兩種來源于牛皮膠原蛋白的新型ACE抑制肽

董 瑩,王湛清,沈菊泉,范季瀛,湯 俊,馬志英,沈亞領(lǐng),*

(1.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院,生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237;2.上海市食品研究所,上海 200235)

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兩種來源于牛皮膠原蛋白的新型ACE抑制肽

董 瑩1,王湛清1,沈菊泉2,范季瀛1,湯 俊1,馬志英2,沈亞領(lǐng)1,*

(1.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院,生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237;2.上海市食品研究所,上海 200235)

從牛皮膠原蛋白中鑒定分離出抑制血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶(ACE)的多肽片段。首先優(yōu)化牛皮膠原蛋白水解方法,應(yīng)用胃蛋白酶和堿性蛋白酶獲得活性最高的水解產(chǎn)物(抑制ACE的IC50為0.168 mg/mL)。經(jīng)MW 5000超濾分離后,得到水解液中活性最高的部分(IC50為0.079 mg/mL)。對(duì)分離后低于MW 5000的部分經(jīng)RP-HPLC進(jìn)一步分離,發(fā)現(xiàn)含有大量ACE抑制肽,并應(yīng)用RP-HPLC-MS/MS鑒定出兩種新型ACE抑制肽,氨基酸序列分別為ISVPGPM 和LGPVGNPGPA,IC50值分別為0.017 mg/mL(24.3 μmol/L)和0.077 mg/mL(87.8 μmol/L)。最后,本文模擬了兩種抑制肽在體內(nèi)生理環(huán)境下的消化,發(fā)現(xiàn)均可被部分降解,且消化產(chǎn)物具有與原始多肽相近的ACE抑制活性。

牛皮膠原蛋白,水解產(chǎn)物,ACE抑制肽

高血壓是一種常見多發(fā)病,是發(fā)展成中風(fēng)、冠心病、心力衰竭的主要風(fēng)險(xiǎn)因素[1]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)是人體重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng),因此血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin-Converting Enzyme,ACE)對(duì)于血壓控制至關(guān)重要。通過抑制ACE阻止血管緊張素Ⅱ積累可有效治療高血壓[2]。ACE的底物廣泛,可以被多種化合物抑制[3]。卡托普利、依那普利、阿拉普利和賴諾普利等藥物可治療高血壓,也會(huì)產(chǎn)生一定的副作用,包括咳嗽、味覺障礙、蛋白尿和血質(zhì)不調(diào)等[4]。

近些年的研究表明,食物蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中的一些短肽,除營養(yǎng)功能外還具有廣泛的生理調(diào)節(jié)功能,如降血壓、降血脂、促進(jìn)鈣吸收、降低膽固醇、免疫調(diào)節(jié)等[5-6]。目前已經(jīng)在多種食品蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了ACE抑制肽,如發(fā)酵牛奶[7]、卵清蛋白[8]、牛血清蛋白[9]、綠豆蛋白[10]、鰨魚蛋白[11]和海鯛鱗屑[12],部分短肽已經(jīng)在活體內(nèi)證明具有降壓功效。

天然降血壓肽是由蛋白酶在溫和條件下水解蛋白質(zhì)而獲得,食用安全性高,且對(duì)高血壓患者可以起到降壓作用,而對(duì)血壓正常的人無降壓作用,不會(huì)降壓過度。這些肽可以用作功能性食品添加劑,成為一種更健康和天然的ACE抑制劑替代藥物,既能更安全有效地緩解高血壓,進(jìn)一步用于輔助治療[13],又能滿足消費(fèi)者對(duì)食品營養(yǎng)、保健、天然的要求。

本研究以牛皮膠原蛋白(I型膠原蛋白)為原料,因其脯氨酸含量遠(yuǎn)高于其他來源的蛋白質(zhì),期望水解產(chǎn)物具有較高ACE抑制活性。本研究的主要目的是研究牛皮膠原蛋白水解產(chǎn)物潛在的體外抗高血壓活性并對(duì)具有ACE抑制活性的短肽進(jìn)行表征。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛皮原料 來源于上海屠宰廠;ACE(來源于兔肺)和馬尿酰-組胺酰-亮氨酸(hippuryl-L-histidyl-L-leucine,HHL) 購自Sigma公司;胃蛋白酶(EC3.4.4.3;1∶3000) 購自Genview;堿性蛋白酶(液體,EC3.4.21.62,2.4 AU/g),風(fēng)味酶(粉末,EC3.4.11.1,500 LAPU/g) 由Novozymes(天津)惠贈(zèng);胰蛋白酶(EC3.4.21.4,1∶250,牛胰腺)、糜蛋白酶(EC3.4.21.1,4000 ATEEU/mg,牛胰腺) 為生物級(jí)試劑,購自生工生物工程公司;本研究中所使用的其他試劑 均為分析純,購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

