chǎn)地的精油中差異較大，依次為：廣西產(chǎn)地（76.97%）＞江西產(chǎn)地（32.40%）＞安徽產(chǎn)地（1.39%）。進(jìn)一步利用全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜法，分析廣西產(chǎn)地的香樟葉精油成分，結(jié)合保留指數(shù)，鑒定出44 種化合物。抑菌活性結(jié)果表明，廣西產(chǎn)地的香樟葉精油具有較好抑菌活性，對蘋果炭疽菌、番茄灰霉菌和小麥赤霉菌的半抑制濃度值（處理48 h后）分別為：31.74、35.79 mg/L和38.02 mg/L。香樟葉精油中的芳樟醇成分對其抑菌活性具有重要貢獻(xiàn)。本研究為香樟葉精油在果蔬防腐保鮮劑及相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)提供基礎(chǔ)。

香樟；精油；揮發(fā)性成分；抑菌活性；吹掃捕集-熱脫附-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜（GC×GC-TOFMS）

果蔬等食品容易受到真菌侵染而腐爛變質(zhì)，影響果蔬的品質(zhì)和貨架期。目前，常用農(nóng)藥殺菌劑作為果蔬防腐劑，存在農(nóng)藥殘留超標(biāo)和環(huán)境污染等問題。因此，迫切需要天然果蔬防腐劑的研發(fā)[1-3]。自古以來，在民間藥方及食品防腐中常用芳香植物，植物精油有良好的抑菌效果，并具有安全無毒的優(yōu)點(diǎn)[4]。研究表明，植物精油以涂膜的方式對柑桔果實(shí)進(jìn)行防腐保鮮，能保持果實(shí)良好的品質(zhì)，可用于商業(yè)推廣[5]。

香樟（Cinnamomum camphora L. Presl）屬于樟科，是一種常綠闊葉樹種，廣泛分布在我國南方地區(qū)，該樹種富含植物精油。香樟精油具有多種生物活性，如抑菌[6-7]、抗氧化[8]、殺蟲[9-10]和趨避[11]等活性。香樟精油中含有萜烯類、酮類、醇類等成分[12-14]，但不同產(chǎn)地的香樟精油成分受地理、氣候等因素的影響會存在差異[15]。在食品領(lǐng)域，香樟果提取物添加在食品包裝材料中，起到對食品防腐保鮮的作用[16]。另外，植物精油結(jié)合氣調(diào)包裝，也能達(dá)到較好的抑菌效果[17]。在體外抑菌實(shí)驗中，香樟精油可抑殺空氣中約32.79%的細(xì)菌[18]。這說明植物精油的揮發(fā)性成分起到重要活性作用。因此，香樟精油既有觸殺抑菌活性，又有熏蒸作用。目前，在果蔬保藏過程中抑菌的研究存在主要問題是：1）單一成分的殺菌劑易產(chǎn)生抗性菌株，導(dǎo)致藥物殘留高，影響食品安全性；2）植物精油作為替代化學(xué)藥劑的果蔬防腐劑，能夠保持果實(shí)品質(zhì)，食用安全性高，但精油的有效組分會受植物產(chǎn)地等因素影響，存在不確定性，抑菌機(jī)理不完全清楚。前期研究發(fā)現(xiàn)，香樟精油具有抑菌活性，其化學(xué)成分是抑菌活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，但對不同產(chǎn)地香樟精油化學(xué)成分的比較分析及抑菌活性評價，鮮見報道。因此，本實(shí)驗利用吹掃捕集（purge and trap，P&T）法對香樟葉精油的揮發(fā)性成分進(jìn)行富集，用熱脫附結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（thermal desorption-gas chromatographymass spectrometry，TD-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分析，比較了3 個不同產(chǎn)地的香樟葉精油的揮發(fā)性成分；采用菌絲生長速率法，評價不同產(chǎn)地的香樟葉精油對3 種常見的果蔬植物病原真菌的抑制活性；對抑制菌絲生長能力較強(qiáng)的廣西香樟葉精油成分，進(jìn)一步利用全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜（comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC×GCTOFMS）技術(shù)進(jìn)行分析鑒定，通過不同儀器手段對香樟精油成分比較分析，旨在全面分析香樟精油的化學(xué)成分特征，為香樟葉精油在果蔬防腐劑領(lǐng)域的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香樟葉從廣西南寧、江西南昌和安徽合肥采集，將采回的香樟葉放在室內(nèi)自然風(fēng)干，粉碎后于－20 ℃冰柜中備用。供試菌株蘋果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）和小麥赤霉菌（Fusarium graminearum）均由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)教研室提供。

