雙齒圍沙蠶多肽的制備及其抗肺癌A549細胞活性

賈盈露，丁國芳,2,*，楊最素，余方苗，鄭媛媛，吳宗澤，陳 銳

（1.浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院，浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術(shù)研究中心，浙江 舟山 316022；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316021）

雙齒圍沙蠶多肽的制備及其抗肺癌A549細胞活性

賈盈露1，丁國芳1,2,*，楊最素1，余方苗1，鄭媛媛1，吳宗澤1，陳 銳1

（1.浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院，浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術(shù)研究中心，浙江 舟山 316022；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316021）

探討雙齒圍沙蠶酶解多肽制備的關(guān)鍵技術(shù)及其對肺癌A549細胞的作用。以增殖抑制率為指標，確定最佳酶種并根據(jù)單因素試驗和正交試驗確定其最佳酶解工藝。經(jīng)超濾獲得1～3 ku的酶解液，通過陰離子色譜、凝膠過濾色譜和制備色譜對其進行進一步的分離純化。采用四甲基偶氮唑藍法測定沙蠶多肽PAP對肺癌A549細胞的增殖抑制率并通過倒置顯微鏡、吖啶橙/溴化乙錠熒光染色及Hoechst熒光染色觀察其細胞形態(tài)的變化。實驗結(jié)果表明最佳酶種是堿性蛋白酶，其最佳酶解條件為：酶解溫度50 ℃、pH 11、料液比1∶1（g/mL）、酶解時間6 h、加酶量300 U/ g。經(jīng)純化獲得的多肽命名為PAP，其氨基酸序列為Ile-Glu-Pro-Gly-Thr-Val-Gly-Met-Met-Phe，且PAP對A549細胞的作用呈時間與劑量依賴關(guān)系，作用后細胞出現(xiàn)了凋亡的形態(tài)學特征。因此，PAP能明顯抑制肺癌細胞A549增殖，可以誘導其發(fā)生凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。

雙齒圍沙蠶；多肽；抗腫瘤；A549細胞；細胞凋亡

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率、死亡率逐年上升，已成為腫瘤相關(guān)死亡的首要病因[1]。肺癌約80%是非小細胞肺癌，在晚期肺癌中的比例達到總數(shù)的40%～50%[2]。目前對于非小細胞肺癌的治療早期是手術(shù)切除，晚期主要是化療，但化療的毒副作用及產(chǎn)生的耐藥性，影響治療的有效性，因此尋找精準治療是熱門話題。海洋是一個巨大的藥物寶庫，從海洋中尋找活性物質(zhì)已成為熱點，從中分離獲得的多種活性物質(zhì)，如肽類、多糖、生物堿、萜類、大環(huán)內(nèi)酯等，有望開發(fā)成新型的抗腫瘤藥物[3]，如從海兔獲得的dolastatin 10已進入臨床實驗[4]。

沙蠶（Nereis）屬于環(huán)節(jié)動物門（Annelida）多毛綱（Polychaeta）沙蠶科（Nereididae），又稱為海蟲、海蜈蚣、海螞蟥等，其生物資源豐富，廣泛分布在我國沿海地區(qū)，近年來人工養(yǎng)殖用于鉤魚的誘餌。沙蠶是一種傳統(tǒng)的海洋中藥，有清熱解毒、消腫止痛、斂瘡生肌、治療癰瘡腫毒等功效[7]。學者們從沙蠶體內(nèi)獲得了具有良好藥理活性的物質(zhì)。已有研究[8-11]從日本刺沙蠶體內(nèi)分離出一種沙蠶絲氨酸蛋白酶，該蛋白酶抑制血小板聚集，改變血液流變學特性，可作為降纖和溶栓藥物，預防和治療心、腦梗塞，腦動脈、肺動脈血栓形成等疾?。煌瑫r沙蠶蛋白酶ASP表現(xiàn)出對白血病細胞、肺癌SPC-A-1細胞較強的抗腫瘤活性[12-16]。然而沙蠶酶解多肽的研究較少，對非小細胞肺癌A549細胞的抑制活性目前鮮見報道，本實驗以沙蠶為實驗材料，探討酶解多肽的制備及體外抗A549細胞的增殖活性，為開發(fā)沙蠶的藥用價值提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與試劑

