補(bǔ)料方式對(duì)靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵合成靈芝三萜的影響

馮 杰，馮 娜，唐慶九，顏夢(mèng)秋，楊 焱，周 帥，劉艷芳，劉 方，張勁松*

（農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海 201403）

補(bǔ)料方式對(duì)靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵合成靈芝三萜的影響

馮 杰，馮 娜，唐慶九，顏夢(mèng)秋，楊 焱，周 帥，劉艷芳，劉 方，張勁松*

（農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海 201403）

在50 L發(fā)酵罐中采用4 種補(bǔ)料培養(yǎng)方式對(duì)靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵合成靈芝三萜進(jìn)行比較。結(jié)果表明，通過(guò)補(bǔ)料可以明顯地促進(jìn)靈芝菌絲體的生長(zhǎng)和靈芝三萜的合成，同時(shí)，不同的補(bǔ)料方式對(duì)菌絲體生長(zhǎng)和靈芝三萜合成有不同的影響。采用指數(shù)補(bǔ)料方式可獲得較高的菌絲體干質(zhì)量，并提高靈芝三萜含量，與傳統(tǒng)的發(fā)酵方式相比，采用此補(bǔ)料策略取得了較好的效果。發(fā)酵終點(diǎn)靈芝菌絲體干質(zhì)量達(dá)到17.68 g/L，靈芝三萜含量達(dá)到4.58 g/100 g干菌絲體，分別比分批發(fā)酵提高了65.70%和100.88%。

靈芝；深層發(fā)酵；靈芝三萜；補(bǔ)料培養(yǎng)

靈芝（Ganoderma lucidum）作為我國(guó)名貴的大型藥用真菌，具有滋補(bǔ)、益壽、平衡機(jī)體等功效[1-2]。近些年來(lái)，隨著靈芝功效的進(jìn)一步發(fā)掘，其得到了世界各地許多研究者進(jìn)一步的深入研究[3-4]。其中，靈芝三萜類化合物在保肝、抗腫瘤、抗蛋白酶活性、抗衰老、抗組織胺釋放、降血糖和降血脂等方面具有一定作用[5-6]。

靈芝三萜在現(xiàn)階段主要有兩個(gè)來(lái)源，一是從人工栽培或野外生長(zhǎng)的靈芝子實(shí)體和孢子粉中獲得，二是從靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵的產(chǎn)物獲得[7-8]?，F(xiàn)階段，靈芝子實(shí)體栽培周期長(zhǎng)（平均在3 個(gè)月以上）、占地大、質(zhì)量存在不穩(wěn)定性，嚴(yán)重影響靈芝的研究與相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)[9-10]。與人工栽培獲得靈芝子實(shí)體相比較，液態(tài)深層發(fā)酵技術(shù)合成靈芝三萜由于具有菌絲體生長(zhǎng)速率快、發(fā)酵周期短、不會(huì)受到季節(jié)性氣候的影響、靈芝三萜類化合物活性成分提取與分離比較容易控制等重要特點(diǎn)，因此，通過(guò)液態(tài)深層發(fā)酵技術(shù)已成為獲得靈芝三萜的有效方法[11-12]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)ang Qinghua等[13-14]對(duì)真菌靈芝發(fā)酵生產(chǎn)靈芝多糖和菌絲體中靈芝酸（一種靈芝三萜類物質(zhì)）進(jìn)行了較為深入的研究，涉及發(fā)酵培養(yǎng)基組成、環(huán)境因素的優(yōu)化、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究及流加發(fā)酵、兩階段法靜置培養(yǎng)等方面。根據(jù)他們提出兩階段靜置培養(yǎng)模式，即在4 d搖床培養(yǎng)之后再接以12 d的靜置培養(yǎng)，靈芝酸質(zhì)量濃度達(dá)到了0.58 g/L，相對(duì)連續(xù)搖瓶培養(yǎng)7 d的發(fā)酵結(jié)果有顯著提高。Ding Yixin[15]、Ren Ang[16]等在研究中發(fā)現(xiàn)通過(guò)在培養(yǎng)基中添加植物激素茉莉酸甲酯能夠促進(jìn)靈芝酸的生物合成，靈芝酸含量達(dá)到0.45 g/L。目前，靈芝三萜的產(chǎn)量和得率 偏低，導(dǎo)致該方法還不能夠完全滿足其應(yīng)用市場(chǎng)的需求。靈芝三萜的低生產(chǎn)率是制約其廣泛研發(fā)及應(yīng)用的一個(gè)瓶頸[17-18]。