色譜柱ZORBAX SB C18柱 (4.6 mm×250 mm,5 μm) Angilent,USA;反相高效液相色譜(SF-TMC18柱，19 mm×150 mm,5 μm) Waters,USA;超濾膜(MW 5000,MW 10000) 密理博(中國)有限公司;PHS-3C pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;HH-S恒溫水浴鍋 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;DS-1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠;1110液相色譜儀 安捷倫科技(中國)有限公司;ICQ Deca XP MAX質(zhì)譜儀 美國菲尼根質(zhì)譜中國有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料處理

1.2.1.1 脫脂 原料分別按料液比m/v=1∶3添加丙酮、乙醚,浸泡0.5 h后,用蒸餾水沖洗至無異味殘留。

1.2.1.2 脫雜蛋白 按料液比m/v=1∶3加入5% NaCl溶液,持續(xù)攪拌12 h,然后更換等量的5% NaCl溶液,再攪拌12 h。再用蒸餾水沖洗數(shù)次去除殘留的NaCl。

1.2.1.3 溶脹 將去脂去雜蛋白后的牛皮按料液比m/v=1∶10浸沒于KCl-HCl緩沖液(pH1.5)中,浸泡4 h至不再夾生。

1.2.1.4 勻漿 溶脹結(jié)束后的牛皮用組織搗碎機(jī)以12000 r/min的轉(zhuǎn)速間歇?jiǎng)驖{,置于沸水浴中加熱變性3 min,并將底部碎塊再次勻漿,再將全部勻漿物攪拌均勻。

1.2.2 牛皮膠原蛋白水解產(chǎn)物的準(zhǔn)備 分別用一種或多種蛋白酶水解牛皮膠原蛋白。用單一酶水解時(shí),取勻漿后粘稠物約20 g,并用1 mol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)至各酶的最適pH(胃蛋白酶pH1.5,風(fēng)味酶pH5.0,堿性蛋白酶pH8.0)。

使用不同酶組合時(shí),使牛皮膠原蛋白樣品在最適條件下連續(xù)水解。將已水解樣品置于沸水浴中加熱10 min以終止水解。用0.22 μm過濾器過濾水解產(chǎn)物的上清液,并將濾液用于后續(xù)ACE抑制活性的測(cè)定。

1.2.3 水解度(DH)的測(cè)定 分別Lowry法測(cè)定水解液總氮含量,甲醛滴定法測(cè)定氨基氮含量,根據(jù)式(1)可以得到蛋白的水解度。

DH(%)=h/htot×100

式(1)

式中,h-水解后每克蛋白質(zhì)被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù)(mmol/g)即游離的氨基氮;htot-每克原料蛋白質(zhì)的肽鍵毫摩爾數(shù)(mmol/g),即總氮。

1.2.4 ACE抑制活性實(shí)驗(yàn) 樣品的ACE抑制活性檢測(cè)方法參考修改自Cushman and Cheung[14]。ACE(20 mU/mL)和底物HHL(5 mmol/L)分別用含0.4 mmol/L NaCl的0.1 mmol/L硼酸鈉溶液(pH8.3)溶解。取80 μL HHL和50 μL樣品混勻后置于37 ℃,3 min后添加20 μL ACE溶液并在37 ℃反應(yīng)30 min。通過添加0.2 mL 1 mol/L HCl終止反應(yīng)。用高效液相色譜(HPLC)法檢測(cè)ACE水解產(chǎn)生的馬尿酸釋放量,色譜柱用ZORBAX SB C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱子用含0.05% TFA的16%乙腈溶液沖洗,流速為1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為228 nm。

通過HPLC洗脫圖譜定量馬尿酸的生成量。ACE活性抑制率計(jì)算公式為:ACE活性抑制率ACEI(%)=(A1-A2/A1)。其中A1為未添加樣品時(shí)的峰面積;A2為添加樣品時(shí)的峰面積。配制不同濃度(0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L)的馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)樣后可計(jì)算得到濃度與峰面積的關(guān)系,作出峰面積與馬尿酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。y=3588.8x式中,x為馬尿酸濃度(mmol/L),y為峰面積。

