巴氏葡萄球菌TS-82類胡蘿卜素裂解酶的分離純化及其酶學(xué)特性

朱明明，樊明濤，何鴻舉,*，馬漢軍

（1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

巴氏葡萄球菌TS-82類胡蘿卜素裂解酶的分離純化及其酶學(xué)特性

朱明明1，樊明濤2，何鴻舉1,*，馬漢軍1

（1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

巴氏葡萄球菌TS-82類胡蘿卜素裂解酶經(jīng)強(qiáng)陰離子柱、高效制備液相色譜和多肽分子篩純化得到液相級純酶（95.6%）。該酶比活力為125 U/g，純化倍數(shù)為446，回收率為2.39%。純化后的類胡蘿卜素裂解酶經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定，得其分子質(zhì)量為655.093 D。關(guān)于酶學(xué)特性，研究發(fā)現(xiàn)該酶對C40類胡蘿卜素底物的最適溫度為60 ℃，而作用于β-阿樸-8’-胡蘿卜醛的最適溫度是50 ℃，該酶的穩(wěn)定溫度為50 ℃以下；該酶對所測定底物的最適pH值為3.0；該酶與5 種底物親和力排列為：玉米黃質(zhì)＞蝦青素＞β-胡蘿卜素＞角黃質(zhì)＞β-阿樸-8’-胡蘿卜醛；Al3+和Fe3+是該酶的強(qiáng)效催化劑，F(xiàn)e2+是該酶的強(qiáng)效抑制劑；H2O2在低濃度范圍內(nèi)（0～16 mmol/L）可促進(jìn)酶活性；低體積分?jǐn)?shù)乙醇（4%～16%）的添加對酶活性無明顯抑制作用。結(jié)果表明該酶具有很好的耐酸性和熱穩(wěn)定性，能夠適應(yīng)果酒環(huán)境，為其工業(yè)化應(yīng)用提供依據(jù)。

巴氏葡萄球菌TS-82；類胡蘿卜素裂解酶；類胡蘿卜素；分離純化；酶學(xué)特性

類胡蘿卜素是一類在自然界廣泛存在的呈紅色、黃色或橘黃色的色素。眾所周知，類胡蘿卜素是一類重要的前體物質(zhì)，可生成多種在生物體中具有重要功能的衍生物，包括類VA、植物激素、色素及芳香類化合物[1]。而類胡蘿卜素裂解酶是一類對類胡蘿卜素有催化作用，可將底物轉(zhuǎn)為目標(biāo)產(chǎn)物的生物酶類，廣泛存在于動植物及微生物中[2-4]，而目前有關(guān)葡萄球菌及其所產(chǎn)類胡蘿卜素裂解酶的研究甚少。課題組前期研究首次發(fā)現(xiàn)巴氏葡萄球菌TS-82可高效降解類胡蘿卜素[5-7]，為了解其所產(chǎn)類胡蘿卜素裂解酶的酶學(xué)特性、作用機(jī)理及應(yīng)用方式，對酶進(jìn)行分離純化是極其必要的環(huán)節(jié)。

一直以來，國內(nèi)外主要致力于類胡蘿卜素裂解酶的克隆表達(dá)[8-9]，關(guān)于天然類胡蘿卜素裂解酶的分離純化關(guān)注較少。近幾年雖也有研究者直接從微生物中提取純化類胡蘿卜素裂解酶，但相關(guān)報(bào)道不多[10-11]。其中Scheibner等[10]利用Q-Sepharose陰離子交換柱和Superdex 200 HR分子篩柱純化β-胡蘿卜素裂解酶，獲得了50%的得率；而Lanfermann等[11]則先通過Phenyl Sepharose疏水層析，接著利用Q-Sepharose陰離子交換層析，最后選用Superdex 75分子篩層析對其進(jìn)行純化，獲得了9%的得率和261 倍的純化倍數(shù)。由此可見，不同微生物源的類胡蘿卜素裂解酶的分離純化并不完全相同，故對巴氏葡萄球菌TS-82類胡蘿卜素裂解酶進(jìn)行分離純化的條件，還需進(jìn)行摸索篩選。