補(bǔ)料培養(yǎng)作為一種介于連續(xù)培養(yǎng)和分批培養(yǎng)之間的發(fā)酵方式，其培養(yǎng)過(guò)程具有富集培養(yǎng)高生物量、緩和培養(yǎng)基底物抑制等 特點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到各種發(fā)酵初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)中[19-20]。不同的補(bǔ)料方式對(duì)于發(fā)酵體系中生物量的提高、底物的利用和產(chǎn)物的合成有一定的促進(jìn)作用[21]。本研究室前期研究表明，靈芝菌絲體生長(zhǎng)和靈芝三萜的合成存在碳源葡萄糖的競(jìng)爭(zhēng)，故在培 養(yǎng)過(guò)程中僅提高菌絲體 濃度并不一定能提高靈芝三萜的得率?；谝陨显蚍治?，本研究通過(guò)對(duì)4 種補(bǔ)料方式進(jìn)行比較，考察其對(duì)靈芝菌絲 體合成靈芝三萜的影響。并在比較4 種補(bǔ)料培養(yǎng)方式對(duì)靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵合成靈芝三萜影響的基礎(chǔ)上，優(yōu)化出靈芝三萜高效合成的補(bǔ)料培養(yǎng)策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

靈芝菌株由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)農(nóng)業(yè)微生物中心上海食用菌分中心提供和保藏，菌株編號(hào)：G. lucidum G0119。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)BD公司，稱取39 g培養(yǎng)基粉末溶于1 000 mL蒸餾水，在121℃滅菌20 min后備用。

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)BD公司，稱取24 g培養(yǎng)基粉末溶于1 000 mL蒸餾水，在121℃滅菌20 min后備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母粉3 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，七水合硫酸鎂2 g/L，調(diào)節(jié)pH 5.5，121 ℃滅菌25 min后備用。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWY-2102雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；BIOTECH-5BGZ-50JS 50 L發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；Synergy HT多功能酶標(biāo)儀美國(guó)BioT ek公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)條件

種子液培養(yǎng)：挑取冷凍管保藏的菌種于斜面培養(yǎng)基中，26 ℃培養(yǎng)12 d后，取3 塊約0.2 cm2大小的菌塊接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在搖床上于26 ℃、150 r/min培養(yǎng)10 d得一級(jí)種子液。再將培養(yǎng)好的一級(jí)種子液以10%（V/V）的接種量，將其接種于裝有400 mL種子培養(yǎng)基的1 000 mL三角瓶中，在搖床上于26℃、150 r/min培養(yǎng)7 d得二級(jí)種子液。

搖瓶培養(yǎng)：取培養(yǎng)好的一級(jí)種子液以10%（V/V）接種量轉(zhuǎn)接于裝有200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，在搖床上于26℃、150 r/min培養(yǎng)至葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于5%時(shí)結(jié)束發(fā)酵。

發(fā)酵罐分批培養(yǎng)：培養(yǎng)好的二級(jí)種子液以10%（V/V）的接種量，將其接種于含有35 L培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐中，通氣比1∶1，26 ℃、100 r/min培養(yǎng)144 h。

1.3.2 補(bǔ)料培養(yǎng)方式

發(fā)酵罐間歇式補(bǔ)料培養(yǎng)：培養(yǎng)好的二級(jí)種子液以10%的接種量，將其接種于含有35 L培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐中，通氣比1∶1，26 ℃、100 r/min培養(yǎng)180 h。在間歇式補(bǔ)料培養(yǎng)過(guò)程中，1 000 g/L葡萄糖（總體積為1.05 L）分別于36、78 h和120 h平均分3 次加入發(fā)酵罐中。