IC50值為樣品ACE抑制活性達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度。通過繪制ACE抑制率與多肽濃度對(duì)數(shù)值曲線,計(jì)算相應(yīng)IC50,分析多肽的ACE抑制活性。

1.2.5 多肽的分離 用2種超濾膜(MW 5000,MW 10000)對(duì)ACE抑制活性最高的牛皮膠原蛋白水解液濾液進(jìn)行分離,并對(duì)各濾出液進(jìn)行ACE抑制活性檢測(cè)?；钚宰罡叩臉悠凡捎梅聪喔咝б合嗌V(SF-TMC18柱,19 mm×150 mm,5 μm)進(jìn)一步分離。系統(tǒng)包括四元梯度泵系統(tǒng)、在線脫氣器、設(shè)定為215 nm的可變波長(zhǎng)吸光度檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器。首先分別用溶液A(含0.1% TFA的蒸餾水)、溶液B(含0.1% TFA的乙腈)以1 mL/min的流速?zèng)_洗柱子,并檢測(cè)215 nm處的吸收值。色譜柱用5% A和95% B平衡,向色譜柱注射樣品,進(jìn)樣量為20 μL,用5% A和95% B 洗脫15 min,隨后增加溶液A的比例:0～15 min,5%;15～40 min,5%～20%(v/v);40～50 min,20%～30%;50～60 min,30%～100%。收集ACE抑制活性最高的洗脫液,凍干,用蒸餾水溶解,再按上述的高效液相色譜條件進(jìn)行分離。

1.2.6 多肽的鑒定和測(cè)序 對(duì)多肽采用Agilent HPLC系統(tǒng)(Agilent Technologies,1110 series,USA)和ESI-MS/MS 檢測(cè)器(Finnigan LCQ ion trap mass spectrometry)進(jìn)行進(jìn)一步表征。用RP-HPLC-MS/MS分檢測(cè)ACE抑制活性最高的多肽分離液,HPLC色譜柱用SF-TMC18柱(19 mm×150 mm,5 μm),進(jìn)樣量20 μL,流動(dòng)相為溶液A(含0.1%甲酸的蒸餾水)和溶液B(含0.1%甲酸的甲醇溶液)線性梯度洗脫,A相比例:0～5 min,5%;5～50 min,5%～50%(v/v);50～80 min,50%～100%。記錄MS/MS質(zhì)荷比在100～2000的譜圖。使用Xcalibur軟件記錄總離子色譜和質(zhì)譜。使用Bioworks軟件(版本3.1)分析串聯(lián)質(zhì)譜,在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索多肽序列。

1.2.7 多肽合成 將鑒定出的兩種抑制肽用Fmoc固相合成方法(HD生物科學(xué)有限公司)進(jìn)行化學(xué)合成,并測(cè)定其ACE抑制活性(IC50)。所合成多肽的純度經(jīng)RP-HPLC-MS-MS驗(yàn)證>95%。

1.2.8 抑制動(dòng)力學(xué)研究 分別用0.1 mmol/L 硼酸鈉緩沖液(pH8.3)溶解合成的多肽(50 μmol/L,25 μmol/L),在ACE作用下與不同濃度(5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mmol/L)底物HHL于37 ℃反應(yīng)。對(duì)照組不添加多肽。用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作出添加抑制劑的ACE動(dòng)力學(xué)曲線。

1.2.9 穩(wěn)定性和同分異構(gòu)性研究 ACE抑制肽經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶水解。合成肽(1 mg/mL)首先與胃蛋白酶(E/S 1∶25)在pH2.0,37 ℃條件下反應(yīng)2 h,以模擬胃消化;再與胰蛋白酶和糜蛋白酶(E/S 1∶25)在pH7.0,37 ℃條件下反應(yīng)5 h,以模擬小腸水解環(huán)境。水解在溫控培養(yǎng)箱中持續(xù)攪拌下進(jìn)行。反應(yīng)通過在沸水中加熱10 min終止,水解產(chǎn)物降至室溫后進(jìn)一步檢測(cè)。消化后水解產(chǎn)物中的多肽按照1.2.6中的方法用HPLC-MS進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛皮膠原蛋白水解產(chǎn)物的ACE抑制活性

將牛皮膠原蛋白用多種酶包括風(fēng)味酶、胃蛋白酶和堿性蛋白酶水解,分別檢測(cè)各種單酶法酶解產(chǎn)物的水解度及ACE抑制活性,發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶和胃蛋白酶的酶解產(chǎn)物IC50值低于風(fēng)味酶酶解產(chǎn)物,即堿性蛋白酶和胃蛋白酶酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性更高(表1)。