沙蠶購于舟山市水產(chǎn)養(yǎng)殖場，經(jīng)浙江海洋大學趙盛龍教授鑒定為雙齒圍沙蠶（Perinereies aibuhitensis），鮮活購買后待用。

胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶 北京亞太恒信生物科技有限公司；胎牛血清 杭州四季青生物工程有限公司；1640粉末培養(yǎng)基 美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 細胞

人肺癌A549細胞株購自中科院上海細胞庫，由本實驗室傳代培養(yǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-1組織搗碎機 上海標準模型廠；GF16RXII高速低溫離心機 日本Hitachi公司；ALPHA 1-4/LDplus型冷凍干燥機 德國Christ公司；WRO-70型超純水儀 美國Millipore公司；BSA124S型電子天平 德國Satorius AG公司；ZHJH-C1209C型超凈工作臺 上海智誠分析儀器制造公司；Forma3111型CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；酶標儀 美國Bio-Rad公司；BX2-FLB3熒光顯微鏡、CCD-NC6051顯微攝像 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 沙蠶酶解液制備工藝優(yōu)化及多肽分離純化

1.3.1.1 最佳酶種的選擇

將沙蠶洗凈后勻漿，分別取10.0 g勻漿樣品參照文獻[17-20]確定胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶這5 種酶的酶解溫度及pH值進行酶解（酶解條件見表1），固定條件為：加酶量300 U/g、料液比1∶1（g/mL）、酶解時間4 h。結(jié)束后在100 ℃水浴中滅活10 min，12 000 r/min冷凍離心15 min后得上清液，采用MTT法測定對A549細胞的增殖抑制率（inhibition rate，IR），獲得最佳酶種。

表1 蛋白酶的最適酶解溫度和pH值Table1 Optimum temperature and pH for the enzymes

1.3.1.2 酶解條件優(yōu)化

選用最佳蛋白酶進行酶解實驗，通過單因素試驗考察酶解溫度、酶解pH值、料液比、酶解時間和加酶量5 個因素對水解度[21-23]的影響，單因素試驗設(shè)計見表2，固定條件為酶解溫度45.0 ℃、pH 10、料液比1∶1、酶解時間4 h、加酶量300 U/g。氨基氮含量（amino nitrogen content，ANN）與水解度成正相關(guān)，采用甲醛電位滴定法測定氨基氮含量。

表2 單因素試驗因素與水平設(shè)計Table2 Factors and their coded levels and actual values used in one-factor-atatime experiments

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用正交試驗以酶解溫度、酶解pH值、料液比、酶解時間和加酶量5 個因素，以IR值為指標，確定最佳的酶解條件。

1.3.1.3 沙蠶多肽的超濾分離

酶解上清液用超濾膜進行分離，得到小于1、1～3、3～5、5～8、大于8 ku的酶解液，分別命名為PAP-1、PAP-2、PAP-3、PAP-4和PAP-5。將以上組分收集冷凍干燥后，以MTT法檢測當組分質(zhì)量濃度分別為2 000 mg/L和4 000 mg/L時，作用于A549細胞24 h后的IR，得到活性最高的組分，進行下一步的分離。

1.3.1.4 沙蠶多肽DEAE Sepharose Fast Flow層析分離

將超濾組分通過DEAE Sepharose Fast Flow進一步分離，樣品質(zhì)量濃度為0.25 g/mL，離心取上清液，過0.22 μm濾膜濾后進行洗脫。分離條件：柱尺寸3.6 cm×15 cm；填料為瓊脂糖凝膠DEAE Sepharose FF；柱料顆粒直徑45～165 μm；上樣量2 mL；洗脫液為0～1 mol/L NaCl溶液；洗脫方式為梯度洗脫，每個濃度洗脫一個柱體積；流速5 mL/min；檢測波長280 nm；收集體積為5 mL/管。收集各峰，濃縮冷凍干燥，通過MTT法選出活性較好峰組分進一步分離。