另外，特定的類胡蘿卜素裂解酶可專一地催化類胡蘿卜素的特定雙鍵[12]斷裂。不同來源的類胡蘿卜素裂解酶的許多生化性質(zhì)都存在較大差異，如最適溫度、pH值、熱穩(wěn)定性、耐酸性、底物特異性等[1]。基于前期對初步純化的類胡蘿卜素裂解酶酶學(xué)性質(zhì)研究[13]，本實(shí)驗(yàn)以巴氏葡萄球菌TS-82為材料，采用陰離子交換層析、制備型高效液相色譜（preparative high performance liquid chromatography，PHPLC）和多肽分子篩層析對所產(chǎn)類胡蘿卜素裂解酶進(jìn)行分離純化，采用液相色譜-電離質(zhì)譜（liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry，LC-ESI/MS）確定其分子質(zhì)量，并利用HPLC法研究類胡蘿卜素裂解酶作用于不同底物（β-阿樸-8’-類胡蘿卜醛、β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)、角黃質(zhì)、蝦青素）的酶學(xué)性質(zhì)，探究其熱穩(wěn)定性及耐酸性等，為下一步研究其作用機(jī)理及應(yīng)用方式提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

巴氏葡萄球菌菌株TS-82（GenBank Accession No. KP171185）為西北農(nóng)林科技大學(xué)食品發(fā)酵與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 試劑

β-阿樸-8’-胡蘿卜醛（純度98%）、β-胡蘿卜素（98%）、玉米黃質(zhì)（95%）、角黃質(zhì)（95%）、蝦青素（95%） 美國Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇（色譜級） 美國Tedia公司；牛血清白蛋白 美國Amresco公司；甲基叔丁基醚 上海Aladdin公司；色譜級水 杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；正己烷、丙酮 隴南化學(xué)試劑公司；其他分析純試劑購自天津科密歐公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AKTA Purifier 100蛋白純化儀 瑞典Amersham Biosciences公司；CoolSafe冷凍干燥機(jī) 丹麥Labogene儀器公司；LC-20A HPLC儀 日本島津公司；高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；HH恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 類胡蘿卜素裂解酶粗酶液的制備

參照朱明明等[13]的方法制備粗酶液，冷凍干燥濃縮后保存于4 ℃條件下待用。

1.3.2 蛋白質(zhì)量濃度的測定

以牛血清白蛋白為標(biāo)品，按照Bradford[14]的方法測定蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.3 酶活力測定

實(shí)驗(yàn)中類胡蘿卜素底物的濃度為160 μmol/L。由于類胡蘿卜素對光和熱均特別敏感，所有儲備液需現(xiàn)配現(xiàn)用。底物儲備液參照蝦青素儲備液的配制方法[15]，置于4 ℃條件下，待用。以β-胡蘿卜素為底物測定純化過程中的酶活力，以所有類胡蘿卜素為底物測定其酶學(xué)特性的酶活力。取450 μL標(biāo)品儲備液（160 μmol/L），添加1 mL酶液，用pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液（20 mmol/L）定容至2 mL。以不加酶液的溶液作對照。類胡蘿卜素裂解酶的活性可通過比較酶解反應(yīng)液和對照在37 ℃條件下反應(yīng)30 min后460 nm波長處底物峰面積減少和顏色變化而得到。酶活力單位（U）定義為：在上述條件下，每分鐘降解1 μmol類胡蘿卜素所需的酶量，酶含量用每升反應(yīng)液的酶活力單位表示，即U/L。

1.3.4 類胡蘿卜素裂解酶的分離純化

陰離子交換柱層析條件：Mono Q 10/100 GL層析柱（10 mm×100 mm，10 μm）；A液：20 mmol/L pH 5.0醋酸-醋酸鈉緩沖液；B液：A液+1.0 mol/L NaCl溶液。洗脫流速1 mL/min；洗脫程序：0～30 min，A液；30～70 min，0～50% B液；70～80 min，50% B液；80～110 min，100% B液，收集280 nm波長處的吸收峰。檢測各個洗脫峰的類胡蘿卜素裂解酶活力，收集合并有酶活力的峰，冷凍干燥濃縮，測定酶液體積、質(zhì)量濃度及酶活力，保存?zhèn)溆谩?/p>

PHPLC條件：半制備色譜柱C18（250 mm×10 mm，10 μm）；流動相A：20 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液，pH 5.0；流動相B：乙腈；洗脫流速5 mL/min；柱溫30 ℃；洗脫程序：0～20 min，12.5%～50% B；20～25 min，50%～60% B；25～35 min，60%～100% B；35～40 min，100%～12.5% B；收集280 nm波長處的吸收峰；檢測各個洗脫峰的活性，收集合并有酶活力的峰，冷凍干燥濃縮，測定酶液體積、質(zhì)量濃度及酶活力，保存?zhèn)溆谩?/p>

