野生嗜殺白假絲酵母LFA418的產(chǎn)毒條件優(yōu)化及其毒素粗提物特性

李 麗，馮 莉，秦 義,2，葉冬青，宋育陽,2,*，劉延琳,2,*

（1.西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程 技術研究中心，陜西 楊凌 712100）

野生嗜殺白假絲酵母LFA418的產(chǎn)毒條件優(yōu)化及其毒素粗提物特性

李 麗1，馮 莉1，秦 義1,2，葉冬青1，宋育陽1,2,*，劉延琳1,2,*

（1.西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程 技術研究中心，陜西 楊凌 712100）

對1 株分離自新疆樓蘭葡萄酒廠野生白假絲酵母（Candida albicans）LFA418的嗜殺特征及其粗毒素特性進行研究。結果顯示，C. albicans LFA418具有致死克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）、貝酵母（Saccharomyces bayanus）、Lachancea thermotolerans和葡萄牙假絲酵母（Candida lusitaniae）的嗜殺性。接種體積分數(shù)7% C. albicans LFA418到YEPD液體培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)32 h，可以獲得最大產(chǎn)量的嗜殺毒素；利用截留分子質(zhì)量為8 000 D的透析袋制備的粗毒素，在溫度分別－20、4 ℃ 時pH 4.2～4.6和pH 4.2時溫度4～20 ℃具有嗜殺活性的穩(wěn)定性。

嗜殺酵母；嗜殺毒素；白假絲酵母

1963年，Woods等[1]首次在發(fā)現(xiàn)啤酒廠發(fā)現(xiàn)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）具有嗜殺現(xiàn)象。自此，已報道20多個酵母屬的90多種酵母具有嗜殺活性，如黑粉菌屬（Ustilago）、克魯維酵母屬（Kluyveromyces）、畢赤酵母屬（Pichia）、漢遜酵母屬（Hansenula）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）、假絲酵母菌屬（Candida）、球擬酵母屬（Torulopsis）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、梅奇酵母屬（Metschnikowia）、擬威爾酵母屬（Williopsis）和接合酵母屬（Zygosaccharomyces）等[2-6]。嗜殺酵母可以分泌毒素（通常是蛋白或外毒素），殺死同種或親緣關系 比較近的敏感酵母，而無細胞與細胞的接觸。嗜殺酵母對自己產(chǎn)生的嗜殺毒素免疫，但是可能對部分酵母產(chǎn)生的嗜殺毒素敏感[7-9]。一種嗜殺毒素特異性地作用于一種或者多種敏感菌[10-11]。自然環(huán)境中，嗜殺酵母產(chǎn)生嗜殺毒素與敏感菌株相比可能更有利于競爭有限營養(yǎng)和空間。21世紀早期，研究人員對嗜殺酵母的抗菌機制展開了廣泛的研究，嗜殺毒素作為酵母分泌的抗菌復合物[12]，存 在于發(fā)酵工業(yè)、食品工業(yè)以及海洋、臨床等各種環(huán)境中，并且已經(jīng)被用于抵抗環(huán)境中的腐敗微生物[4,6,9,12-13]。

研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并篩選出多株葡萄酒酵母中具有嗜殺性的酵母菌株，并對其在自然發(fā)酵中的嗜殺特性進行了研究[14-16]。開發(fā)利用這種性質(zhì)，選擇性接種嗜殺酵母可以抑制不良的野生酵母，對凈化發(fā)酵體系，保證發(fā)酵的正常進行，保證葡萄酒的品質(zhì)具有重要意義[6,14,16-19]。嗜殺酵母還可以考慮用來防治水果的腐爛、抵抗對葡萄有害的霉菌感染等[18-19]。但是野生嗜殺酵母的存在，也可能對葡萄酒的發(fā)酵造成負面的影響，例如在發(fā)酵過程中由于一些特殊的優(yōu)勢群體被少量的嗜殺菌株替代而導致葡萄酒營養(yǎng)缺陷或發(fā)酵停滯和減緩[16]，會降低葡萄酒品質(zhì)，這種負面影響也需要進行研究控制。