1.3.1.5 沙蠶多肽葡聚糖凝膠Sephadex G-25層析分離

將上步中收集到的IR最高的組分通過Sephadex G-25柱進一步分離純化，樣品質(zhì)量濃度為0.2 g/mL，離心取上清液，過0.22 μm濾膜濾后進行洗脫。分離條件：柱尺寸2.6 cm×60 cm；填料為葡聚糖凝膠G-25；柱料顆粒直徑50～150 μm；上樣量2 mL；洗脫液為蒸餾水；流速1.1 mL/min；檢測波長280 nm；收集體積為3.5 mL/管。收集各峰，濃縮冷凍干燥，通過MTT法選出活性較好峰組分進一步分離。

1.3.1.6 高效液相分離純化

將抑制A549細胞增殖最強的收集峰分進一步的分離純化，色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18分析型色譜柱（9.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長280 nm；流速0.5 mL/min；流動相A為乙腈（含0.05%三氟乙酸），流動相B為超純水（含0.05%三氟乙酸），采用梯度洗脫方式（20%～100% A洗脫5～20 min）；柱溫25 ℃；自動進樣，進樣量100 μL。收集活性最高組分，冷凍干燥，測定氨基酸序列。

1.3.1.7 目標肽的N端測序

由北京億譜生物技術(shù)有限公司完成蛋白質(zhì)的N端序列檢測工作，測序儀器為PPSQ-31A蛋白自動測序儀。最終以PAP命名該活性多肽。

1.3.2 細胞培養(yǎng)

將A549細胞在含有雙抗溶液（青霉素G 100 IU/mL、鏈霉素100 IU/mL）以及10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育，待長滿80%以上時用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代，取處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3.3 抗肺癌A549細胞活性檢測

1.3.3.1 MTT法測定細胞增殖抑制活性

將A549細胞以1×105個/mL細胞數(shù)接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔培養(yǎng)液200 μL常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h后，去培養(yǎng)液后，設(shè)空白對照組和用藥組（PAP質(zhì)量濃度為1 000、2 000、4 000 mg/L），作用規(guī)定時間后棄液，加含有10% MTT的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS），孵育4 h后，實驗畢棄液，加入150 μL的DMSO充分振蕩。酶標儀在490 nm波長處測定吸光度，按以下公式計算細胞IR值，并用SPSS計算半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

式中：A1為空白對照組的吸光度；A2為用藥組的吸光度。

1.3.3.2 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)

將泡酸處理的蓋玻片放入96 孔板中，接種密度為1×105個/mL的A549細胞，常規(guī)培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)液，設(shè)空白對照組和藥物組（藥物質(zhì)量濃度分別為1 000、2 000、4 000 mg/L），培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3.3 AO/EB熒光染色觀察細胞形態(tài)

細胞接種與實驗分組同1.3.3.2節(jié)。24 h后，取蓋玻片，PBS（pH 7.2）洗2～3 次，用95%乙醇溶液固定30 min，進行吖啶橙/溴化乙錠（acridine orange/ethidium bromide，AO/EB）染色觀察。觀察前于載玻片上滴加50 μL PBS和6 μL AO/EB混合液，有細胞的一面朝下，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3.4 Hoechst 33258染色觀察細胞形態(tài)

細胞接種與實驗分組同1.3.3.2節(jié)。24 h后，取蓋玻片，用4%多聚甲醛固定20 min，PBS沖洗2 次，用Hoechst33258熒光染液（0.5～10 μg/mL）常溫染色15 min，PBS清洗2 次后在熒 光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 沙蠶多肽酶解工藝優(yōu)化

2.1.15 種酶的酶解結(jié)果

圖1 5 種蛋白酶解物對A549細胞的IR值Fig.1 Inhibitory percentages against A549 cells of hydrolysates with five different enzymes

從圖1可知，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶5 種蛋白酶解物對A549細胞IR值分別為56.67%、46.29%、62.07%、47.78%、60.51%，其活性大小順序為：堿性蛋白酶＞胃蛋白酶＞胰蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶。根據(jù)細胞IR大小選定堿性蛋白酶進行下一步的篩選實驗。

