內(nèi)蒙古絨山羊不同部位骨骼肌的轉(zhuǎn)錄組分析

趙 珺,王 樂,蘇 蕊,張燕軍,劉志紅,李金泉,*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),動物遺傳育種重點實驗室,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古化工職業(yè)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010010)

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內(nèi)蒙古絨山羊不同部位骨骼肌的轉(zhuǎn)錄組分析

趙 珺1,2,王 樂1,蘇 蕊1,張燕軍1,劉志紅1,李金泉1,*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),動物遺傳育種重點實驗室,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古化工職業(yè)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010010)

本實驗旨在研究內(nèi)蒙古絨山羊背最長肌、臂三頭肌和臀肌3個部位骨骼肌差異表達(dá)的主要信號通路和關(guān)鍵基因的表達(dá)規(guī)律,以提高絨山羊基因組的注釋水平。以3只在相同飼養(yǎng)背景下的絨山羊成年母羊為研究對象,屠宰后取3個部位骨骼肌肌肉組織并提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄建立cDNA文庫,利用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù),建立了絨山羊3個骨骼肌其mRNA水平上的轉(zhuǎn)錄組分析平臺。結(jié)果得到了18.64 Gb的信息量,92278723對雙端reads,發(fā)現(xiàn)影響絨山羊骨骼肌生長發(fā)育的差異基因多來自輕鏈肌球蛋白家族、重鏈肌球蛋白家族。內(nèi)蒙古絨山羊背最長肌、臂三頭肌和臀肌3個部位骨骼肌在轉(zhuǎn)錄組水平上存在差異。

絨山羊,骨骼肌,轉(zhuǎn)錄組,高通量測序

內(nèi)蒙古絨山羊不僅絨質(zhì)好,且肉質(zhì)優(yōu)良,屬于絨肉兼用品種。目前,我國對絨山羊的研究主要集中在絨質(zhì)上,而作為同時可以肉用的品種來說,其肉質(zhì)的特性還沒有進(jìn)行全面而系統(tǒng)的研究。對絨山羊肉質(zhì)的理化性質(zhì)分析后發(fā)現(xiàn),內(nèi)蒙古絨山羊羊肉在不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)含量方面都有明顯的優(yōu)勢,特別是膽固醇和脂肪含量更低,且性涼,一年四季皆適合食用[1]。

肉品質(zhì)的研究往往集中于動物屠宰和加工后肉的外觀、營養(yǎng)、風(fēng)味、衛(wèi)生等一些物化性狀方面,近年來對肉質(zhì)的分析正逐漸轉(zhuǎn)向分子層面,且限于豬、綿羊等品種間的差異研究[2-4],有關(guān)內(nèi)蒙古絨山羊羊肉品質(zhì)分子層面的研究較少。前期筆者對內(nèi)蒙古絨山羊背最長肌、臂三頭肌和臀肌3個部位的差異蛋白進(jìn)行了分析,建立了絨山羊骨骼肌差異蛋白譜,發(fā)現(xiàn)骨骼肌的差異主要體現(xiàn)在控制肌肉收縮機制的結(jié)構(gòu)蛋白上[5]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展,科學(xué)研究已經(jīng)邁入了后基因組時代[6]。轉(zhuǎn)錄組(Transcriptome)的研究為基因表達(dá)調(diào)控、揭示遺傳信息等提供了大量可靠的信息[7-8]。轉(zhuǎn)錄組是指在某種生理條件下,細(xì)胞內(nèi)全部轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的總和,包括信使RNA、核糖體RNA、轉(zhuǎn)運RNA及非編碼RNA[9-11]。轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)技術(shù)無需對數(shù)據(jù)集進(jìn)行復(fù)雜的標(biāo)準(zhǔn)化即可捕捉不同組織或狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄組動態(tài)變化[12-13]。有研究認(rèn)為利用RNA-Seq技術(shù)對綿羊肌肉表達(dá)基因的研究比傳統(tǒng)的芯片技術(shù)更能為人們敏感地檢測樣本間基因的差異表達(dá)[14-16]。

表1 山羊β-actin基因和肌肉差異相關(guān)基因RT-qPCR擴增引物的序列Table 1 The table of primer sequences of β-actin gene and genes relative with muscle