表1 不同酶水解牛皮膠原蛋白水解產(chǎn)物的水解度和ACE抑制活性Table 1 The degree of hydrolysis and ACE inhibitory activity of bovine skin collagen hydrolysates with different proteases treatment

為得到具有最高ACE抑制活性的水解產(chǎn)物,采用不同酶組合水解方法并使用部分因子設(shè)計(jì)、中心合成設(shè)計(jì)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)加以優(yōu)化,確定了牛皮膠原蛋白的復(fù)合酶解的最優(yōu)條件為:首先在pH4.5,37 ℃條件下經(jīng)胃蛋白酶(1%,w/v)水解4 h,再在pH8.0條件下堿性蛋白酶(0.6%,w/v)水解2 h。優(yōu)化后,所得水解產(chǎn)物的IC50值達(dá)到0.168 mg/mL,ACE抑制活性比單酶法所得水解產(chǎn)物的活性明顯提高(表1)。

2.2 ACE抑制肽的分離

將牛皮膠原蛋白水解產(chǎn)物經(jīng)超濾分離分為三組,各組的ACE抑制活性如表2所示。小于5000 u的組分顯示出最高的ACE抑制活性,IC50為0.079 mg/mL。因此,再根據(jù)疏水性使用RP-HPLC將小于5000 u的組分進(jìn)一步分為四組(圖1),其中組分3和組分4保留了ACE抑制活性,而組分1和組分2無明顯ACE抑制活性。將組分3和組分4混合后,再經(jīng)RP-HPLC分離(圖2A)。分別收集7個(gè)主峰對(duì)應(yīng)洗脫液并依次標(biāo)記為a～g。這些組分中,e和g表現(xiàn)出更高的ACE抑制活性(表3),因此,選擇e和g進(jìn)行后續(xù)研究。計(jì)算得到組分e和g的IC50分別為0.035 mg/mL和0.010 mg/mL,并進(jìn)行RP-HPLC-MS/MS分析鑒定和氨基酸測(cè)序。

圖1 MW 5000超濾分離樣品的RP-HPLC圖譜(A)及各組分ACE抑制活性(B)Fig.1 Reverse-phase HPLC profile(A)and ACE inhibitory activity(B)of MW 5000 ultrafiltrated sample

表2 水解產(chǎn)物超濾后不同組分的ACE抑制活性Table 2 The ACE inhibitory activity of hydrolysate fractions after ultrafiltrations

表3 各凍干樣品ACE抑制活性的測(cè)定Table 3 The ACE inhibitory activity of samples after gelsiccation

圖2 超濾分離所得組分3和組分4的RP-HPLC圖譜(A)及各組分ACE抑制活性(B)Fig.2 Reverse-phase HPLC profile(A) and ACE inhibitory activity(B)of fraction 3 and fraction 4

2.3 ACE抑制肽的鑒定和測(cè)序

由于組分e和g成分復(fù)雜,不適合用埃德曼降解直接多肽測(cè)序,因此首先應(yīng)用RP-HPLC-MS/MS進(jìn)行分析。鑒定多肽需要在牛皮膠原蛋白Ⅰ的數(shù)據(jù)庫中檢索從RP-HPLC-MS/MS中獲得的肽的質(zhì)量和部分序列。如圖3所示,從組分e和g中鑒定出的兩種多肽分子量分別約700 u和878 u,兩組分的質(zhì)譜圖分別如圖4(A、B)所示。圖5(A、B)為組分e和g的單電荷母離子的MS/MS譜,根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子分析得到對(duì)應(yīng)解析肽的氨基酸組成為ISVPGPM和LGPVGNPGPA。ISVPGPM的碎片離子在質(zhì)荷比500.61、401.48、304.36、247.31、551.66 和454.54顯著響應(yīng)。這些響應(yīng)強(qiáng)烈的碎片離子分別被鑒定為y5-,y4-,y3-,y2-,y1-,b5-和b6-型離子。LGPVGNPGPA的檢測(cè)方法相同。

圖3 組分e(A)和組分g(B)的RP-HPLC 圖譜Fig.3 Reverse-phase HPLC profile of fraction e(A)and g(B)

圖4 組分e(A)和組分g(B)質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrum of e(A)and g(B)