2.1.2 單因素試驗結(jié)果

圖2 酶解溫度對ANN含量的影響Fig.2 Influence of temperature on ANN

由圖2可知，溫度35～45 ℃范圍內(nèi)，ANN含量隨溫度升高而增加，當達到酶最佳酶解溫度45 ℃時達到最大，達到9.20 mg/g。當溫度繼續(xù)升高，酶活性下降明顯，ANN含量下降到5.95 mg/g。故溫度45 ℃為最佳。

由圖3可知，ANN含量隨pH值升高而增加，當達到堿性蛋白酶最佳酶解pH值時達到最大，pH 12時，ANN含量開始下降。因此選擇pH值為11。

圖3 pH值對ANN含量的影響Fig.3 Influence of pH on ANN

圖4 料液比對ANN含量的影響Fig.4 Influence of solid-to-liquid ratio on ANN

由圖4可知，隨酶解液溶劑用量的增加，ANN含量隨之下降。沙蠶體內(nèi)含水量較大，當料液比為1∶1時，堿性蛋白酶即達到最佳酶解效果，而隨溶劑用量增加，ANN含量下降，因此選擇料液比為1∶1。

圖5 酶解時間對ANN含量的影響Fig.5 Influence of hydrolysis time on ANN

由圖5可知，隨酶解時間的延長，ANN含量隨之增加，到8 h時達到6.83 mg/g，酶解時間繼續(xù)增加，ANN增加趨于平穩(wěn)，因此，選擇酶解時間為8 h。

圖6 加酶量對ANN含量的影響Fig.6 Influence of enzyme dosage on ANN

由圖6可知，加酶量由300 U/g增加至600 U/g時，ANN含量略有增加，之后加酶量增加，ANN含量則下降，因此選擇600 U/g。

2.1.3 正交試驗結(jié)果

表3 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table3 Orthogonal array design in terms of experimental and coded data with response values

以酶解溫度、酶解pH值、料液比、酶解時間和加酶量為因素，在不同酶解條件下檢測IR，其結(jié)果如表3所示。利用極差法分析得到影響IR的各因素主次關(guān)系為：C＞E＞A＞B＞D。對于IR影響最大的因素是C（料液比）；此時的最佳酶解條件為A4B4C1D3E1，即酶解溫度50 ℃、酶解pH 11、料液比1∶1、酶解時間6 h、加酶量300 U/g。每個試驗重復3 次，得到的結(jié)果均為此組合效果最好。在此條件下進行驗證實驗，8 000 mg/L酶解產(chǎn)物對A549的IR為（97.42±0.83）%，為最優(yōu)實驗結(jié)果。

2.2 沙蠶多肽的分離純化

2.2.1 沙蠶多肽的超濾截留

圖7 不同分子質(zhì)量的沙蠶多肽對A549細胞增殖的影響Fig.7 Effects of hydrolates with different molecular weights on the growth of A549 cells

將堿性蛋白酶解獲得的沙蠶多肽經(jīng)超濾得到5 個組分PAP-1、PAP-2、PAP-3、PAP-4和PAP-5，得率分別為0.36%、1.76%、1.24%、0.72%和0.6%。采用MTT法得到對A549細胞的IR值，結(jié)果如圖7所示，PAP-2組分的IR值最高。

2.2.2 DEAE Sepharose Fast Flow分離結(jié)果

將上述步驟得到的PAP-2經(jīng)DEAE分離得到PAP-2-1、PAP-2-2、PAP-2-3和PAP-2-4四個洗脫峰如圖8所示。

圖8 陰離子DEAE Sepharose Fast Flow洗脫峰Fig.8 Elution peaks on DEAE Sepharose Fast Flow

圖9 陰離子分離組分對A549細胞增殖的作用Fig.9 Effects of different fractions from DEAE Sepharose Fast Flow chromatography on the growth of A549 cells