本研究選取較好的背最長肌、臂三頭肌以及臀肌3個部位的骨骼肌為研究對象,利用Illumina高通量測序技術(shù),以內(nèi)蒙古絨山羊為材料,研究個體不同部位骨骼肌的差異,以期從mRNA水平解析3個部位骨骼肌肌肉品質(zhì)差異可能存在的分子調(diào)控機制,初步篩選與肌肉發(fā)育相關(guān)的差異基因,試圖從mRNA水平揭示絨山羊肌肉發(fā)育的分子基礎(chǔ)提供依據(jù),為絨山羊育種、肉品質(zhì)鑒定提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

絨山羊 由內(nèi)蒙古阿爾巴斯白絨山羊(Caprahircus)種羊場提供,飼養(yǎng)管理條件一致。分別采取3只成年周歲母羊的背最長肌、臀肌及臂三頭肌3個部位的肌肉組織,按部位混合后存放于-80 ℃冰箱,用于總RNA提取。

2-16P冷凍離心機 德國西格瑪(Sigma);VCX130超聲破碎儀 美國索尼克斯(Sonics);MS3混合儀 德國艾卡(IKA);CFX96實時定量PCR儀、GelDocXR凝膠成像儀 美國伯樂(Bio-Rad);3500基因測序儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI);ULTS超低溫冰箱 德國賽默飛(Thermo)。

1.2 實驗方法

1.2.1 cDNA文庫的制備及轉(zhuǎn)錄組測序 根據(jù)合格的肌肉組織RNA反轉(zhuǎn)錄建立cDNA文庫,并以山羊參考基因組建立測序文庫,以內(nèi)蒙古絨山羊背最長肌為對照對3個部位的骨骼肌進(jìn)行分析。測序工作委托北京百邁克公司進(jìn)行。利用編程的手段將測序獲得的reads其質(zhì)量不高的接頭即堿基數(shù)Q≤10并占half number of whole reads和“N”基超過3%的reads過濾掉,隨后利用FastQC軟件評價,以備后續(xù)分析。

1.2.2 差異表達(dá)基因篩選 本研究采用FPKM(Fragment Per Kilobase of exon model per Million mapped reads[17-18],每1百萬個map上的reads中map到外顯子的每1K個堿基上的Fragments個數(shù))表征每個基因的表達(dá)豐度,采用FPKM>0.1作為表達(dá)的基因被檢測到的標(biāo)準(zhǔn)。通過差異表達(dá)基因{ fold change≥2或≤0.5,p-value≤0.01且FDR(False Discovery Rate)<0.01}尋找內(nèi)蒙古絨山羊3個部位肌肉兩兩樣品間(臂三頭肌-背最長肌、臀肌-臂三頭肌、臂三頭肌-臀肌)的差異表達(dá)基因,并統(tǒng)計差異樣本的上調(diào)、下調(diào)基因。

1.2.3 差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析 GO功能注釋分為細(xì)胞組分、分子功能和生物學(xué)過程3大類。使用GO注釋(http://wego.genomics.org.cn/cgi-bin/wego/index.pl)對差異基因進(jìn)行功能聚類分析。利用KEGG平臺(http://www.genome.jp/kegg/pathway. htML)對差異基因進(jìn)行KEGG通路分析,通過KEGG通路分析確定差異基因參與的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.2.4 差異基因的實時定量PCR驗證 參照GeneBank中公布的山羊β-actin基因,篩選與骨骼肌發(fā)育相關(guān)的差異表達(dá)基因肌紅蛋白(Mb),肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)和肌球蛋白輕鏈2(MyLC2),采用2-ΔΔCt法對差異基因的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計計算。采用Primer 5.0進(jìn)行特異實時熒光定量引物的設(shè)計,委托上海生工合成,詳細(xì)信息見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA質(zhì)量檢測

3個部位的肌肉RNA其OD260/280值大于1.8且小于2.2,說明沒有蛋白質(zhì)和DNA的污染,同時也沒有水解為單核苷酸;可見兩條清晰的28S和18S條帶,表明3個樣品的RNA沒有降解,此外RIN(RNA integrity number)檢測都符合要求,即肌肉組織樣本滿足轉(zhuǎn)錄組測序的條件(表2)。