多肽分子篩層析條件：Superdex Peptide 10/300 GL層析柱（10 mm×300～310 mm，13 μm）洗脫流速0.5 mL/min；洗脫時間70 min；收集280 nm波長處的吸收峰。檢測各個洗脫峰的活性，收集合并有酶活力的峰，冷凍干燥，測定酶液體積、濃度及酶活力，濃縮液二次上樣于多肽分子篩柱，條件同第一次，將二次上樣后得到的活性成分進(jìn)行混合并冷凍干燥濃縮，測定其體積、蛋白質(zhì)量濃度及酶活力，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 反相HPLC鑒定純度

Z O R B A X E c l i p s e P l u s C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A：20 mmol/L pH 5.0醋酸-醋酸鈉緩沖液，流動相B：乙腈；洗脫流速1 mL/min；柱溫30 ℃；洗脫程序：0～10 min，100% B，檢測類胡蘿卜素裂解酶的純度。將制備的純酶組分冷凍干燥成酶粉，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 分子質(zhì)量的測定

使用HPLC-MS聯(lián)用儀對經(jīng) 上述柱層析分離純化得到的酶進(jìn)行相對分子質(zhì)量的測定。在陽離子操作模式下測定m/z 500～5 000之間的數(shù)據(jù)，所用源電壓為4.50 kV。

1.3.7 純酶的酶學(xué)特性測定

1.3.7.1 最適反應(yīng)溫度及其熱穩(wěn)定性的測定

由于最適溫度并不是絕對常數(shù)，會受到底物、pH值等因素的影響[16]，所以本實(shí)驗(yàn)選用β-阿樸-8’-胡蘿卜醛、β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)、角黃質(zhì)和蝦青素5種底物研究溫度對類胡蘿卜素裂解酶的影響。取450 μL的類胡蘿卜素標(biāo)品儲備液，添加4 μg酶粉，用pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液定容至2 mL，以不加酶粉的溶液作為對照。將酶解反應(yīng)液與對照分別放入30～70 ℃的水浴鍋反應(yīng)30 min，根據(jù)朱明明等[15]的方法終止反應(yīng)并按照HPLC條件測定底物含量的變化，計(jì)算酶活力，得到酶活力與溫度之間的線性關(guān)系，由此確定酶的最適反應(yīng)溫度。將實(shí)驗(yàn)中得到的最高酶活力定義為100%，其余條件下測得的酶活力換算成相對酶活力。

將4 μg酶粉溶于1 mL的pH 5.0的醋 酸-醋酸鈉緩沖液中，以不加酶粉的緩沖液為對照，將其分別放在30～70 ℃的水浴鍋中處理1 h，選取450 μL的β-胡蘿卜素標(biāo)品儲備液用于驗(yàn)證酶活力損失，最后定容至2 mL，測定酶活力，以未處理酶液的酶活力為100%。

1.3.7.2 最適pH值及其耐酸性的測定

最適pH值會隨著很多因素的變化而改變[16-17]，故選用上述5 種底物研究pH值對類胡蘿卜素裂解酶的影響。取450 μL類胡蘿卜素標(biāo)品儲備液，添加4 μg酶粉，用不同pH值的緩沖液（20 mmol/L，pH 2.0～3.5甘氨酸-HCl溶液、pH 4.0～5.5醋酸-醋酸鈉溶液、pH 6.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉溶液）定容至2 mL。以不加酶粉、只加類胡蘿卜素標(biāo)品儲備液的各相應(yīng)pH值的溶液為對照，計(jì)算酶活力。將實(shí)驗(yàn)中得到的最高酶活力定義為100%，其他條件下測得的酶活力換算成相對酶活力。

將24 μg酶粉溶于1 mL各不同pH值緩沖液中，以不加酶粉的緩沖液為對照。將各pH值緩沖液處理的酶液放置4 ℃冰箱處理一周后調(diào)pH值為5.0，隨后選取450 μL β-胡蘿卜素標(biāo)品儲備液用于驗(yàn)證酶活力損失，最后定容至2 mL，研究比較不同pH值緩沖液處理的殘余酶活力。以處理前酶液的酶活力為100%。

1.3.7.3 酶動力學(xué)常數(shù)的測定

用pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液配制6～36 μmol/L之間6 種不同的底物濃度2 mL，加入4 μg酶粉，在37 ℃條件下反應(yīng)10 min后測定酶活力。依據(jù)測定結(jié)果，采用Lineweaver-Burk法作圖，計(jì)算米氏常數(shù)（Km）及最大反應(yīng)速率（vmax）。