芳樟醇（純度97%） 美國Sigma-Aldrich公司；咪鮮胺（純度98.5%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；正構(gòu)烷烴混標(biāo)（C7～C30） 美國Supelco公司；正己烷（色譜純）美國Fisher公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Turbo Matrix 650 ATD全自動熱脫附儀 美國PE公司；Tenax TA吸附管 美國Camsco公司；P&T瓶自制；6890N/5973i GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司；Pegasus 4D GC×GC-TOFMS聯(lián)用儀 美國LECO公司；CL-3型恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；CHB-1抗生素效價測量儀 北京潮聲公司；BP221S電子天平 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 香樟葉精油的制備

準(zhǔn)確稱取50.0 g粉碎后的香樟葉樣品，裝入揮發(fā)油提取器（規(guī)格1 L）中，加入500 mL超純水，加熱至微沸騰，提取6 h，獲得的精油經(jīng)無水硫酸鈉干燥，實(shí)驗重復(fù)3 次，獲得精油于－20 ℃冰柜中備用[10]。按公式（1）計算精油得率：

式中：M1為精油的凈質(zhì)量/g；M2為植物干樣的總質(zhì)量/g。

1.3.2 香樟葉精油成分的P&T-TD處理

取0.1 mL的香樟葉精油置于吹掃捕集瓶中，在室溫條件下，一端以100 mL/min的流速通入高純氮?dú)猓?9.999%），另一端接上老化后的吸附管（含Tenax TA吸附劑），采樣時間5 min，取下Tenax TA吸附管，立即在兩端蓋上銅制防護(hù)帽，于干燥器內(nèi)密封保存，待測。

TD條件：吸附管干吹1 min（為降低解析過程中吸附劑和樣品被氧化的風(fēng)險）；脫附溫度（一級熱脫附溫度）260 ℃，脫附10 min；脫附流量25 mL/min；一級熱脫附時冷阱溫度為－30 ℃，一級至二級熱脫附過程中，冷阱以40 ℃/s升溫至300 ℃，進(jìn)樣時間0.5 min；進(jìn)口分流90 mL/min；載氣（He）流速1 mL/min；閥溫度250 ℃；傳輸線溫度255 ℃；循環(huán)時間70 min[19-20]。

1.3.3 不同產(chǎn)地香樟葉精油的抑菌活性

采用菌絲生長速率法[21]，選擇常見的果蔬、農(nóng)作物致病菌蘋果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、小麥赤霉菌（Fusarium graminearum）3 種植物病原真菌為供試菌種。稱取1.3.1節(jié)制備的香樟葉精油適量，先用1 mL的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解后，再用無菌水定容至10 mL，最終將香樟葉精油配成質(zhì)量濃度為250、500、700、850 mg/L和1 000 mg/L。未加精油的無菌水作為對照，以農(nóng)藥咪鮮胺為陽性對照，每個處理重復(fù)3 次，用打孔器把供試菌種的培養(yǎng)基制成菌餅（直徑7 mm），接種于含藥培養(yǎng)基平板的中心（菌絲面朝下），放置于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h和60 h，用十字交叉法測量真菌菌落直徑（mm）。

1.3.4 GC-MS分析條件

色譜柱：J&W D B-5 M S石英毛細(xì)柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：50 ℃保持1 min，以3 ℃/min升至180 ℃。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；全掃描模式采集數(shù)據(jù)，質(zhì)量掃描范圍m/z 25～550。

1.3.5 GC×GC-TOFMS分析條件

色譜柱：一維柱：Rxi-5 Sil MS石英毛細(xì)柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；二維柱：Rxi-17 Sil MS石英毛細(xì)柱（2 m×0.18 mm，0.18 μm）；一維柱升溫程序：50 ℃保持0.2 min，以8.0 ℃/min速率升至280 ℃；二維柱爐溫補(bǔ)償5 ℃；調(diào)制周期4.0 s，熱脈沖0.8 s；進(jìn)樣口及傳輸線溫度為240 ℃和280 ℃；載氣流速：高純氦氣1.0 mL/min；分流進(jìn)樣模式，分流比50∶1；進(jìn)樣量1 μL。