發(fā)酵罐恒速補(bǔ)料培養(yǎng)：培養(yǎng)好的二級(jí)種子液以10%的接種量，將其接種于含有35 L培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐中，通氣比1∶1，26℃、100 r/min培養(yǎng)180 h。在恒速補(bǔ)料培養(yǎng)過(guò)程中，從36 h開始以12.5 mL/h的速率補(bǔ)料1 000 g/L的葡萄糖（補(bǔ)料總體積為1.05 L），至120 h補(bǔ)料結(jié)束。

發(fā)酵罐變速補(bǔ)料培養(yǎng)：培養(yǎng)好的二級(jí)種子液以10%的接種量，將其接種于含有35 L培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐中，通氣比1∶1，26℃、100 r/min培養(yǎng)180 h。在變速補(bǔ)料培養(yǎng)過(guò)程中，從36 h開始以12.5 mL/h 的速率補(bǔ)料1 000 g/L的葡萄糖（補(bǔ)料體積為525 mL），到78 h后，以25 mL/h的速率補(bǔ)料1 000 g/L的葡萄糖（補(bǔ)料體積為525 mL），至99 h補(bǔ)料結(jié)束。

發(fā)酵罐指數(shù)補(bǔ)料培養(yǎng)：培養(yǎng)好的二級(jí)種子液以10%的接種量，將其接種于含有35 L培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐中，通氣比1∶1，26℃、100 r/min培養(yǎng)180 h。在指數(shù)補(bǔ)料培養(yǎng)過(guò)程中，從36 h開始按指數(shù)補(bǔ)料方式補(bǔ)料1 000 g/L的葡萄糖（補(bǔ)料總體積為1.05 L），至86 h補(bǔ)料結(jié)束。其中，葡萄糖的補(bǔ)料速率F按照（1）式計(jì)算[9]。

式中：F為補(bǔ)料速率/（L/h）；μset為菌絲體的平均比生長(zhǎng)速率/（1/h）；V0為初始發(fā)酵液體積/L；X0為初始菌絲體干質(zhì)量/（g/L）；Yx/s為菌絲體對(duì)葡萄糖得率/（g/g）；Si為補(bǔ)料葡萄糖質(zhì)量濃度/（g/L）；S為發(fā)酵罐內(nèi)葡萄糖質(zhì)量濃度/（g/L）。

根據(jù)靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵的數(shù)據(jù)得到：μset=0.053 1/h[23]，V0=35 L，X0=0.36 g/L[24]，Yx/s=1.084 g/g[17]，Si=1 000 g/L，S=20 g/L。代入數(shù)據(jù)計(jì)算得流速F=6.28×10－4×exp（0.053t），通過(guò)蠕動(dòng)泵控制碳源葡萄糖的流速F。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1 菌絲體干質(zhì)量的測(cè)定

取靈芝菌絲體發(fā)酵液200 mL在12 000×g離心10 min后丟棄上清液，取沉淀用去離子水洗滌離心3次，收集后放在60 ℃的烘箱中烘干至質(zhì)量恒定，精確稱質(zhì)量[25-26]。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)定3 個(gè)平行，計(jì)算平均值。

1.3.3.2 葡萄糖含量的測(cè)定

取靈芝菌絲體發(fā)酵液200 mL在12 000×g離心10 min后取上清液，將上清液稀釋20倍后用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定葡萄糖質(zhì)量濃度[27]，葡萄糖終質(zhì)量濃度的確定以發(fā)酵結(jié)束時(shí)葡萄糖質(zhì)量濃度基本無(wú)變化為準(zhǔn)。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)定3個(gè)平行，計(jì)算平均值，葡萄糖利用率計(jì)算如式（2）所示：

1.3.3.3 靈芝三萜含量的測(cè)定

干燥的菌絲體用95%乙醇溶液（料液比1∶50（g/mL））浸提24 h后，采用香草醛-冰醋酸比色法[28-29]測(cè)定靈芝三萜含量。其中，應(yīng)用此方法測(cè)定的靈芝三萜主要是指三萜類物質(zhì)或三萜及甾醇的含量。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)定3個(gè)平行，計(jì)算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖初始質(zhì)量濃度對(duì)靈芝三萜合成的影響