圖5 組分 e(A)和組分g(B)單電荷母離子二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.5 MS/MS spectrum of singly charged ion of e(A)and g(B)

此前有研究結(jié)果表明，水解產(chǎn)物中的小分子量組分比大分子量組分有更高的ACE抑制活性[9]。這一結(jié)果在本研究中也得到證明,因此超濾是篩選出牛皮膠原蛋白水解產(chǎn)物中有較高ACE抑制活性組分的有效方法。RP-HPLC-MS/MS方法也被報(bào)道可成功鑒定具有生物活性的多肽[15-16]。由于本實(shí)驗(yàn)中樣品的組成復(fù)雜,因此適用此方法而非埃德曼降解法。MW 5000超濾前和超濾后的粗酶水解產(chǎn)物的ACE抑制活性(IC50值為0.168 mg/mL和0.079 mg/mL)均高于Wen-Dee Chiang等的報(bào)道結(jié)果(0.67 mg/mL)[17],因此本研究的水解產(chǎn)物可能成為對(duì)抗高血壓疾病的潛在營養(yǎng)食品,但其體內(nèi)活性仍需要進(jìn)一步研究。

2.4 ACE抑制模式

通過化學(xué)合成已鑒定出的兩種ACE抑制肽ISVPGPM和LGPVGNPGPA,用Lineweave-Burk雙倒數(shù)法研究其抑制模式(圖6)。動(dòng)力學(xué)研究表明,ISVPGPM的ACE抑制模式為競(jìng)爭(zhēng)性抑制,Km值為8.49 μmol/L;LGPVGNPGPA則為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制,Km值為4.6 μmol/L。大多數(shù)ACE抑制肽的模式為競(jìng)爭(zhēng)性抑制,只有極少數(shù)為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。因此,LGPVGNPGPA的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制機(jī)理需要進(jìn)一步研究。

圖6 Lineweaver-Burk法分析多肽(A)ISVPGPM和(B)LGPVGNPGPA的ACE抑制模式Fig.6 Determination of the ACE inhibition pattern of peptide(A)ISVPGPM and(B)LGPVGNPGPA by Lineweaver-Burk plot analysis

2.5 合成肽的穩(wěn)定性和同分異構(gòu)性

研究表明一些ACE抑制肽在體內(nèi)腸胃消化時(shí)可能會(huì)失活[18-19],而一些肽則稍有不同[20]。為研究腸胃消化對(duì)ACE抑制肽的影響,模擬了肽在體內(nèi)生理環(huán)境下的消化[21-22]。應(yīng)用RP-HPLC/MS分析LSVPGPM和LGPVGNPGPA消化后的水解產(chǎn)物(圖7)。兩種抑制肽在腸胃酶的作用下部分水解。LSVPGPM的水解產(chǎn)物中,LSVPGPM、PM和LSVPG的含量分別約32.9%、12.2%和15.2%(圖7A)。LGPVGNPGPA的水解產(chǎn)物中,LGPVGNPGPA、LGPVGN、PGPA和PVGNPGPA 的含量分別為 43%、5.1%、5.9%和1.1%(圖7B)。結(jié)果表明兩種合成肽在體內(nèi)能會(huì)被部分消化。相關(guān)多肽的ACE抑制活性測(cè)定結(jié)果如表4所示。雖然產(chǎn)生的其他多肽活性均低于其原始多肽,LSVPG比LGPVGNPGPA具有更高的ACE抑制活性。這兩種肽的腸胃消化產(chǎn)物也具有ACE抑制活性,且水解復(fù)合物的活性幾乎與原始多肽一致?？赡艿脑蛑皇窃级嚯牟灰妆荒c胃蛋白酶降解,因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)其水解產(chǎn)物中原始肽所占比例最高。另一種可能性是不但RP-HPLC-MS所得短肽具有ACE抑制活性,不易檢測(cè)的肽如LG(分子量太小不易被MS檢測(cè),IC50為8.7 μmol/L)可能也具有抑制活性,甚至更高[23]。

表4 腸胃消化產(chǎn)物的ACE抑制活性Table 4 ACE inhibitory activity of the peptides generated after gastrointestinal digestion