非釀酒酵母嗜殺毒素相比S. cerevisiae具有較寬的嗜殺譜[20-21]，最早在1975年Philliskirk等[22]報道的非釀酒酵母中，包括6 種酵母屬：Debaryomyces、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Candida和Torulopsis。Kluyveromyces wickerhamii、異常畢赤酵母（Pichia anomala）、膜璞畢赤酵母（Pichia membranifaciensand）[20,23]和絲狀真菌Ustilago maydis分泌的嗜殺毒素KwKt、PiKt、PMKT2和KP6表現(xiàn)出對酒香酵母和德克酵母的抑制性[6]。另有報道表明，Tetrapisispora phaff i i和P. membranifaciens非S. cerevisiae產(chǎn)生的嗜殺毒素分別能致死Hanseniaspora uvarum[24]和白假絲酵母（C. albicans）[25]；Pichia產(chǎn)生的嗜殺毒素能致死Rhodotorula graminis、Rhodotorula mucilaginosa和Schizosaccharomyces pombe[11]；Torulaspora delbrueckii產(chǎn)生一種新的嗜殺毒素Kbarr-1，不僅可以致死所有已知的S. cerevisiae，還可以致死Hanseniaspora sp.、Kluyveromyceslactis、Schizosaccharomycespombe、C. albicans、C. tropicalis、C. dubliniensis、C. kefir、C. glabrata、C. parasilopsis、C. krusei、Yarrowia lipolytica和Hansenula mrakii[18]。因此，利用嗜殺毒素來抑制葡萄酒中的不良微生物已進入應用研究階段。培養(yǎng)條件如培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基pH值、接種量和培養(yǎng)溫度對菌株的嗜殺活性具有一定的影響[26]。

本研究利用分離自新疆樓蘭葡萄酒廠赤霞珠、品麗珠、蛇龍珠混合發(fā)酵的嗜殺性野生C. albicans LFA418，進行嗜殺菌株的產(chǎn)毒條件及其粗毒素的特性研究，以期為采用生物控制葡萄酒不良酵母的抑制提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

C. albicans LFA418分離自新疆樓蘭葡萄酒廠，赤霞珠、品麗珠、蛇龍珠的混合發(fā)酵；敏感菌株S. cerevisiae 1296為西北農(nóng)林科技大學食品學院羅安偉副教授饋贈。敏感菌株酒酒球菌（Oenococcus oeni）SD-2a為西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院李華教授實驗室饋贈。其他29 株敏感菌株均來自本實驗室，見表1。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

酵母基礎培養(yǎng)基（yeast extract protein dextrose，YEPD）[27]：2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母浸粉，蒸餾水配制，121 ℃高壓滅菌20 min。YEPD-亞甲基藍（methylene blue，MB）培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)基用0.2 mol/L磷酸檸檬酸緩沖溶液調(diào)pH 4.6，加2%瓊脂、0.003% MB，121 ℃高壓滅菌20 min。

YNBGS培養(yǎng)基[28]：0.2%葡萄糖、0.67%無氮源酵母浸粉、0.5% (NH4)2SO4、0.25% MgSO4?7H2O，121 ℃高壓滅菌20 min。

磷酸-檸檬酸緩沖液：0.2 mol/L磷酸氫二鈉和0.1 mol/L檸檬酸溶液按不同體積混合。

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）美國Sigma公司；葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

MJX型智能霉菌培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；SW-CJ-1F凈化工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；UV-2450紫外分光光度計 日本Shimadzu公司；pHS-3C型精密pH計 上海雷磁儀器廠；Bradford蛋白濃度測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

將－20 ℃保藏的純種菌株接種20 μL于滅菌冷卻后的YEPD培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)24～48 h，待用。

1.3.2 透析袋使用處理

剪透析袋為小段（10～20 cm），用2%碳酸氫鈉和1 mmol/L EDTA（pH 8.0）混合液袋煮沸10 min，蒸餾水清洗。再用1 mmol/L EDTA（pH 8.0）煮沸10 min。冷卻后，4 ℃保存。

1.3.3 C. albicans LFA418嗜殺活性的測定及廣譜性實驗

嗜殺活性的測試采用牛津杯法[29]：將100 μL敏感菌株S. cerevisiae 1296接種至YEPD-MB培養(yǎng)基，均勻涂布（涂布濃度106CFU/mL）。30 min后，YEPD-MB瓊脂平板上放置牛津杯（10 mm×8 mm外徑），吸取200 μL待測菌液上清液或嗜殺毒素加入到牛津杯中，25 ℃培養(yǎng)48 h。若待測菌為嗜殺菌株，則嗜殺性菌株被一個明確的區(qū)域包圍，其周圍會形成抑菌圈和藍色的死菌帶，用游標卡尺測量抑制圈直徑的大小。菌株的廣譜性實驗采用點樣法[30]，共30 種不同的敏感菌株。嗜殺毒素的活性用抑菌圈（抑菌圈最外面的直徑減去牛津杯的直徑）表示，10 mm的抑菌圈相當于嗜殺毒素產(chǎn)生的活性為10 U[31]。