1.3.7.4 活化能（Ea）的計(jì)算

類胡蘿卜素裂解酶的Ea通過阿倫尼烏斯方程得到，本實(shí)驗(yàn)中以β-胡蘿卜素為底物，選擇25～50 ℃之間測定的數(shù)據(jù)來計(jì)算活化能。

1.3.7.5 金屬離子對酶活力的影響

以β-胡蘿卜素為酶反應(yīng)底物，選用11 種不同的金屬離子（Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+、Mn2+、Hg2+、Cu2+、Al3+、Fe3+），向1.3.7.1節(jié)反應(yīng)體系中加入不同濃度（1、5、10、50、100 mmol/L）的金屬離子，研究不同金屬離子對酶活力的影響。以未加金屬離子的酶液的活力作對照，計(jì)算剩余酶活力。

1.3.7.6 雙氧水對酶活力的影響

以β-胡蘿卜素為酶反應(yīng)底物，向1.3.7.1節(jié)反應(yīng)體系中分別加入不同濃度的H2O2（4、8、12、16、20 μmol/L），測定酶活力變化。

1.3.7.7 乙醇對酶活力的影響

以β-胡蘿卜素為酶反應(yīng)底物，向1.3.7.1節(jié)反應(yīng)體系中分別加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液（4%、8%、12%和16%），測定酶活力變化。

以上所有反應(yīng)均重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 陰離子交換層析純化結(jié)果

圖1 類胡蘿卜素裂解酶的Mono Q強(qiáng)陰離子交換層析圖譜Fig.1 Elution profile of carotenoid cleavage enzyme by Mono Q 10/100 GL

圖2 Mono Q強(qiáng)陰離子交換層析洗脫得到的各組分的酶活力Fig.2 Enzymatic activities of each of the elution fractions obtained by Mono Q 10/100 GL

如圖1所示，所得樣品中主要有8 個蛋白洗脫峰，對其酶活力進(jìn)行測定，結(jié)果如圖2所示，具有催化活性的組分主要集中在峰M6，其活性顯著高于其他組分，表明類胡蘿卜素裂解酶通過陰離子交互作用基本完全結(jié)合在Q柱上。當(dāng)NaCl濃度在0.25～0.30 mol/L時，目標(biāo)組分M6被洗脫下來。將組分M6進(jìn)行收集合并，測得其純化倍數(shù)為

5.5 倍。將收集的酶液進(jìn)行冷凍干燥濃縮后進(jìn)行高效制備液相分離純化。

2.2 PHPLC純化結(jié)果

圖3 類胡蘿卜素裂解酶的PHPLC圖譜Fig.3 Elution profile of carotenoid cleavage enzyme by PHPLC

將經(jīng)過陰離子交換層析后得到的活性組分上樣于PHPLC，進(jìn)一步純化，結(jié)果如圖3所示?；钚越M分M6經(jīng)過半制備柱C18進(jìn)一步分離為2 個組分。由圖4可知，P1組分具有較高的催化活性，而P2組分的活性很低。將活性組分P1收集，測得其蛋白質(zhì)量濃度為207 mg/L，與離子交換后的酶液相比純化了15 倍。

圖4 PHPLC洗脫得到的各組分的酶活力Fig.4 Enzymatic activities of each of the elution fractions obtained by PHPLC

2.3 多肽分子篩層析純化結(jié)果

圖5 類胡蘿卜素裂解酶的第1次Superdex Peptide多肽分子篩層析圖譜Fig.5 Elution profile of carotenoid cleavage enzyme by the first Superdex Peptide 10/300 GL chromatography

分子篩層析是根據(jù)分子質(zhì)量大小對活性成分進(jìn)行分離純化的技術(shù)手段，Superdex Peptide 10/300 GL多肽分子篩可以高分辨率分離肽和分子質(zhì)量在100～7 000的生物小分子。本實(shí)驗(yàn)采用Superdex Peptide 10/300 GL對活性組分P1進(jìn)行3級純化，結(jié)果如圖5所示。所得樣品中主要有4 個280 nm波長處的吸收峰。

圖6 第1次Superdex Peptide多肽分子篩層析洗脫得到的各組分的酶活力Fig.6 Enzymatic activities of each of the elution fractions obtained from the first Superdex Peptide 10/300 GL chromatography

圖7 類胡蘿卜素裂解酶的第2次Superdex Peptide多肽分子篩層析圖譜Fig.7 Elution profile of carotenoid cleavage enzyme by the second Superdex Peptide 10/300 GL chromatography