由圖9可知，以2 000 mg/L的質(zhì)量濃度作用于A549細胞24 h后的IR分別為（14.1±2.7）%、（24.3±3.0）%、（41.9±1.5）%和（46.7±5.0）%；4 000 mg/L時對A549細胞的IR值則為（28.0±3.0）%、（49.6±2.2）%、（79.3±4.1）%、（77.3±1.8）%。綜合故選定PAP-2-3進行進一步分離純化。

2.2.3 Sephadex G-25分離結(jié)果

圖10 葡聚糖凝膠柱洗脫峰Fig.10 Elution peaks on Sephadex G-25

由圖10可知，將上述步驟得到的PAP-2-3經(jīng)Sephadex G-25分離得到PAP-2-3-1、PAP-2-3-2兩個洗脫峰。

圖11 凝膠柱分離組分對A549細胞增殖的作用Fig.11 Effects of different fractions from Sephadex G-25 chromatography on the growth of A549 cells

由圖11可知，當質(zhì)量濃度為1 000 mg/L時，PAP-2-3-1和AP-2-3-2對細胞的IR值分別是（48.2±3.3）%、（74.4±2.4）%；2 000 mg/L時，IR值分別為（75.9±2.1）%、（95.1±1.8）%。PAP-2-3-2的活性最高，故用高效液相色譜儀將峰PAP-2-3-2進一步分離純化。

2.2.4 活性肽的純化及其N端氨基酸檢測結(jié)果

圖12 高效液相色譜柱洗脫峰Fig.12 RP-HPLC elution peaks

PAP-2-3-2經(jīng)高效液相色譜洗脫純化，當洗脫時間分別為：4.296、4.584、4.968、5.602、6.075 min時，出現(xiàn)如圖12所示的5 個洗脫峰（Ⅰ～Ⅴ）。由于峰Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ產(chǎn)率不高，多次收集后仍然很少，因此未進行進一步的收集；峰V產(chǎn)率較高，收集并進行凍干，命名為PAPH。測定800 mg/L PAPH作用于A549細胞24 h后的IR值為（78.3±1.5）%。

圖13 PAP經(jīng)高效液相色譜洗脫圖Fig.13 Elution peaks of PAP by HPLC

由圖13可知，在280 nm檢測波長處，保留時間為12.16 min時出現(xiàn)主要單一峰，對其收集并進行凍干，命名為PAP。

圖14 PAP的質(zhì)譜圖Fig.14 Mass spectrum of PAP

由圖14可知，經(jīng)氨基酸測序確定其氨基酸序列為Ile-Glu-Pro-Gly-Thr-Val-Gly-Met-Met-Phe。經(jīng)質(zhì)譜鑒定，其分子質(zhì)量為1 081.20 D，與氨基酸測序獲得的多肽的分子質(zhì)量一致。

2.3 抗肺癌A549細胞活性

2.3.1 PAP對A549細胞增殖活性的影響

圖15 PAP對A549細胞活性的影響Fig.15 Effect of PAP on the proliferation of A549 cells

由圖15可知，當250 mg/L PAP作用細胞24 h時，對A549的IR為17.02%，當PAP質(zhì)量濃度增加至1 000 mg/L時，IR達到83.44%，IC50為662 mg/L；隨著作用時間的延長，作用48 h時，IC50為571 mg/L；作用72 h時，IC50為487 mg/L。隨著PAP質(zhì)量濃度的增加和作用時間的延長，抑制指數(shù)明顯上升，與對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。

2.3.2 倒置顯微鏡觀察結(jié)果

圖16 倒置顯微鏡下的A549細胞（×200）Fig.16 Morphological changes of A549 cells under an inverted microscope (× 200)

如圖16所示，空白對照組的A549細胞生長良好，細胞間排列緊密，形態(tài)飽滿。PAP作用24 h后，如250 mg/L組A549細胞出現(xiàn)細胞間隙增大，輪廓模糊，形態(tài)不規(guī)則；1 000 mg/L組細胞變圓變亮，形態(tài)和正常細胞有明顯的區(qū)別，同時可見在培養(yǎng)液中懸浮著較多的死細胞。

圖17 AO/EB染色后的A549細胞形態(tài)（×200）Fig.17 Morphological changes of A549 cells treated with PAP analyzed by AO/EB staining (× 200)