1.3.4 C. albicans LFA418培養(yǎng)條件

1.3.4.1 培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間對C. albicans LFA418嗜殺活性的影響

分別接種C. albicans LFA418（菌體濃度106CFU/mL）至100 mL的YEPD液體培養(yǎng)基和100 mL YNBGS液體培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)64 h，每隔8 h取樣一次，測定OD560nm值，并在YEPD-MB培養(yǎng)基上涂布1296敏感菌株，在平板上放置牛津杯，加入200 μL培養(yǎng)液到牛津杯中，25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用游標卡尺測量抑制圈直徑的大小，測定C. albicans LFA418的嗜殺活性。

1.3.4.2 接種量對C. albicans LFA418嗜殺性的影響

接種C. albicans LFA418到YEPD液體培養(yǎng)基中，接種量分別為5%、6%、7%、8%、9%和10%，25 ℃培養(yǎng)24 h，牛津杯法測定C. albicans LFA418嗜殺活性。

1.3.4.3 培養(yǎng)基pH值對C. albicans LFA418嗜殺活性的影響

配制不同pH值（3.6、4.0、4.4、4.8、5.2）的YEPD液體培養(yǎng)基，接種C. albicans LFA418，25 ℃培養(yǎng)48 h，牛津杯法測定C. albicans LFA418嗜殺活性。

1.3.4.4 溫度對菌株嗜殺活性的影響

將28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)的純化菌株接種8 μL到YEPD-MB鑒定培養(yǎng)基中，分別于18、22、25 ℃和28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，牛津杯法測定C. albicans LFA418的嗜殺活性。

1.3.5 粗毒素的制備和提取[32]

1.3.5.1 粗毒素制備

供試嗜殺酵母菌株按最佳接種量接種到YEPD液體培養(yǎng)基，檸檬酸-磷酸緩沖溶液調(diào)節(jié)至最適pH值，放置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)32 h，4 ℃、5 000 r/min離心10 min除去酵母細胞，獲得無細胞上清液。

1.3.5.2 粗毒素的提取

用0.22 μm濾膜4 ℃過濾上清液，再經(jīng)80%過飽和的硫酸銨溶液沉淀過夜，4 ℃、8 000 r/min離心20 min得沉淀物。用20 mmol/L檸檬酸-磷酸緩沖液2 mL溶解沉淀，4 ℃用透析袋（分子質(zhì)量為8 000 D）進行透析。無菌條件下，0.45 μm濾膜過濾，得嗜殺粗毒素，保存在－20 ℃冰箱備用。

1.3.5.3 嗜殺毒素含量測定

采用Bradford法，將待測嗜殺毒素稀釋5 倍，經(jīng)考馬斯亮藍G-250染色，反應3 min，測OD595nm值。利用標準蛋白BSA測OD595nm制得標準曲線（y=2.040 5x，R2= 0.990 3），其中x表示蛋白質(zhì)量濃度，y表示OD595nm。

1.3.6 粗毒素的穩(wěn)定性[29]

1.3.6.1 粗毒素的pH值穩(wěn)定性

將200 μL嗜殺毒素用20 mmol/L檸檬酸-磷酸緩沖溶液（pH 4.0）稀釋至2 mL，用20 mmol/L檸檬酸-磷酸緩沖溶液（pH 2.2、8.0）調(diào)pH值分別為3.0、3.4、3.8、4.2、4.6、5.0、5.4、6.0、7.0，分別在－20、4、30 ℃條件下放置，24 h后，調(diào)pH 4.2，牛津杯法測嗜殺毒素的活性，測得的粗毒素嗜殺活性與處理前的百分比為相對嗜殺活性。

1.3.6.2 粗毒素的溫度穩(wěn)定性

將1 mL嗜殺毒素用20 mmol/L檸檬酸-磷酸緩沖溶液稀釋至2 mL，調(diào)pH 4.2，分別在4、20、30、40 ℃溫度條件下培養(yǎng)4 h，每隔30 min取樣1 次，測定嗜殺毒素的活性，0 min的粗蛋白活性作為對照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 C. albicans LFA418的嗜殺特征