由圖7(A、B)可知,兩個(gè)峰代表同一個(gè)多肽,表明復(fù)合物中的LSVPGPM肽具有同分異構(gòu)性。一種可能性是Pro具有兩種構(gòu)象,trans-Pro和cis-Pro構(gòu)象異構(gòu)體。trans-/cis-的異構(gòu)化基于纈氨酸-脯氨酸間肽鍵的旋轉(zhuǎn)。trans-Pro和剩余殘基的羧基基團(tuán)均位于肽鏈的同一側(cè)。然而,如果是cis-Pro構(gòu)型,這兩個(gè)基團(tuán)將被迫在肽鏈的兩側(cè)。trans-Pro 和cis-Pro之間存在著動(dòng)態(tài)平衡,平衡取決于因素如pH和溫度等[24]。一些研究顯示將trans-Pro 改為cis-Pro會(huì)導(dǎo)致ACE抑制劑的結(jié)構(gòu)及其與ACE的活性部位的相互作用發(fā)生重大變化[25]。不同的肽合成方法會(huì)影響肽構(gòu)象異構(gòu)體的組成。JoséA揭示用Boc法合成DKIHP肽會(huì)產(chǎn)生一種獨(dú)特的構(gòu)型,包含trans-Pro,且具有顯著ACE抑制活性(IC50=113.18 μmol/L),而Fmoc化學(xué)法合成的肽則產(chǎn)生三種構(gòu)型,其中兩種含trans-Pro,第三種含cis-Pro,其抑制活性較低(IC50=577.92 μmol/L)[26]。這表明,在一些肽中,順式構(gòu)型可能比反式構(gòu)型具有更高活性。本研究中,使用的是Fmoc法合成,但每個(gè)構(gòu)象異構(gòu)體的比例組成尚不明確。由于不同比例和不同構(gòu)象會(huì)影響ACE抑制活性,這些多肽的同分異構(gòu)體活性需要進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

通過優(yōu)化牛皮膠原蛋白水解方法,獲得具有抑制ACE活性的水解產(chǎn)物(IC50為0.168 mg/mL)。經(jīng)MW 5000超濾分離并進(jìn)一步進(jìn)行RP-HPLC分析,發(fā)現(xiàn)含有大量ACE抑制肽,應(yīng)用RP-HPLC-MS/MS鑒定出兩種新型ACE抑制肽,氨基酸序列分別為ISVPGPM和LGPVGNPGPA,IC50值分別為0.017 mg/mL(24.3 μmol/L)和0.077 mg/mL(87.8 μmol/L)。

本實(shí)驗(yàn)得到的牛皮水解物對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)移酶(ACE)具有抑制作用;酶解技術(shù)工藝易于放大,具有工業(yè)化生產(chǎn)的潛力;由生物酶解獲得的小分子量多肽,無毒副作用,能夠開發(fā)成降血壓保健食品或高血壓輔助治療藥物,可廣泛用于保健食品、輔助降壓藥物等產(chǎn)品,具有廣泛的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

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Two novel ACE inhibitory peptides derived from bovine skin collagen

DONG Ying1,WANG Zhan-qing1,SHEN Ju-quan2,FAN Ji-ying1,TANG Jun1,MA Zhi-ying2,SHEN Ya-ling1,*

(1.State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,School of Bioengineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China;2.Shanghai Food Research Institute,Shanghai 200235,China)

Peptidic fractions which inhibit angiotensin I-converting enzyme(ACE)were identified from bovine skin collagen. First,bovine skin collagen was hydrolyzed by an optimized method using pepsin and alcalase. Hydrolyzed collagen obtained the most active hydrolysate(inhibitory against ACE with an IC50of 0.168 mg/mL). With an ultrafiltration by MW 5000,the most active fraction of the hydrolysate was obtained(IC50of 0.079 mg/mL). After further separations with the fraction lower than MW 5000 by RP-HPLC,considerable ACE inhibitory peptides were found. Two novel ACE inhibitory were identified by RP-HPLC-MS/MS. The amino acid sequences were ISVPGPM and LGPVGNPGPA,IC50values of 0.017 mg/mL(24.3 μmol/L)and 0.077 mg/mL(87.8 μmol/L),respectively. Finally,the digestion of the two peptidesinvivophysiological environment was simulated and both of them were partly degraded. The ACE inhibitory activity of the digestive products were similar to the original polypeptides.

bovine skin collagen;hydrolysate;ACE inhibitory peptide

2016-09-01

董瑩(1983-),女,碩士研究生,研究方向:食品科學(xué),E-mail:doney0211@126.com。

*通訊作者:沈亞領(lǐng)(1960-),男,博士，教授,研究方向:生物工程,E-mail:ylshen@ecust.edu.cn。

國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(2060204);上海重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(B505)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)10-0135-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.018