對其酶活力進(jìn)行測定，結(jié)果如圖6所示，其中S3的活性顯著高于其他峰，收集組分S3并濃縮后二次上樣于多肽分子篩，結(jié)果如圖7所示。

圖8 第2次Superdex Peptide多肽分子篩層析洗脫得到的各組分的酶活力Fig.8 Enzymatic activities of each of the elution fractions obtained from the second Superdex Peptide 10/300 GL chromatography

組分酶活力鑒定結(jié)果如圖8所示。收集合并L3組分，真空冷凍干燥濃縮后，4 ℃條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 反相HPLC純度鑒定

圖9 類胡蘿卜素裂解酶的HPLC純度分析Fig.9 Purity analysis of the carotenoid cleavage enzyme by HPLC

由于該酶分子質(zhì)量很小，難以用聚丙烯酰胺凝膠電泳驗(yàn)證其純度，故選擇HPLC檢驗(yàn)物質(zhì)純度，其結(jié)果顯示峰狹窄單一（圖9），純度達(dá)到95.6%（以峰面積比例表征物質(zhì)純度），由此表明經(jīng)上述純化得到的酶液已為純酶。

表1 巴氏葡萄球菌TS-82中類胡蘿卜素裂解酶的分離純化Table1 Purification procedures of carotenoid cleavage enzyme from S. pasteuri TS-82

巴氏葡萄球菌TS-82發(fā)酵液中類胡蘿卜素裂解酶的分離純化結(jié)果如表1所示。以β-胡蘿卜素為底物測定比活力，純化后的類胡蘿卜素裂解酶的比活力達(dá)到125 U/g，純度提高了446 倍，酶的回收率為2.39%。

2.5 分子質(zhì)量的測定結(jié)果

圖10 LC-ESI/MS測定巴氏葡萄球菌TS-82類胡蘿卜素裂解酶的相對分子質(zhì)量Fig.10 LC-ESI/MS of purified carotenoid cleavage enzyme from S. pasteuri TS-82

由圖10可知，分離純化得到的純類胡蘿卜素裂解酶分子質(zhì)量為655.093 D，明顯小于報(bào)道的該類酶的相對分子質(zhì)量。據(jù)報(bào)道，類胡蘿卜素裂解酶的分子質(zhì)量一般在10 kD以上，如Pleurotus sapidus中分離得到的分子質(zhì)量為38 kD[9]，Ganoderma applanatum中的分子質(zhì)量分別為38.30 kD和38.37 kD[11]，而CCD家族的分子質(zhì)量也在20 kD以上[18-19]，表明巴氏葡萄球菌TS-82中分離得到的類胡蘿卜素裂解酶明顯不同于其他來源的類胡蘿卜素裂解酶，其氨基酸序列及結(jié)構(gòu)有待于進(jìn)一步研究。為排除其為其他有機(jī)分子或無機(jī)離子的可能性，在實(shí)驗(yàn)過程中，分別在高溫、強(qiáng)酸和強(qiáng)堿環(huán)境下處理該活性物質(zhì)，測其活性明顯降低，隨著處理時間的延長，該物質(zhì)的活性幾乎完全喪 失，表明該活性物質(zhì)并非無機(jī)鹽離子；在pH 8.0條件下，用胰蛋白酶和蛋白酶K處理該活性物質(zhì)，再將pH值調(diào)至5.0，測其催化活性，發(fā)現(xiàn)活性也有明顯降低，表明該活性物質(zhì)被水解，說明該活性物質(zhì)為多肽或蛋白質(zhì)類。

2.6 純酶的酶學(xué)特性

2.6.1 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

圖11 溫度對類胡蘿卜素裂解酶催化類胡蘿卜素底物降解的影響Fig.11 Effect of temperature on the activity of carotenoid cleavage enzyme towards carotenoids substrates

如圖11所示，在測定的溫度范圍內(nèi)酶活力先隨著溫度的升高而增加，達(dá)到最大值后，隨著溫度繼續(xù)升高，酶活力逐步下降。該類胡蘿卜素裂解酶作用于C40類胡蘿卜素底物的最適反應(yīng)溫度是60 ℃，而作用于β-阿樸-8′-胡蘿卜醛的最適溫度是50 ℃。酶與雙環(huán)底物混合物的最適反應(yīng)溫度高于酶與單環(huán)底物混合物，表明酶與雙環(huán)底物的混合物更加穩(wěn)定，從而保護(hù)該酶的結(jié)構(gòu)，使其暫時免受加熱的破壞[20]。也有文獻(xiàn)報(bào)道稱具降解類胡蘿卜素活性的酶有較高的反應(yīng)溫度，如在茶葉和香蘭葉中提取的類胡蘿卜素裂解酶最適溫度是70 ℃[21]，杏鮑菇中得到的該類酶最適溫度是65 ℃[8]，大部分水果中的該類酶反應(yīng)溫度在45 ℃左右[22-23]。