MS條件：檢測器電壓1 420 V；離子源溫度250 ℃；采集頻率100 spec/s；質(zhì)量掃描范圍m/z 33～550[10]。

1.3.6 真菌生長抑制率

抑菌活性的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）和95%置信區(qū)間是用統(tǒng)計分析軟件SPSS的概率回歸分析計算[22]。按公式（2）計算菌絲生長抑制率：

式中：dc為空白對照的菌落直徑/mm；d0為供試菌餅的直徑/mm；dt為處理樣品抑菌后菌落的直徑/mm。

2 結(jié)果與分析

2.1 P&T-TD-GC-MS分析不同產(chǎn)地香樟葉精油揮發(fā)性成分

從廣西、江西和安徽3 個產(chǎn)地采集的香樟葉，經(jīng)水蒸氣蒸餾法制備精油，其精油得率分別為（2.3±0.4）%、（0.9±0.1）%和（0.6±0.2）%。所得精油的顏色外觀均為淺黃色，香味濃郁。以P&T-TD-GC-MS分析3 種香樟葉精油的揮發(fā)性成分，用NIST 02標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫檢索（匹配度≥80%），以峰面積歸一化法計算精油成分的相對含量，結(jié)果見表1。

表1 P&T-TD-GC-MS分析不同產(chǎn)地樟樹葉精油的揮發(fā)性成分Table1 Volatile compounds identified in the essential oils of C. camphora from different geographic origins by P&T-TD-GC-MS

由表1可知，從香樟葉精油中共鑒定出揮發(fā)性成分31 種，包括萜烯類、醇類、酮 類和醛類等。其中，從江西產(chǎn)地的香樟葉精油中鑒定出22 種，檢出峰的面積占總峰面積的（ 面積歸一化法）96.14%，從安徽產(chǎn)地的香樟葉精油中鑒定出20 種，占總峰面積的78.66%，從廣西產(chǎn)地的香樟葉精油中鑒定出16 種，占總峰面積的92.77%，說明檢出的化合物是香樟葉精油的主要揮發(fā)性成分。

不同產(chǎn)地的3 種香樟葉精油，其揮發(fā)性成分的共有成分有10 種，分別為烯類7 種（莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯、α-水芹烯、檸檬烯、β-羅勒烯和β-石竹烯）、醛類1 種（青葉醛）、烷烴類1 種（對傘花烴）和醇類1 種（芳樟醇）。共有成分主要為烯類化合物，其中相對含量在1%以上的成分為β-月桂烯、β-石竹烯和芳樟醇。芳樟醇的相對含量在3 個產(chǎn)地的精油中差異較大，依次為廣西產(chǎn)地（76.97%）＞江西產(chǎn)地（32.40%）＞安徽產(chǎn)地（1.39%）。

2.2 GC×GC-TOFMS分析香樟葉精油成分

根據(jù)預(yù)實(shí)驗的結(jié)果，廣西產(chǎn)地的香樟葉精油表現(xiàn)出較好抑菌活性，為了進(jìn)一步分析其精油的化學(xué)成分，把廣西香樟葉精油用正己烷稀釋后，直接進(jìn)GC×GCTOFMS儀進(jìn)行分析，通過NIST 2011譜庫檢索結(jié)合保留指數(shù)（retention indices，RI）進(jìn)行定性，保留指數(shù)根據(jù)正構(gòu)系列烷烴C7～C30在相同色譜條件下的保留時間計算。檢出化合物與譜庫的相似度大于80%的予以報道，見表2。

表2 GC×GC-TOFMS分析廣西樟樹葉精油成分結(jié)果Table2 Chemical compounds identified in the essential oil of C. camphora from Guangxi province by GC GC-TOFMS

續(xù)表2

從表2可知，GC×GC-TOFMS檢出化合物的數(shù)量為44 種，明顯多于P&T-TD-GC-MS的檢出數(shù)量（16 種），可能由于全二維色譜提供了良好色譜分離度，一些化合物在一維色譜難以分開，在二維色譜中能夠較好分離，并結(jié)合飛行時間質(zhì)譜進(jìn)行定性，鑒定結(jié)果的可靠度更高。

把GC×GC-TOFMS和P&T-TD-GC-MS兩種方法檢出的香樟葉精油成分，按化合物類別進(jìn)行歸類比較，每種類型包括化合物的個數(shù)、相對含量和共有成分，見表3。