2.1.1 C. albicans LFA418的嗜殺性

C. albicans LFA418培養(yǎng)液在YEPD-MB瓊脂平板上培養(yǎng)48 h，嗜殺敏感菌株1296在菌落的周圍出現(xiàn)明顯抑菌圈，見圖1。

圖1 C. albicans LFA418在YEPD-MB瓊脂板上的抑菌圈Fig.1 Inhibition zone caused by C. albicans LFA418 in YEPD-MB agar

2.1.2 菌株C. albicans LFA418的廣譜性

利用27 株不同種的酵母菌、1 株霉菌、1 株乳酸菌（酒酒球菌）和1 株大腸桿菌進行了C. albicans LFA418的嗜殺廣譜性實驗（表1），結果表明，其可以致死P. kluyveri、S. bayanus、L. thermotolerans和C. lusitaniae共4 種敏感菌株。

表1 菌株LFA418對30 種敏感菌株的嗜殺譜Table1 Broad-spectrumof killing activities of LFA418 against 30 kinds of sensitive strains

2.2 培養(yǎng)條件對C. albicans LFA418嗜殺活性的影響

2.2.1 培養(yǎng)基對C. albicans LFA418生長的影響

圖2 菌株LFA418在YEPD和YNBGS培養(yǎng)基中的生長曲線（a）和pH值變化曲線（bb）Fig.2 Growth curves and pH changes of C. albicans LFA418 cultivated in YEPD and YNBGS media

C. albicans LFA418在YEPD和YNBGS培養(yǎng)基中均可生長，生長趨勢大致相同（圖2a），8 h之前為延滯期，8～16 h處于菌體生長的調(diào)整期，16～32 h為菌體生長對數(shù)期，32～48 h處于穩(wěn)定期，48 h后為菌體生長的衰亡期。但在32 h后菌株在YEPD培養(yǎng)基中的生長情況明顯優(yōu)于YNBGS培養(yǎng)基。由此可見，YEPD培養(yǎng)基較適于C. albicans LFA418的培養(yǎng)。C. albicans LFA418的發(fā)酵過程中，YEPD培養(yǎng)基pH值從5.46到4.68有極少的減少，而YNBGS培養(yǎng)基的pH值從4.41到2.61減少幅度較大，在24 h后進入平穩(wěn)期（圖2b）。

2.2.2 C. albicans LFA418培養(yǎng)時間對嗜殺活性的影響

圖3 培養(yǎng)時間對嗜殺活性的影響Fig.3 Effect on the killer activities of killer strains for different growing times

由圖3可知，隨著C. albicans LFA418培養(yǎng)時間的延長，其嗜殺活性增強。當培養(yǎng)時間達到24 h時，嗜殺活性呈現(xiàn)最大，在隨后24～48 h內(nèi)，嗜殺活性相對穩(wěn)定，48 h后嗜殺活性快速降低。C. albicans LFA418經(jīng)YEPD培養(yǎng)比經(jīng)YNBGS培養(yǎng)所獲得的嗜殺活性更強，說明YEPD培養(yǎng)基更適于制備嗜殺毒素。

2.2.3 接種量、pH值和溫度對嗜殺活性的影響

表2 不同接種量酵母菌株LFA418的嗜殺活性Table2 Killer toxin activity on the killer yeast at different inoculums

表3 在不同pH值條件下酵母菌株LFA418的嗜殺活性Table3 Killer toxin activity on the killer yeast at different pH values

表4 在不同溫度條件下酵母菌株LFA418的抑菌圈的大小Table4 Killer toxin activity on the killer yeast at different temperatures

分別將接種量為5%、6%、7%、8%、9%和10%的C. albicans LFA418培養(yǎng)液，裝入置于檢測平板的牛津杯中，檢測其嗜殺活性，結果顯示在接種量為7%時，抑菌圈直徑最大，嗜殺活性最強（表2）。C. albicansLFA418的嗜殺活性在pH值為4.4最強（表3）。C. albicans LFA418在溫度分別為15～30 ℃培養(yǎng)條件下，25 ℃時抑菌圈直徑最大，即其嗜殺活性最強（表4）。

2.3 嗜殺毒素的特性

2.3.1 嗜殺毒素的嗜殺性

圖4 C. albicans LFA418嗜殺毒素在YEPD-MB瓊脂板上的抑菌圈Fig.4 Inhibition zone caused by C. albicans LFA418 killer toxin in YEPDMB agar

利用Bradford法測定蛋白測得C. albicans LFA418粗毒素的蛋白質(zhì)量濃度為1.345 mg/mL。由圖4可知，C. albicans LFA418嗜殺粗毒素對敏感菌株1296具有嗜殺活性。