表2 絨山羊肌肉組織測序表Table 2 The sequencing information of cashmere muscle

表3 測序數(shù)據(jù)評估表Table 3 The table of sequencing data on evaluation

2.2 測序數(shù)據(jù)結(jié)果分析

本次實驗構(gòu)建了內(nèi)蒙古絨山羊骨骼肌肌肉表達(dá)譜文庫,共獲得922278723雙reads,堿基總數(shù)為18.64 Gb。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾去除低質(zhì)量的序列后,得到可供轉(zhuǎn)錄組拼接的有效reads>90%,表明樣品測序質(zhì)量較高。

2.3 差異表達(dá)基因篩選

圖1 背最長肌-臂三頭肌差異基因GO分析Fig.1 Gene ontology of differential expression genes in longissimus muscle vs triceps muscle注:圖中縱坐標(biāo)柱形圖左側(cè)為全部非重復(fù)序列基因,右側(cè)為差異非重復(fù)序列基因。

對內(nèi)蒙古絨山羊3個部位肌肉兩兩樣品間的差異表達(dá)基因進(jìn)行數(shù)目統(tǒng)計(表4)。臂三頭肌與背最長肌的差異表達(dá)基因總數(shù)為790個,上調(diào)基因和下調(diào)基因分別為448、342個,上調(diào)基因中有5個屬于MyLC家族,其中MyLC2和MyLC4在臂三頭肌中上調(diào)顯著(p<0.05);臀肌與背最長肌的差異表達(dá)基因總數(shù)為571個,上調(diào)基因和下調(diào)基因分別為357、214個,上調(diào)基因中有3個基因與肌動蛋白(Actin)相關(guān),29個基因與骨骼肌的發(fā)育相關(guān);臂三頭肌與臀肌的差異表達(dá)基因總數(shù)為300個,上調(diào)基因和下調(diào)基因分別為161、139個,上調(diào)基因中與骨骼肌發(fā)育相關(guān)的基因有31個,其中1個基因功能預(yù)測為Actin。

表4 差異表達(dá)基因數(shù)目統(tǒng)計表Table 4 The number of differential expression genes

2.4 差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析

2.4.1 差異基因GO分類 通過GO對基因、蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分類和注釋,按分子功能、細(xì)胞組分和生物學(xué)過程進(jìn)行分類。差異表達(dá)基因GO的分類注釋包括3個本體,細(xì)胞成分(Cellular component)、分子功能(Molecular function)和生物學(xué)過程(Biological process)。3個對照文庫通過GO富集檢驗(p<0.05)的差異表達(dá)基因所對應(yīng)的GO條目與顯著富集GO條目基本一致,差異體現(xiàn)在參與基因的數(shù)目上。背最長肌與臂三頭肌之間共有1623條差異表達(dá)基因獲得GO數(shù)據(jù)庫注釋,這些差異基因被分在上述3大類的56個亞類中。其中,生物過程分為23個亞類中獲得的注釋信息較多,共有548條差異基因,占全部注釋信息的33.76%,這里涉及細(xì)胞過程(Cellular process)和生物協(xié)調(diào)(Biological regulation)和代謝過程(Metabolic process)比較多;其次是細(xì)胞成分,分為18 個亞類,共有539條差異基因,占全部注釋信息的33.21%,涉及到細(xì)胞部分(Cell part)、細(xì)胞(Cell)和細(xì)胞器(Organelle)的比較多;分子功能的注釋信息有16個亞類,共有536條差異基因,占33.03%,這其中的催化活性(Catalytic activity)與結(jié)合(Binding)排在前2位。

表5 絨山羊骨骼肌差異基因KEGG代謝途徑分類Table 5 KEGG classification of skeletal differential expression genes