表3 GC×GC-TOFMS和P&T-TD-GC-MS分析香樟葉精油成分種類的比較Table3 Comparison of volatile compounds of the essential oil of C. camphora using GC GC-TOFMS and P&T-TD-GC-MS

由表3可看出，2 種分析技術(shù)共鑒定出60 種化學(xué)成分，其中，共有成分為10 種，主要成分均為醇類和萜烯類，其中芳樟醇的相對含量均大于70%。醇類的相對含量最高，萜烯類化合物的數(shù)量最多。利用GC×GC-TOFMS和P&T-TD-GC-MS兩種不同的分析技術(shù)，對廣西香樟葉精油成分進(jìn)行深入分析，獲得更為全面的香樟精油成分信息，為其應(yīng)用研究提供參考。

2.3 不同產(chǎn)地香樟葉精油抑菌活性比較

表4 不同產(chǎn)地香樟精油和咪鮮胺對3 種真菌的半抑制濃度值及置信區(qū)間Table4 Antifungal activities of prochloraz and different C. camphora oils against three pathogenic fungi

以3 個產(chǎn)地的香樟葉精油為材料，采用菌絲生長速率法，進(jìn)行抑菌活性比較，陽性對照為化學(xué)農(nóng)藥咪鮮胺，抑菌活性結(jié)果，見表4。3 種不同產(chǎn)地香樟葉精油對供試病原真菌均具有抑菌效果，以IC50值為指標(biāo)，廣西香樟精油能有效抑制供試植物病原真菌的菌絲生長，對蘋果炭疽菌、番茄灰霉菌和小麥赤霉菌的IC50值（處理48 h后）分別為31.74、35.79和38.02 mg/L。不同產(chǎn)地的3 種香樟葉精油對蘋果炭疽菌和番茄灰霉菌的抑菌活性大小依次為廣西＞安徽＞江西。

據(jù)報道，精油中萜烯類化合物，如樟腦、檸檬烯、蒎烯等具有抑制真菌的作用[23]。體外實(shí)驗證明，芳樟醇、β-石竹烯有顯著的抑菌活性[24-25]。由表4可知，芳樟醇表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，對蘋果炭疽菌、番茄灰霉菌和小麥赤霉菌的IC50值（處理48 h后）分別為69.30、34.75 mg/L和26.21 mg/L，而廣西香樟葉精油中含有豐富的芳樟醇，因此，芳樟醇可能是香樟葉精油抑菌活性的主要成分。

3 討論與結(jié)論

造成果蔬腐爛變質(zhì)的真菌病害主要有青霉病、綠霉病、黑腐病、蒂腐病、炭疽病和酸腐病等[26]。本研究選擇了3 種常見的植物病原真菌作為供試靶標(biāo)，但抑菌的活性與文獻(xiàn)報道存在差異。如魏琴等[27]研究油樟精油對幾種植物病源真菌的抗菌作用，其中對赤霉菌和炭疽菌的IC50值分別為1.29 μL/mL和1.50 μL/mL。存在抑菌活性差異的主要原因可能是樣品來源以及菌種等因素。

不同產(chǎn)地樟樹葉精油的化學(xué)成分的相對含量存在差異，如，Zhu Fengjun等[28]用靜態(tài)頂空分析了上海樟樹葉的揮發(fā)性成分，檢出化學(xué)成分59 種，其中反式橙花叔醇的相對含量最高占19.49%，芳樟醇占3.84%。任露潔等[29]利用TD-GC-MS聯(lián)用技術(shù)，對香樟林內(nèi)的揮發(fā)物進(jìn)行分析，結(jié)果表明，醇類、酮類、烯烴以及烷烴等化合物的相對含量較高，是香樟林內(nèi)的主要有機(jī)揮發(fā)物，與本實(shí)驗研究的香樟葉精油成分的結(jié)果類似，也說明了香樟林中的揮發(fā)物成分主要是香樟葉精油成分。同時，香樟林空氣中的微生物也受到明顯的抑制作用[30]。起到抑菌作用的精油成分，主要是易揮發(fā)的成分，精油的脂溶性能使其更容易透過細(xì)胞質(zhì)膜，精油中的揮發(fā)性成分能夠使細(xì)胞質(zhì)凝結(jié)和菌絲裂解凋亡，從而產(chǎn)生抑菌作用[23]。