2.3.3 AO/EB熒光染色檢測結(jié)果PAP作用于A549細胞24 h后，經(jīng)過AO/EB染色，出現(xiàn)了明顯的早期凋亡的形態(tài)學特征。實驗結(jié)果如圖17所示，空白對照組無明顯凋亡細胞出現(xiàn)，細胞大小均勻，細胞核形態(tài)規(guī)則，胞核呈現(xiàn)綠色熒光；250 mg/L組細胞出現(xiàn)早期凋亡的現(xiàn)象，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，核呈現(xiàn)強黃綠色熒光。隨著用藥質(zhì)量濃度的增加，1 000 mg/L組早期凋亡的細胞和晚期凋亡的細胞明顯增多，細胞核呈固縮狀，呈現(xiàn)橘紅色熒光。

2.3.4 Hoechst 33258染色檢測結(jié)果

圖18 Hoechst 33258染色后的A549細胞形態(tài)（×200）Fig.18 Morphological changes of A549 cells treated with PAP analyzed by Hoechst 33258 staining (× 200)

如圖18所示，當不同質(zhì)量濃度的沙蠶多肽作用于A549細胞24 h后，空白對照組呈現(xiàn)均勻的藍色熒光，PAP作用后，細胞的染色質(zhì)聚集及邊集化明顯，且藍色的熒光變亮，細胞核斷裂皺縮呈現(xiàn)出塊狀或點狀的藍色熒光，視野中細胞數(shù)明顯減少，細胞形態(tài)學的變化隨著藥物質(zhì)量濃度的增加也顯得越明顯。

3 討 論

生物活性多肽是一類由多個氨基酸通過肽鍵相連形成的化合物，具有調(diào)節(jié)人體多種生理功能如抗腫痛、提高免疫、抗病毒和降血壓等作用[24]。目前生物活性肽提取方法主要有3 種：直接提取法、合成法和水解法。直接提取法只適合于動植物中存在的一些含量少結(jié)構(gòu)復雜的天然生物活性肽實驗室提?。缓铣煞ㄝ^易獲得生物活性肽純品，但限制于試劑、儀器成本高、副反應多等原因難以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)；水解法分為化學水解和生物酶水解，酶解法是通過適當?shù)鞍酌杆獾鞍字苽渖锘钚噪牡囊环N方法[25-26]，具有條件溫和、過程可控、肽得率高和安全的優(yōu)勢。眾多學者從海洋生物中提取多肽采用了酶解的方法且表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性，如周軍明[27]復合酶解法提取褐藻糖膠，使用Sevag法脫蛋白，經(jīng)DEAESepharose FF離子交換柱和Sephadex-G150葡聚糖凝膠柱層析獲得了具有還原能力和淬滅脂質(zhì)過氧化能力的均一組分。朱森君等[28]采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶兩步酶解獲得單環(huán)刺螠多糖，得率為6.2%。單環(huán)刺螠內(nèi)臟多糖分子質(zhì)量約為4.1×103u，為類糖胺聚糖。經(jīng)過初步體外抗氧化活性研究后發(fā)現(xiàn)其具有顯著的脂質(zhì)過氧化物清除活性，半數(shù)清除質(zhì)量濃度為2.47 mg/mL。黃芳芳等[29-30]采用酶解法從烏賊墨中提取獲得烏賊多肽，研究結(jié)果表明其可以抑制前列腺癌細胞DU-145、PC-3、LNCaP，且具有時間與劑量依賴性。因此本實驗使用了胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶5 種酶，以細胞IR為指標，確定沙蠶多肽的最佳蛋白酶是堿性蛋白酶。為確定堿性蛋白酶的適宜酶解條件范圍，以酶解物ANN含量為指標，對每個因素分別進行試驗，根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計正交試驗。通過L16（45）正交試驗優(yōu)化酶解工藝，得到沙蠶多肽的關(guān)鍵技術(shù)為：酶解溫度50 ℃、酶解pH 11、料液比1∶1、酶解時間6 h、氨基酸序列Ile-Glu-Pro-Gly-Thr-Val-Gly-Met-Met-Phe。