表1 葡萄糖初始質(zhì)量濃度對(duì)靈芝菌絲體發(fā)酵的影響Table1 Effect of initial glucose concentration on mycelial growth and triterpenes production of G. lucidum G0119

靈芝菌絲體作為藥用真菌，其菌絲體生長(zhǎng)和底物利用相比較于微生物要慢，在靈芝菌絲體培養(yǎng)基中加入過(guò)多的葡萄糖會(huì)導(dǎo)致其他副產(chǎn)物的形成[30]。以不同葡萄糖初始質(zhì)量濃度為變量，在搖瓶實(shí)驗(yàn)中對(duì)靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵過(guò)程中的葡萄糖利用和靈芝三萜合成進(jìn)行分析，由表1可知，葡萄糖初始質(zhì)量濃度大于20 g/ L時(shí)，對(duì)G. lucidum G0119菌絲體生長(zhǎng)和靈芝三萜的合成產(chǎn)生較明顯的抑制作用。隨著葡萄糖初始質(zhì)量濃度分別增加為25、30 g/L和35 g/L時(shí)，靈芝菌絲體干質(zhì)量分別為11.64、10.65 g/L和9.89 g/L，靈芝三萜含量分別為2.06、1.41 g/100 g干菌絲體和1.26 g/100 g干菌絲體，即葡萄糖初始質(zhì)量濃度增加時(shí)，菌絲體干質(zhì)量和靈芝三萜含量逐漸降低。當(dāng)葡萄糖初始質(zhì)量濃度低于15 g/L時(shí)，其菌絲體干質(zhì)量和靈芝三萜含量隨著葡萄糖初始質(zhì)量濃度的降低而降低。在葡萄糖初始質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，菌絲體干質(zhì)量均高于其他葡萄糖初始質(zhì)量濃度，靈芝三萜含量略低于15 g/L葡萄糖初始質(zhì)量濃度時(shí)的數(shù)值，但高于其他葡萄糖初始質(zhì)量濃度的數(shù)值。結(jié)合葡萄糖終質(zhì)量濃度、菌絲體干質(zhì)量和靈芝三萜含量3 個(gè)指標(biāo)表明G. lucidum G0119培養(yǎng)的葡萄糖初始質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)最適宜。

2.2 靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵補(bǔ)料時(shí)間的確定

圖1 50 L發(fā)酵罐上靈芝菌絲體 液態(tài)深層發(fā)酵過(guò)程曲線Fig.1 Time course curves for mycelial growth and triterpenes production during submerged culture of G. lucidum G0119 in a 50-L fermentor

以20 g/L葡萄糖作為初始碳源質(zhì)量濃度，在50 L通風(fēng)發(fā)酵罐上對(duì)靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵的過(guò)程進(jìn)行跟蹤分析，根據(jù)發(fā)酵過(guò)程中菌絲體干質(zhì)量、葡萄糖消耗和靈芝三萜含量參數(shù)的變化，繪制發(fā)酵過(guò)程曲線，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，菌絲體的生長(zhǎng)可以分為3個(gè)階段，第1階段為延滯期，在0～36 h之間，菌絲體基本不生長(zhǎng)，葡萄糖質(zhì)量濃度在36 h時(shí)為16.15 g/L，靈芝三萜也沒(méi)有合成。第2階段，即對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在36～120 h之間，在此階段，菌絲體進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，葡萄糖質(zhì)量濃度快速下降，靈芝三萜含量也同步增加。在菌絲體生長(zhǎng)進(jìn)入第3階段，即120～144 h時(shí)，菌絲體干質(zhì)量和靈芝三萜含量均達(dá)到最大值，分別為10.67 g/L和2.28 g/100 g干菌絲體，同時(shí)，葡萄糖質(zhì)量濃度也達(dá)到最低值，為4.5 g/L。對(duì)靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵進(jìn)行跟蹤 分析，可為下一步補(bǔ)料時(shí)間的確定提供依據(jù)。由圖1還可知，靈芝菌絲體在36～120 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，因此，可以選擇在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前期、中期和后期，即36、78 h和120 h選擇補(bǔ)加葡萄糖。