據(jù)報道，把芳樟醇化合物添加到肉桂、丁香等精油中，能夠?qū)偷囊志钚云鸬絽f(xié)同增效作用[25]。本研究表明，廣西香樟葉精油中富含芳樟醇，但以蘋果炭疽菌為例，芳樟醇單體化合物的抑菌活性（IC50=69.30 mg/L）比廣西香樟葉精油的抑菌活性（IC50=31.74 mg/L）低，可能由于廣西香樟葉精油中存在其他抑菌能力更強(qiáng)的成分，或不同成分間產(chǎn)生了協(xié)同增效作用，因此，將廣西香樟葉精油與其他植物精油復(fù)合，可能會有更好的抑菌效果。下一步有待于用香樟精油中主要成分的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行抑菌和定量分析，確定出主要抑菌成分及其協(xié)同增效關(guān)系。

本研究對3 個不同產(chǎn)地香樟葉精油成分及其抑制真菌活性進(jìn)行比較，研究結(jié)果說明不同產(chǎn)地香樟葉精油的主要成分相似，但相對含量存在差異，這些主要 成分是香樟葉精油抑菌活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，研究發(fā)現(xiàn)廣西香樟葉精油對供試真菌的抑制活性較好，芳樟醇是香樟葉精油的主要活性成 分之一，因此，將廣西香樟葉精油應(yīng)用在果蔬防腐劑領(lǐng)域，有望取得更好的抑菌效果和應(yīng)用前景。

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Comparative Chemical Composition and Antifungal Activity of the Essential Oils of Cinnamomum camphora L. Presl Leaves from Three Geographic Origins

The essential oils of Cinnamomum camphora L. Presl from three different origins obtained by hydrodistillation were analyzed by purge and trap thermal desorption-gas chromatography-mass spectrometry (P&T-TD-GC-MS), and their in hibitory activity against plant pathogenic fungi was comparatively assessed. A total of 22, 20 and16 volatile components were detected in the essential oils of C. camphora grown in Jiangxi, Anhui and Guangxi provinces, respe ctively. The major components identified with a relative content of more than 1% were β-myrcene, β-caryophyllene and linalool. Furthermore, the essential oil of C. camphora from Guangxi province was also analyzed by comprehensive two-dimensional gas chromatography-timeof-flight mass spectrometry (GC×GC-TOFMS). A total of 44 components were identified in the essential oil of C. camphora from Guangxi province, dominated by alcohols and terpenes. In the antifungal assay, the leaf oil from Guangxi province showed strong antifungal activities against Colletotrichum gloeosporioides, Botrytis cinerea, and Fusarium graminearum with half maxim al inhibitory concentration (IC50) values of 31.74, 35.79 and 38.02 mg/L (after 48 h of treatment), respectively. Linalool was found to be a significant contributor to the antifungal activity. Overall, the essential oil of C. camphora might have the potential to be developed into a natural antimicrobial agent that can be used in the preservation of fruits and vegetables.

Cinnamomum camphora L. Presl; essential oil; volatile components; antifungal activity; purge and trap thermal desorption-gas chromatography-mass spectrometry (P&T-TD-GC-MS); comprehensive two-dimensional gas chromatographytime-of-flight mass spectrometry (GC×GC-TOFMS)

10.7506/spkx1002-6630-201712 020

TS201.6；S789.4

A

1002-6630（2017）12-0131-06

2016-09-13

國家林業(yè)局948項目（2014-4-33）；國際竹藤中心基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項（1632014009）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD23B0304）

王進(jìn)（1977—），男，副研究員，博士，研究方向為植物化學(xué)。E-mail：wangjin@icbr.ac.cn王進(jìn), 曹先爽, 宋麗, 等. 吹掃捕集-熱脫附-氣 相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析不同產(chǎn)地香樟葉精油成分及抑菌活性比較[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(12)： 131-136.

10.7506/spkx1002-6630-201712020. http：//www.spkx.net.cn

WANG Jin, CAO Xianshuang, SONG Li, et al. Comparative chemical composition and antifungal activity of the essential oils of Cinnamomum camphora L. Presl leaves from three geographic origins[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 131-136. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712020. http：//www.spkx.net.cn

WANG Jin, CAO Xianshuang, SONG Li, DING Zhaoqing, TANG Feng, YUE Yongde

(SFA Key Laboratory of Bamboo and Rattan Science and Technology, International Centre for Bamboo and Rattan, Beijing 100102, China)