圖12 類胡蘿卜素裂解酶的耐熱性Fig.12 Thermostability of carotenoid cleavage enzyme

在類胡蘿卜素裂解酶耐熱性研究中，選取β-胡蘿卜素標(biāo)品用于驗(yàn)證酶活力的損失程度，其結(jié)果如圖12。該酶在50 ℃條件下放置1 h后測定酶活力，發(fā)現(xiàn)無顯著性地降低，酶活力損失不嚴(yán)重，而當(dāng)溫度繼續(xù)升高，處理該酶1 h后發(fā)現(xiàn)酶活力顯著性下降，表明其耐熱溫度可達(dá)到50 ℃，說明該類胡蘿卜素裂解酶自身結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，不易受到溫度的破壞。

2.6.2 類胡蘿卜素裂解酶的最適反應(yīng)pH值及其耐酸性

圖13 pH值對類胡蘿卜素裂解酶催化類胡蘿卜素底物降解的影響Fig.13 Effect of pH on the activity of carotenoid cleavage enzyme towards carotenoids substrates

從圖13可以看出，所得純酶催化所有類胡蘿卜素底物的最適pH值均為3.0。從pH值分布上看，類胡蘿卜素裂解酶在酸性環(huán)境下催化活性較高，隨著pH值升高，催化能力逐步減弱，在pH 6.0時該酶幾乎完全失活，這與報(bào)道的其他微生物源的類胡蘿卜素裂解酶的最適pH值不同。Sphingopyxis alaskensis RB2256和Plesiocystis pacif i ca SIR-1中的此類酶的最適催化pH值是7.0[1]，Pleurotus eryngi中的是5.0[8]，表明巴氏葡萄球菌TS-82所產(chǎn)類胡蘿卜素裂解酶的耐酸性極好。鑒于沙棘果酒偏酸性，其pH值也在3.0～3.5之間，故該酶的生化特性使其能夠適應(yīng)果酒的工業(yè)環(huán)境，可用于改善果酒的風(fēng)味。

圖14 類胡蘿卜素裂解酶的酸穩(wěn)定性Fig.14 Acid resistance of carotenoid cleavage enzyme

從圖14可看出，所得純酶在低pH值條件下處理1 周的酶液活性損失顯著增加，表明酸性越強(qiáng)，酶結(jié)構(gòu)破壞越嚴(yán)重。在弱酸性環(huán)境中（pH 5.0～6.0）放置1 周，酶活力并未發(fā)生顯著性變化，酶活力仍保有原來的95%以上，說明該酶適合保存在pH 5.0～6.0的緩沖液中，避免結(jié)構(gòu)破壞。該酶在pH 3.5條件下放置1 周后，酶活力顯著下降，僅保有原酶活力的45%左右，表明所得純酶可用于沙棘果酒釀造過程中，在釀造初期可催化部分類胡蘿卜素降解，而隨著釀造時間增加，該酶活力逐漸降低，可保留一定量的類胡蘿卜素以確保沙棘果酒中類胡蘿卜素自身的營養(yǎng)價值。

2.6.3 類胡蘿卜素裂解酶的Km和vmax

表2 類胡蘿卜素裂解酶作用于不同底物的Km和vmaxTabllee 22 Kmaanndd vmmaaxxvvaalluueess ooff ccaarrootteennooiidd cclleeaavvaaggee eennzzyymmee ttoowwaarrddss ddiiffffeerreenntt substraatteess

如表2所示，所得類胡蘿卜素裂解酶對底物β-阿樸-8’-胡蘿卜醛、β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)、角黃質(zhì)和蝦青素的Km值分別為15.403、10.99、9.846、11.285 μmol/L和10.952 μmol/L，最大反應(yīng)速率vmax分別為0.922、0.962、1.406、1.089 μmol/（L·min）和1.044 μmol/（L·min），表明該酶對玉米黃質(zhì)的Km值最低，故此酶與玉米黃質(zhì)的結(jié)合力最強(qiáng)，親和力最高；該酶對蝦青素、β-胡蘿卜素、角黃質(zhì)和β-阿樸-8’-胡蘿卜醛的Km值分別比對玉米黃質(zhì)的Km值高11.2%、11.6%、14.6%和