MTT法是一種測定細胞存活和增殖能力的比色法，其原理是黃色的MTT能被活細胞線粒體脫氫酶還原成藍紫色的甲瓚，而死細胞無這種能力[31]。細胞增殖抑制活性檢測中常常會采用MTT法。馬艷春等[32]采用MTT法檢測不同濃度地龍有效成分對人腎小球系膜細胞（HMC細胞）增殖的影響。結(jié)果顯示中劑量組40 μg/mL效果最佳。陳美珍等[33]采用MTT法檢測發(fā)現(xiàn)龍須菜藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）對人宮頸癌細胞Hela有抑制作用并呈劑量-效應關(guān)系，流式細胞術(shù)結(jié)果顯示PE通過阻滯Hela細胞從G2/M期進入S期發(fā)揮抑制作用。本實驗采用MTT法對PAP對A549細胞的增殖抑制活性進行了檢測，實驗結(jié)果表明，沙蠶多肽對于A549細胞的抑制活性具有時間和劑量依賴關(guān)系，即隨著PAP質(zhì)量濃度的增加和時間的延長，細胞的抑制率明顯上升。從海洋生物中尋找新型抗癌藥物是目前抗癌藥物研究的新領(lǐng)域，包括肽類，糖胺聚糖類、大環(huán)內(nèi)脂類等。其中，海洋多肽分子質(zhì)量小、活性高、毒性低等優(yōu)點，成為國內(nèi)外學者研究熱點。1987年，Pettit[34]和曹王麗[35]等從海兔（Dolabella auricu-laria）體內(nèi)分離得到一個線性小肽Dolastatin-10。經(jīng)Ⅱ期臨床實驗研究，與其他抗癌藥物聯(lián)合使用可發(fā)揮較好的抗癌效果。其衍生物如TZT-1027（auristatin PE）和auristatin PYE在臨床也顯示出顯著的治療效果。Chi Changfeng等[36]從泥蚶中分離獲得了2 種多肽BCP-A（Trp-Pro-Pro）和BCP-B（Gln-Pro），其中BCP-A對PC-3、DU-145、H-1299和HeLa細胞具有很好的增殖抑制活性，且具有時間與劑量依賴性。15 mg/mL的BCP-A作用后，PC-3的早期凋亡率從11.22%增至22.78%。姚如永等[37]提取了一種泥蚶多肽，對A549和Ketr-3細胞具有明顯的抑制作用，對A549和Ketr-3的周期阻滯分別為G2/M期和G0/G1期，體內(nèi)對小鼠移植性腫瘤具有顯著的抑制作用。王翠翠等[38-39]通過離子交換、凝膠過濾等方法從文蛤中提取分離獲得了一種多肽Mere15，研究發(fā)現(xiàn)Mere15可抑制A549細胞生長，抑制率呈劑量和時間依賴性；隨著處理時間的增加，使A549細胞的細胞周期阻滯在G2/M期，其作用機制與抑制微管蛋白聚合相關(guān)。本實驗研究發(fā)現(xiàn)當質(zhì)量濃度為250 mg/L的PAP作用于A549細胞24 h，A549細胞出現(xiàn)凋亡特征。當質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的PAP作用于A549細胞72 h后，IR值達到95.08%，IC50為487 mg/L。

細胞在形態(tài)學上的特征性改變是證明其發(fā)生凋亡的有力證據(jù)[40-41]。通過倒置顯微鏡、熒光染色實驗的變化可以很直觀地看到細胞早期凋亡的形態(tài)學上變化。在本實驗中，通過細胞形態(tài)學實驗，觀察到PAP作用后，A549細胞表現(xiàn)出明顯的細胞形態(tài)學變化，如細胞間隙變大、形態(tài)不規(guī)則、體積變小、部分細胞出現(xiàn)空泡及凋亡小體等，隨濃度增加效果更加顯著。