2.4.2 差異表達(dá)基因KEGG通路富集結(jié)果分析 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫是與通路相關(guān)的開放的重要數(shù)據(jù)庫,Kanehisa等[19-20]根據(jù)BLAST 2 GO把實驗中得到的差異表達(dá)基因和該數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast,會更深入的了解基因的具體功能,因為在動植物體內(nèi),更多情況下某一個功能或性狀是許多基因產(chǎn)物共同協(xié)作的結(jié)果。將得到的差異基因映射到KEGG數(shù)據(jù)庫中,通過3個對照組得到的差異表達(dá)基因在通路的富集顯著性的可靠分析。最可靠(P-value最小)的通路中,多數(shù)基因注釋到脂肪酸代謝途徑,糖代謝途徑以及心肌系統(tǒng)疾病途徑等。在上述通路中篩選了8條與肉質(zhì)相關(guān)的差異基因KEGG的代謝途徑進(jìn)行展示(表5),參與肌動骨架蛋白調(diào)節(jié)信號通路的差異表達(dá)基因數(shù)量為16;其次為過氧化物酶增殖激活受體信號通路,參與的基因數(shù)量為11。

2.5 Q-PCR法對測序數(shù)據(jù)可靠性驗證

篩選與骨骼肌發(fā)育相關(guān)的差異表達(dá)基因肌紅蛋白(Mb)、肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)和肌球蛋白輕鏈2(MyLC2)對測序結(jié)果進(jìn)行驗證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌紅蛋白(Mb)、肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)和肌球蛋白輕鏈2(MyLC2)在臂三頭肌中顯著高于背最長肌,說明高通量測序結(jié)果可靠(圖2)。

圖2 絨山羊肌肉差異表達(dá)基因表達(dá)量趨勢圖Fig.2 The chart of differential expression genes of cashmere skeletal muscle

3 討論

對3個部位的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行兩兩比對分析,并對差異基因中與肉質(zhì)相關(guān)的基因進(jìn)行統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)功能注釋基本包括肌動蛋白細(xì)胞骨架、循環(huán)調(diào)節(jié)、細(xì)胞的分化合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及脂肪的運輸和代謝等相關(guān)的功能。并發(fā)現(xiàn)有多個基因編碼產(chǎn)生肌球蛋白、肌鈣蛋白和肌紅蛋白,與絨山羊的肌肉生長速度差異有一定的相關(guān),這些基因可能為骨骼肌生長中的保守基因,這與綿羊的研究基本一致[21]。MyLC3和MyHC2是調(diào)控骨骼肌生長發(fā)育并影響其生長速度和嫩度的主要基因,MLCK家族是調(diào)控絨山羊骨骼肌肌肉收縮能力的重要基因。Takashima[22]發(fā)現(xiàn),MLCK是可溶性蛋白激酶,是細(xì)胞收縮力產(chǎn)生的關(guān)鍵因素,主要作用是調(diào)節(jié)MyLC2產(chǎn)生ATP酶以促進(jìn)肌動蛋白-肌球蛋白的收縮。Chan等[23-25]認(rèn)為在大多數(shù)細(xì)胞中,MLCK起到調(diào)節(jié)二價鈣離子與鈣調(diào)蛋白連接的MLCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,MLCK在MyLC調(diào)控肌動蛋白對肌肉的收縮、細(xì)胞轉(zhuǎn)運等過程具有重要的作用,是細(xì)胞連接和轉(zhuǎn)運的信號關(guān)鍵。臂三頭肌相對背最長肌的MLCK上調(diào),而臀肌中MLCK的表達(dá)很弱,說明臂三頭肌的肌肉收縮能力強于背最長肌,臀肌的收縮力最差,這與山羊的習(xí)性相符。