56.4 %，表明該酶對蝦青素和β-胡蘿卜素的親和力僅次于玉米黃質(zhì)，其次是角黃質(zhì)，而β-阿樸-8’-胡蘿卜醛與該酶的親和力最差。

2.6.4 類胡蘿卜素裂解酶的Ea

圖15 類胡蘿卜素裂解酶對β-胡蘿卜素的阿倫尼烏斯方程Fig.15 Arrhenius plot of carotenoid cleavage enzyme towards β-carotene

將測定的最適反應(yīng)溫度的數(shù)據(jù)用來計(jì)算Ea。由阿倫尼烏斯曲線方程y=－3 680.1x+4.711 8（圖15）的斜率可計(jì)算得到Ea為30.617 kJ/mol。而報(bào)道的植物源類胡蘿卜素裂解酶的Ea是62.2 kJ/mol或者更高[12,23]，這表明相較于報(bào)道的類胡蘿卜裂解酶，所得純酶更易降解β-胡蘿卜素。

2.6.5 金屬離子對類胡蘿卜素裂解酶的影響

表3 金屬離子對酶催化-胡蘿卜素活性的影響Table3 Effects of metal ions on the carotenoid cleavage enzyme activity towards -carotene

如表3所示，反應(yīng)體系中，一價陽離子Na+和K+能促進(jìn)酶活力，但效果不顯著。二價陽離子中Mg2+在測試濃度范圍內(nèi)對酶活力有促進(jìn)作用，但促進(jìn)作用不明顯；Zn2+和Ca2+在低濃度時，對酶活力有輕微的促進(jìn)作用，在高濃度時，對酶活力有輕微的抑制作用；加入Fe2+、Mn2+、Hg2+、Cu2+后，酶活力隨著濃度的增加而降低，其中Mn2+、Hg2+對其抑制作用較輕；而Cu2+對酶活力有較強(qiáng)的抑制作用，在濃度為10 mmol/L時，抑制率達(dá)到48%；e2+對酶活力的抑制作用最強(qiáng)，在濃度為1 mmol/L時，抑制率就達(dá)到85%，隨著濃度升高，在10 mmol/L時，抑制率可達(dá)93%，所以Fe2+可作為酶的強(qiáng)效抑制劑。三價陽離子對酶活力都有顯著的促進(jìn)作用，Al3+在10 mmol/L時可使酶活力提高至3 倍多，顯著高于其他離子的促進(jìn)作用，可作為該酶的強(qiáng)效催化劑。

2.6.6 雙氧水對類胡蘿卜素裂解酶的影響如表4所示，雙氧水在低濃度時對該酶無抑制作用，隨著H2O2濃度的增加，酶活力先增加后減弱，在12 μmol/L

表4 H2O2對酶催化-胡蘿卜素活性的影響Table4 Effects of H2O2on the carotenoid cleavage enzyme activity towards -carotene

時達(dá)到最大值，而當(dāng)濃度過大時，可導(dǎo)致酶失活，這與報(bào)道的適當(dāng)濃度的雙氧水可促進(jìn)類胡蘿卜素裂解酶活性的結(jié)果一致[8,24]，可能是由于高濃度的H2O2導(dǎo)致自發(fā)失活抑制作用并形成失活的氧化態(tài)而造成的[25]。

2.6.7 乙醇對類胡蘿卜素裂解酶的影響

表5 乙醇對酶催化-胡蘿卜素活性的影響Table5 Effects of ethyl alcohol on the carotenoid cleavage enzyme activity towards -carotene

如表5所示，乙醇的加入并未對酶活力產(chǎn)生顯著的影響，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)到12%～16%時，活性反而有微弱的提高，表明該酶能夠穩(wěn)定的適應(yīng)果酒環(huán)境，該性質(zhì)為該酶直接添加于果酒釀造提供了可能性。

3 結(jié) 論

巴氏葡萄球菌TS-82所產(chǎn)類胡蘿卜素裂解酶經(jīng)強(qiáng)陰離子柱、高效制備液相和多肽分子篩分離后，可得類胡蘿卜素裂解酶純酶；該酶降解β-胡蘿卜素的比活力為125 U/g，純化倍數(shù)為446，回收率為2.39%。經(jīng)HPLC分析，確定該酶為單一峰，純度達(dá)到95%以上。所得純酶經(jīng)HPLC-MS測定，得其分子質(zhì)量為655.093 D，明顯小于報(bào)道的該類酶的相對分子質(zhì)量（≥10 kD），表明巴氏葡萄球菌TS-82中分離得到的類胡蘿卜素裂解酶可能是一個新的家族。