總之，經(jīng)堿性蛋白酶提取的沙蠶多肽PAP在體外可以有效抑制A549細胞的增殖，作用24 h后A549細胞即表現(xiàn)出明顯的細胞凋亡特征。

4 結(jié) 論

本實驗采用堿性蛋白酶，在酶解溫度50 ℃、酶解pH 11、料液比1∶1、酶解時間6 h、加酶量300 U/g條件下對沙蠶勻漿液進行酶解，經(jīng)超濾、離子交換色譜、凝膠過濾色譜和制備色譜分離純化，獲得沙蠶酶解多肽PAP，經(jīng)氨基酸測序發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列為Ile-Glu-Pro-Gly-Thr-Val-Gly-Met-Met-Phe。研究結(jié)果表明，PAP對A549細胞具有增殖抑制活性且具有劑量和時間依賴性。PAP作用后，A549細胞出現(xiàn)凋亡特征，但PAP導致A549細胞凋亡的途徑還需通過進一步的實驗進行驗證。

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Anticancer Activity of a Novel Peptide Derived from Hydrolysates of Perinereies aibuhitensis against Lung Cancer A549 Cells

JIA Yinglu1, DING Guofang1,2,*, YANG Zuisu1, YU Fangmiao1, ZHENG Yuanyuan1, WU Zongze1, CHEN Rui1
(1. Key Engineering Research Centers of Marineorganisms Medical Products, School of Food Science and Medical, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China; 2. Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang, Zhoushan 316021, China)

The key steps for preparing antitumor peptide from enzymatic hydrolysates of Perinereies aibuhitensis were investigated in the present work. The most suitable enzyme preparation was selected and the optimal hydrolysis conditions allowing high inhibition of cancer cell proliferation were determined using one-factor-at-a-time method and orthogonal array design. A fraction containing peptides with molecular weights of1 3 ku was obtained by ultrafilation of hydrolysates, and it was further purified by sequential ion exchange chromatography, gel filtration chromatography and preparative chromatography. Then, lung cancer A549 cells were used to test the anticaner effect of the purified peptide PAP by methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. The morphological changes were observed through an inverted microscope, dual acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) fluorescent staining and Hoechst fluorescent staining. The results showed that alcalase was found to be the optimal enzyme for the production of anticancer peptide and that the optimal hydrolysis conditions were determined as follows： temperature, 50 ℃; pH value, 11; solid-to-liquid ratio, 1：1; hydrolysis time,6 h; and enzyme dosage, 300 U/g. The peptide PAP was identified as Ile-Glu-Pro-Gly-Thr-Val-Gly-Met-Met-Phe. Moreover, our results demonstrated that PAP suppressed the proliferation of A549 cells in a time- and dose-dependent manner with morphological features of apoptosis being observed. Therefore, our findings suggest that PAP could inhibit the proliferation of lung cancer A549 cells and induced apoptosis.

Perinereies aibuhitensis; polypeptide; anti-cancer; A549 cell lines; cell apoptosis

10.7506/spkx1002-6630-201712005

R734.2

A

1002-6630（2017）12-0027-09

2016-08-31

國家自然科學基金青年科學基金項目（81001393）；2015年度國家星火計劃項目（2015GA700044）；國家海洋重大計劃項目（2015862）；浙江省科技廳重大專項（2013C03036）；浙江省自然科學基金項目（LS15H30001）；浙江省自然科學基金青年資金項目（LQ16H300001）；舟山市科技計劃項目（2015C31012）

賈盈露（1992—），女，碩士研究生，研究方向為海洋藥物、海洋功能食品。E-mail：m18768013696@163.com

*通信作者：丁國芳（1958—），男，教授，本科，研究方向為海洋藥物、海洋功能食品。E-mail：dinggf2007@163.com

賈盈露, 丁國芳, 楊最素, 等. 雙齒圍沙蠶多肽的制備及其抗肺癌A549細胞活性[J]. 食品科學, 2017, 38(12)： 27-35.

10.7506/spkx1002-6630-201712005. http：//www.spkx.net.cn

JIA Yinglu, DING Guofang, YANG Zuisu, et al. Anticancer activity of a novel peptide derived from hydrolysates of Perinereies aibuhitensis against lung cancer A549 cells[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 27-35. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201712005. http：//www.spkx.net.cn