GO功能富集性分析顯示，許多差異表達(dá)基因參與了一些生物學(xué)過程,如細(xì)胞的結(jié)合、新陳代謝、細(xì)胞過程等,這些結(jié)果與在豬上的研究一致[26],說明這些差異表達(dá)基因間的相互作用共同執(zhí)行了以上的生物學(xué)功能。KEGG通路注釋分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因參與重要的信號通路:轉(zhuǎn)化生長因子信號系統(tǒng)(TGF-βsignaling system),肌動骨架蛋白調(diào)節(jié)系統(tǒng)(RegμLation of actin cytoskeleton),FAM信號通路(Fatty acid metabolism)以及心肌集合系統(tǒng)(Vascular Smooth Muscle Contracion)等與肌肉的生長、發(fā)育關(guān)系極為密切,說明肌細(xì)胞的增殖和分化與骨骼肌的生長發(fā)育過程有著復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。特別是骨骼肌的生長、發(fā)育及再生等受到細(xì)胞外環(huán)境的調(diào)節(jié),細(xì)胞生長因子的作用尤為顯著,轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)、成纖維生長因子(FGF)等能夠有效調(diào)控肌肉發(fā)育基因表達(dá)[27]。TGF-β超家族的功能最為顯著,TGF-β通路對生物體和各種器官的發(fā)育過程起重要的調(diào)節(jié)作用[28-31]。TGFBR3作為TGF-β信號通路的一員,對細(xì)胞的增殖和分化具有抑制作用[32]。TGF-β可以抑制由新生成肌細(xì)胞遷移融合導(dǎo)致的肌管早熟,確保了骨骼肌在胚胎期的正常發(fā)育[33-34]。

αR肌纖維的直徑是3種類型中最長的,并且該類型的肌纖維在肌肉中的含量多少會負(fù)向影響肌肉的品質(zhì)。即αR肌纖維在3種類型肌纖維中含量越高,肉的品質(zhì)就相應(yīng)越低,反之亦然,而βR型肌纖維的多少則正向影響肌肉的細(xì)嫩程度[35]。對豬的研究中發(fā)現(xiàn),不同品種的豬具有不同生長速度,在研究各自的骨骼肌時發(fā)現(xiàn),肌球重鏈中II b mRNA表達(dá)量對提高肌肉的生長是成正比的,該基因表達(dá)的愈多,肌肉的生長愈快[36]。對羊的研究表明,在有著近乎相同的直徑的情況下,纖維總數(shù)高的羊所含的II 型纖維也較高[37]。在本研究中,臂三頭肌相對背最長肌顯著上調(diào)的基因中有MyHC2,該基因?qū)儆诩∏蛑劓溂易?影響肌肉的生長速度,說明臂三頭肌的生長速度更快。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù),共得到了18.64 Gb的信息量,92278723對雙端reads。結(jié)合GO注釋、KEGG富集分析等方法對本研究篩選的絨山羊骨骼肌差異基因進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要富集在脂肪酸代謝、肌動蛋白骨架調(diào)節(jié)等方面,說明這些代謝途徑對肌肉的生長和發(fā)育起重要作用。本研究通過高通量測序得到的數(shù)據(jù)為后續(xù)對絨山羊肉質(zhì)的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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The transcriptomic analysis of different skeletal muscles of Cashmere goats

ZHAO Jun1,2,WANG Le1,SU Rui1,ZHANG Yan-jun1,LIU Zhi-hong1,LI Jin-quan1,*

(1.Key Laboratory of Animal Breeding and Reproduction in Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China;2.Inner Mongolia Vocational College of Chemical Engineering,Hohhot 010010,China)

In order to study on the growth rules of the goat and improve the mutton production,it was explored the main signaling pathways and the expression of key genes of longissimus muscle,triceps muscle and glutaeus in Inner Mongolian Cashmere goat. Three skeletal muscles of three cashmere goats were obtained after being slaughtered and total RNA was extracted to establish cDNA library. The Illumina high-throughput sequencing technique and bioinformatics were used to determine transcript abundances and characteristics. The establishment of mRNA level analysis platform by transcription for three skeletal muscles in Cashmere goat

18.64 Gb of data,92278723 reads of double end. The important genes belong to the myosin light chain and myosin heavy chain family. These results suggested that there were many differences in the muscle transcriptomes between these three skeletal muscles.

Cashmere goat;skeletal muscle;transcriptome;Illumina high-throughput sequencing technique

2016-11-01

趙珺(1980-)，女，在讀博士，副教授，主要從事食品營養(yǎng)與檢測方面的研究，E-mail：zhaojunivy@163.com。

*通訊作者:李金泉(1957-)，男，博士，教授，主要從事絨山羊絨毛機理及育種方面的研究，E-mail：lijinquan_nd@126.com。

國家863計劃項目(2007AA10Z151)；國家自然科學(xué)基金項目(31260538)。

TS251.5+3

A

1002-0306(2017)10-0173-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.025