關(guān)于酶學(xué)特性，該酶對C40類胡蘿卜素底物的最適溫度為60 ℃，而作用于β-阿樸-8’-胡蘿卜醛的最適溫度是50 ℃，該酶的穩(wěn)定溫度為50 ℃以下；該酶對所考察底物的最適pH值為3.0；根據(jù)Lineweaver-Burk法作圖求得的Km值和vmax可知，該酶與5 種底物親和力大小排列為：玉米黃質(zhì)＞蝦青素＞β-胡蘿卜素＞角黃質(zhì)＞β-阿樸-8’-胡蘿卜醛，底物轉(zhuǎn)化率為：玉米黃質(zhì)＞角黃質(zhì)＞蝦青素＞β-胡蘿卜素＞β-阿樸-8’-胡蘿卜醛；Al3+和Fe3+是該酶的強(qiáng)效催化劑，F(xiàn)e2+是該酶的強(qiáng)效抑制劑，在1 mmol/L的情況下就可使該酶幾乎完全失活；H2O2在低濃度范圍內(nèi)（0～16 mmol/L）可促進(jìn)酶活力；低體積分?jǐn)?shù)乙醇（4%～16%）的添加對酶活力影響不大，無抑制作用。上述酶學(xué)特性表明該酶能夠穩(wěn)定的適應(yīng)果酒環(huán)境，為其工業(yè)化應(yīng)用提供依據(jù)。

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Isolation, Purification and Characterization of a Novel Carotenoid-Cleaving Enzyme from Staphylococcus pasteuri TS-82

ZHU Mingming1, FAN Mingtao2, HE Hongju1,*, MA Hanjun1
(1. School of Food Science, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China; 2. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

A carotenoid cleavage enzyme with HPLC grade purity of 95.6% w as obtained from Staphylococcus pasteuri (S. pasteuri) TS-82 by using anion-exchange chromatography, preparative high performance liquid chromatography (PHPLC), and superdex peptide chromatography together. The purified enzyme had a specific activity of 125 U/g with 466-fold purification and 2.39% recovery. Its molecular weight was 655.093 D as identified by liquid chromatographyelectrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI/MS). Enzymatic characterization indicated that the purified enzyme had optimal temperature of 60 ℃ for degrading C40carotenoids and 50 ℃ for degrading β-apo-8’-carotenal, and it maintained stable activity at 50 ℃. The optimum pH value was 3.0 for degrading all investigated substrates. The Kmand vmaxvalues indicated that the enzyme showed the highest affinity towards zeaxanthin, followed by astaxanthin, β-carotene, canthaxanthin, and β-apo-8’-carotenal in a decreasing order. The metal ions Al3+and Fe3+were identif i ed as potent activators for the purif i ed enzyme, whereas Fe2+as a potent inhibitor. H2O2was able to increase the enzyme activity in degrading β-carotene at levels of 0-16 mmol/L. Alcohol at low concentration (4%-16%) did not inhibit the activity of the enzyme. In conclusion, the enzyme showed great acid resistance and thermostability, which makes it stable in wine environment and provides a basis for industrial application.

Staphylococcus p asteuri TS-82; carotenoid cleavage enzyme; carotenoids; purif i cation; characterization

10.7506/spkx1002-6630-201712016

TS20

A

1002-6630（2017）12-0104-08

朱明明, 樊明濤, 何鴻舉, 等. 巴氏葡萄球菌TS-82類胡蘿卜素裂解酶的分離純化及其酶學(xué)特性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(12)： 104-111.

10.7506/spkx1002-6630-201712016. http：//www.spkx.net.cn

ZHU Mingming, FAN Mingtao, HE Hongju, et al. Isolation, purification and characterization of a novel carotenoid-cleaving enzyme from Staphylococcus pasteuri TS-82[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 104-111. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712016. http：//www.spkx.net.cn

2016-06-11

河南科技學(xué)院高層次人才科研啟動項(xiàng)目（2015015；2016020）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31171728）；河南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃項(xiàng)目（13IRTSTHN006）

朱明明（1989—），女，講師，博士，主要從事食品分析研究。E-mail：happyzhumingming@126.com

*通信作者：何鴻舉（1983—），男，教授，博士，主要從事食品質(zhì)量分析與快速檢測研究。E-mail：hongju_he007@126.com