2.3.2 嗜殺粗毒素的穩(wěn)定性

2.3.2.1 pH值對粗毒素嗜殺活性的影響

圖5 pH值對C. albicans LFA418嗜殺粗毒素的穩(wěn)定性Fig.5 Effect of pH values on stability of C. albicans LFA418 killer crude toxin

由圖5可知，pH 3.0 時，在－20 ℃和30 ℃條件下，相對嗜殺活性分別為7.2%和8.0%，而在4 ℃條件下，相對嗜殺活性為23.7%；隨著pH值升高，3 個溫度條件下的相對嗜殺活性也逐漸增加。pH 4.2時，－20 ℃和30 ℃條件下的相對嗜殺活性達到最大，分別為97.9%和55.5%，隨后隨著pH值的進一步升高，相對嗜殺活性快速下降。pH 4.6時，4 ℃條件下的相對嗜殺活性最大，達到100%。另外發(fā)現(xiàn)，在4 ℃、pH 7.0時，雖然粗毒素活性相對極弱，但仍具有活性。

2.3.2.2 溫度對粗毒素嗜殺活性的影響

圖6 溫度對C. albicans LFA418嗜殺粗毒素的穩(wěn)定性Fig.6 Effects of temperatures on stability of C. albicans LFA418 killer crude toxin

由圖6可知，在4 ℃和20 ℃條件下放置3 h后，C. albicans LFA418粗毒素具有嗜殺活性的穩(wěn)定性。粗毒素在30 ℃條件下放置0.5 h后，嗜殺活性開始減弱，2 h后減弱到70%，3 h后急劇減少到30%。40 ℃時隨著時間的變化，嗜殺活性一直在減弱，3.0 h后粗毒素失活。

3 討 論

對C. albicans LFA418發(fā)酵的培養(yǎng)基進行實驗，發(fā)現(xiàn)在YEPD液體培養(yǎng)中，菌株的嗜殺活性比在YNBGS液體培養(yǎng)基中強，與Mehlomakulu等[23]報道C. pyralidae嗜殺毒素在YEPD中或葡萄汁中添加1%酵母浸粉，嗜殺活性強的結果相同。據(jù)報道，由于存在大量的細胞壁β-D-葡聚糖嗜殺毒素受體和抑制嗜殺活性的蛋白，酵母浸粉具有增強嗜殺活性的能力[33]。YEPD中含1%的酵母浸粉，而YNBGS培養(yǎng)基中的酵母浸粉為0.67%無氮源的酵母浸粉，這證實了以前的結果。

研究發(fā)現(xiàn)一個有趣的現(xiàn)象，C. albicans LFA418的發(fā)酵過程中，2 種培養(yǎng)基中pH值均出現(xiàn)較大幅度的降低，YEPD培養(yǎng)基pH值從5.46降低到4.68，YNBGS培養(yǎng)基的pH值從4.41降低到2.61（圖2b）。目前市面上已經(jīng)有增酸的商業(yè)酵母，可以在葡萄酒生產(chǎn)過程中減少酒石酸的添加而來提高葡萄酒的酸度。因此，C. albicans LFA418在發(fā)酵過程中引起酸度的增加，具有進一步研究利用的價值。Park等[34]研究表明培養(yǎng)基pH值的改變主要取決于培養(yǎng)基中酵母浸粉與葡萄糖的比例。Ahmad等[35]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基pH值的改變受氮源的影響比碳源的影響大，當將硫酸銨作為氮源時，所有的豇豆根瘤菌菌株產(chǎn)酸。當酵母浸粉作為氮源，發(fā)現(xiàn)異源型的酸/堿產(chǎn)物。YNBGS培養(yǎng)基中氮源與碳源的比例大于YEPD培養(yǎng)基，因此可能是菌株引起YNBGS培養(yǎng)基pH值的降低幅度比在YEPD中大的一個原因。本研究中C. albicans LFA418產(chǎn)生嗜殺毒素使得酵母發(fā)酵底液的pH值發(fā)生大的變化，這可能與菌株發(fā)酵過程中碳源和氮源的消耗有關，也可能與菌株細胞或嗜殺機制有關。