2.3 間歇式補(bǔ)料培養(yǎng)方式對(duì)靈芝菌絲體發(fā)酵合成靈芝三萜的影響

圖2 間歇式補(bǔ)料葡萄糖對(duì)靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of intermittent feeding of glucose on mycelial growth and triterpenes production

在前期分批發(fā)酵研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高靈芝三萜的得率，首先考察在50 L發(fā)酵罐上間歇式補(bǔ)料培養(yǎng)方式對(duì)靈芝三萜發(fā)酵的影響。由圖2所示，在發(fā)酵過(guò)程中碳源葡萄糖質(zhì)量濃度在大部分時(shí)間段低于20 g/L，只有在36～48 h由于第1次補(bǔ)料使得葡萄糖質(zhì)量濃度維持在20 g/L以上，最大葡萄糖質(zhì)量濃度為26.14 g/L。間歇式補(bǔ)料方式使得葡萄糖的抑制效應(yīng)變小，最終菌絲體干質(zhì)量上升到13.68 g/L，比分批發(fā)酵方式提高28.21%。靈芝三萜的最終含量為3.63 g/100 g干菌絲體，與分批發(fā)酵相比提高59.22%。結(jié)果說(shuō)明間歇式補(bǔ)料培養(yǎng)方式在促進(jìn)菌絲體生長(zhǎng)的同時(shí)，菌絲體合成靈芝三萜的效率也有所提高。

2.4 恒速補(bǔ)料培養(yǎng)方式對(duì)靈芝菌絲體發(fā)酵合成靈芝三萜的影響

采用恒速補(bǔ)料培養(yǎng)方式時(shí)，在培養(yǎng)過(guò)程中以12.5 mL/h的恒定流速加入葡萄糖，以此解除底物葡萄糖的抑制效應(yīng)。由圖3可以看出，在采用恒速補(bǔ)料培養(yǎng)方式中，靈芝菌絲體生長(zhǎng)周期被延長(zhǎng)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)靈芝菌絲體干質(zhì)量和產(chǎn)物靈芝三萜含量也相應(yīng)增加，最終菌絲體干質(zhì)量達(dá)到了14.18 g/L，比分批發(fā)酵提高了32.90%，靈芝三萜含量也隨之提高至3.03 g/100 g干菌絲體，與分批發(fā)酵相比提高32.89%。說(shuō)明恒速補(bǔ)料培養(yǎng)方式既促進(jìn)了靈芝菌絲體生長(zhǎng)，同時(shí)，靈芝菌絲體合成靈芝三萜的得率也有所提高。

圖3 恒定速率補(bǔ)料葡萄糖對(duì)靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of constant feeding of glucose on mycelial growth and triterpenes production

2.5 變速補(bǔ)料培養(yǎng)方式對(duì)靈芝菌絲體發(fā)酵合成靈芝三萜的影響

圖4 變速補(bǔ)料葡萄糖對(duì)靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of variable feeding of glucose on mycelial growth and triterpenes production

在恒速補(bǔ)料培養(yǎng)方式下，由于在培養(yǎng)過(guò)程中以恒定的12.5 mL/h的流速加入葡萄糖，只較大幅度提高了菌絲體干質(zhì)量，產(chǎn)物靈芝三萜含量的增加并不明顯，因此，考慮采用變速補(bǔ)料的方式來(lái)考察靈芝三萜的合成。圖4所示為葡萄糖變速補(bǔ)料培養(yǎng)方式下靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵過(guò)程，發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌絲體最大干質(zhì)量達(dá)到15.26 g/L，比分批發(fā)酵提高了43.02%。靈芝三萜含量達(dá)到了3.85 g/100 g干菌絲體，與分批發(fā)酵相比 提高68.86%。說(shuō)明變速補(bǔ)料培養(yǎng)方式在恒速補(bǔ)料培養(yǎng)方式的基礎(chǔ)上進(jìn)一步促進(jìn)了菌絲體生長(zhǎng)和靈芝三萜的合成。

2.6 指數(shù)補(bǔ)料培養(yǎng)方式對(duì)靈芝菌絲體發(fā)酵合成靈芝三萜的影響

在上述恒速補(bǔ)料培養(yǎng)方式中，由于采用了葡萄糖補(bǔ)料速率始終恒定，結(jié)果在發(fā)酵前期因?yàn)榫z體干質(zhì)量較低，葡萄糖完全消耗的可能性降低。而在發(fā)酵后期，靈芝菌絲體干質(zhì)量很高，葡萄糖又難以滿足靈芝菌絲體生長(zhǎng)的需求。因此，根據(jù)靈芝菌絲體生長(zhǎng)的特點(diǎn)，進(jìn)一步提出采用指數(shù)補(bǔ)料培養(yǎng)方式應(yīng)有利于菌絲體的生長(zhǎng)。由圖5分析可知，底物葡萄糖的指數(shù)速率補(bǔ)料培養(yǎng)方式對(duì)靈芝菌絲體的生長(zhǎng)促進(jìn)效果最好，最終菌絲體干質(zhì)量的最大值為17.68 g/L，是所有培養(yǎng)方式中的最高水平，比分批發(fā)酵提高了65.70%。靈芝三萜的含量也達(dá)到最高值，為4.58 g/100 g干菌絲體，比分批發(fā)酵提高了100.88%。

圖5 指數(shù) 速率補(bǔ)料葡萄糖對(duì)靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of exponential feeding of glucose on mycelial growth and triterpenes production

2.74 種補(bǔ)料培養(yǎng)方式下靈芝菌絲體發(fā)酵合成靈芝三萜的比較

表2 各培養(yǎng)方式下發(fā)酵參數(shù)的比較Table2 Comparison of fermentation parameters with different feeding methods

由表2可知，靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵合成靈芝三萜過(guò)程中，4 種葡萄糖補(bǔ)料方式可不同程度地解除葡萄糖對(duì)靈芝菌絲體生長(zhǎng)的抑制，采用此發(fā)酵方式可提高發(fā)酵中的菌絲體干質(zhì)量。同時(shí)，這4 種補(bǔ)料培養(yǎng)方式也不同程度地提高了靈芝三萜的合成效率。很顯然，指數(shù)補(bǔ)料培養(yǎng)方式的效果是最優(yōu)的，其最終靈芝三萜的含量相比較于分批發(fā)酵提高的幅度也是最大的。

3 討 論

本研究通過(guò)采用5 種培養(yǎng)方式研究靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵對(duì)合成靈芝三萜的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靈芝菌絲體合成靈芝三萜的過(guò)程為生長(zhǎng)偶聯(lián)型，由表2恒速補(bǔ)料培養(yǎng)結(jié)果可知，菌絲體干質(zhì)量與靈芝三萜的含量并不是正比關(guān)系。因此，在靈芝菌絲體生長(zhǎng)和靈芝三萜合成之間達(dá)到平衡對(duì)于靈芝三萜的高產(chǎn)有重要意義。本研究比較的5 種靈芝菌絲體的培養(yǎng)方式中，分批培養(yǎng)由于沒(méi)有補(bǔ)料葡萄糖，使得發(fā)酵后期葡萄糖質(zhì)量濃度處于低水平，最終菌絲體干質(zhì)量和靈芝三萜含量均比較低；間歇式補(bǔ)料培養(yǎng)改善了發(fā)酵培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)條件，使得菌絲體干質(zhì)量和靈芝三萜含量均有所提高，但是由于在36 h補(bǔ)料時(shí)導(dǎo)致一段時(shí)間內(nèi)葡萄糖質(zhì)量濃度過(guò)高，未能使得菌絲體發(fā)酵達(dá)到最優(yōu)化條件。恒速補(bǔ)料培養(yǎng)方式改善了靈芝菌絲體在發(fā)酵后期的葡萄糖條件，使得靈芝菌絲體干質(zhì)量和靈芝三萜含量均有所增加，但是在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中只是采用恒定的補(bǔ)料速率，會(huì)使發(fā)酵前期葡萄糖含量過(guò)高，而在發(fā)酵后期葡萄糖含量又在較低水平，因此，該培養(yǎng)方式在一定程度上也限制了靈芝菌絲體干質(zhì)量和靈芝三萜含量的增加。變速補(bǔ)料方式在恒速補(bǔ)料的基礎(chǔ)上有所改進(jìn)，但是依然很難彌補(bǔ)靈芝菌絲體在發(fā)酵后期葡萄糖不足的缺點(diǎn)。對(duì)于指數(shù)補(bǔ)料方式，由于該培養(yǎng)方式是基于菌絲體指數(shù)生長(zhǎng)理論而推導(dǎo)出的一種方法，在發(fā)酵前期，靈芝菌絲體干質(zhì)量偏低，因而補(bǔ)料葡萄糖的含量也比較少，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，隨著靈芝菌絲體干質(zhì)量的指數(shù)增加，補(bǔ)料葡萄糖速率也根據(jù)指數(shù)方式增加，結(jié)果使得葡萄糖的補(bǔ)料方式能更適合靈芝菌絲體的生長(zhǎng)和靈芝三萜的合成，特別是發(fā)酵后期為菌絲體合成靈芝三萜的重要階段，這時(shí)大量的補(bǔ)料葡萄糖既適合菌絲體的生長(zhǎng)也促進(jìn)了靈芝三萜的大量合成。因此，通過(guò)比較分批培養(yǎng)和其他4 種補(bǔ)料培養(yǎng)方式可知，采用指數(shù)補(bǔ)料培養(yǎng)方式可較大幅度地提高靈芝菌絲體干質(zhì)量和靈芝三萜含量。