嗜殺活性與pH值之間具有相互關系[1]，大多研究表明嗜殺酵母產(chǎn)生的嗜殺毒素在一個比較窄的pH值范圍，嗜殺毒素最適的嗜殺pH值一般在4.1～4.7[36]。從D. hansenii產(chǎn)生的毒素最適pH值為4.5，Kluyveromyces phaffi和Pichia都有相似的結果[37]。而其他一些研究發(fā)現(xiàn)嗜殺毒素具有一個廣泛的pH值范圍2.0～11.0[38-39]。C. albicans LFA418分泌的粗毒素在pH 4.6時嗜殺活性最強，與Buzzini等[2]報道Candida maltosa產(chǎn)生的粗毒素在pH 4.5具有良好的嗜殺活性相似。

4 結 論

本研究通過對嗜殺性的野生酵母 C.albicans LFA418進行廣譜性實驗，發(fā)現(xiàn)菌株LFA418具有致死葡萄酒敗壞酵母克魯維畢赤酵母P. kluyveri、貝酵母S. uvarum、L. thermotolerans和葡萄牙假絲酵母C. lusitaniae的嗜殺性。

對C. albicans LFA418分泌嗜殺毒素的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，結果表明，選用YEPD為發(fā)酵C. albicans LFA418制備毒素的培養(yǎng)基，接種7%的嗜殺酵母到YEPD液體培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)32 h，得到最大產(chǎn)量的嗜殺毒素。

研究C. albicans LFA418粗毒素的特性，結果表明，C. albicans LFA418分泌的粗毒素在溫度分別－20、4℃時pH 4.2～4.6和pH 4.2時溫度4～20 ℃具有嗜殺活性的穩(wěn)定性。所有酵母的嗜殺毒素本質(zhì)都是蛋白質(zhì)，在pH 3～6的酸性條件下具有嗜殺活性，在溫度高于25 ℃失活。

目前國內(nèi)外雖然有報道假絲酵母屬具有嗜殺活性，但極少關于葡萄酒中分離的C. albicans嗜殺活性及嗜殺粗蛋白性質(zhì)的報道。本研究在國內(nèi)報道了C. albicans LFA418的嗜殺廣譜性、產(chǎn)毒條件及其嗜殺毒素的特性。綜合來看，C. albicans LFA418菌株是一株新的具有潛力的生物抗菌劑來源菌株。

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Optimization of Culture Conditions for Toxin Production by Wild Killer Yeast Candida albicans LFA418

LI Li1, FENG Li1, QIN Yi1,2, YE Dongqing1, SONG Yuyang1,2,*, LIU Yanlin1,2,*
(1. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Shaanxi Engineering Research Center for Wine and Viticulture, Yangling 712100, China)

The killer property Candida albicans LFA418, a wild strain isolated from a winery in Loulan of Northwest China’s Xinjiang region. The killer feature and crude killer toxin characteristics of a wild yeast strain Candida albicans isolated from Loulan winery of Xinjiang were studied. The results indicated that Candida albicans LFA418 had a wide spectrum of killering activity against Pichia kluyveri, Saccharomyces bayanus, Lachancea thermotolerans and Candida lusitaniae. The optimal culture conditions to obtain the maximum yield of killer toxins were as follows： inoculums of C. albicans LFA418, 7% (V/ V); temperature, 25 ℃, and culture time, 32 h. The activity of crude killer toxins was stable at pH 4.2-4.6 when temperature was -20 ℃ and4 ℃ and temperature 4-20 ℃ at pH 4.2.

killer yeast; killer toxin; Candida albicans

10.7506/spkx1002-6630-201712008

TS261.1

A

1002-6630（2017）12-0050-07

李麗, 馮莉, 秦義, 等. 野生嗜殺白假絲酵母LFA418的產(chǎn)毒條件優(yōu)化及其毒素粗提物特性[J]. 食品科學, 2017, 38(12)： 50-56.

10.7506/spkx1002-6630-201712008. http：//www.spkx.net.cn

LI Li, FENG Li, QIN Yi, et al. Optimization of culture conditions for toxin production by wild killer yeast Candida albicans LFA418[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 50-56. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712008. http：//www.spkx.net.cn

2016-12-18

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（葡萄）產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項（CARS-30-jg-3）；國家自然科學基金面上項目（31571812）

李麗（1984—）女，博士研究生，研究方向為釀酒微生物。E-mail：286928693@qq.com

*通信作者：宋育陽（1983—），女，講師，博士，研究方向為葡萄酒微生物學。E-mail：308573616@qq.com劉延琳（1966—），女，教授，博士，研究方向為葡萄酒及釀酒微生物。E-mail：yanlinliu@nwsuaf.edu.cn