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Effects of Different Feeding Methods on Production of Triterpenes by Ganoderma lucidum in Submerged Fermentation

FENG Jie, FENG Na, TANG Qingjiu, YAN Mengqiu, YANG Yan, ZHOU Shuai, LIU Yanfang, LIU Fang, ZHANG Jingsong*
(Key Laboratory of Edible Fungi Resources and Utilization (South), Ministry of Agriculture, National Engineering Research Center of Edible Fungi, Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding of Shanghai, Institute of Edible Fungi, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201403, China)

Four different feeding methods for the production of triterpenes by submerged fed-batch fermentation of Ganoderma lucidum G0119 in a 50 L-fermentor were compared. The results showed that glucose feeding during fermentation could obviously promote the mycelical growth of G. lucidum G0119 and the synthesis of triterpenes, and different feeding methods had different influences on the mycelial dry weight and the concentration of triterpenes in the fermentation broth. The highest mycelical dry weight could be obtained by exponential feeding, as well as high concentration of triterpenes. The results showed that the feeding strategy was the best among all tested ones, giving a mycelial dry weight of 17.68 g/L and a triterpene content of 4.58 g/100 g dry mycelium at the end of fermentation, which were significantly increased by 65.70% and 100.88%, respectively, as compared with fed-batch fermentation.

Ganoderma lucidum; submerged culture; triterpenes; fed-batch culture

10.7506/spkx1002-6630-201712009

TQ920.6

A

1002-6630（2017）12-0057-06

馮杰, 馮娜, 唐慶九, 等. 補(bǔ)料方式對(duì)靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵合成靈芝三萜的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(12)： 57-62.

10.7506/spkx1002-6630-201712009. http：//www.spkx.net.cn

FENG Jie, FENG Na, TANG Qingjiu, et al. Effects of different feeding methods on production of triterpenes by Ganoderma lucidum in submerged fermentation[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 57-62. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201712009. http：//www.spkx.net.cn

2016-07-18

上海市市級(jí)農(nóng)口系統(tǒng)青年人才成長(zhǎng)計(jì)劃資助項(xiàng)目（滬農(nóng)青字2015第1-7號(hào)）；上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科技人員“助跑”計(jì)劃項(xiàng)目（ZP06）

馮杰（1983—），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)槭乘幱镁簯B(tài)深層發(fā)酵。E-mail：sytufengjie@163.com

*通信作者：張勁松（1969—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)槭乘幱镁谢钚晕镔|(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)及藥理活性。E-mail：syja16@saas.sh.cn