竹節(jié)參總皂苷干預(yù)自然衰老大鼠肝臟炎癥的實(shí)驗(yàn)研究

向婷婷，張長(zhǎng)城，劉朝奇，王 婷，袁成福，許 成，袁 丁, 2

(三峽大學(xué)1.醫(yī)學(xué)院、2.仁和醫(yī)院，湖北 宜昌 443002)

竹節(jié)參總皂苷干預(yù)自然衰老大鼠肝臟炎癥的實(shí)驗(yàn)研究

向婷婷1，張長(zhǎng)城1，劉朝奇1，王 婷1，袁成福1，許 成1，袁 丁1, 2

(三峽大學(xué)1.醫(yī)學(xué)院、2.仁和醫(yī)院，湖北 宜昌 443002)

目的 探討竹節(jié)參總皂苷干預(yù)自然衰老大鼠肝臟炎癥的作用。方法 以自然衰老大鼠為對(duì)象，將SPF級(jí)SD大鼠按月齡分為3月齡組(3 M組)、9月齡組(9 M組)、15月齡組(15 M組)、24月齡組(24 M組)及24月齡的竹節(jié)參總皂苷(TSPJ)低、中、高劑量組，每組12只大鼠。TSPJ低、中、高劑量組的大鼠從18 M開始，分別給予竹節(jié)參總皂苷10、30、60 mg·kg-1灌胃至24個(gè)月，每周停藥1 d，連續(xù)6個(gè)月。采用HE染色觀察組織病理形態(tài)學(xué)變化，RT-PCR檢測(cè)肝臟白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL6)、白介素-12(1L-12)、白介素17α(IL-17α)、干擾素-γ(IFN-γ)mRNA的表達(dá)，Western blot檢測(cè)肝臟IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)。結(jié)果 隨著大鼠年齡的逐漸增長(zhǎng)，HE染色發(fā)現(xiàn)肝組織中肝索及肝血竇的排列紊亂加重，脂肪空泡和炎癥細(xì)胞增多，TSPJ(10、30、60 mg·kg-1)各劑量組均能在一定程度上改善其病變情況；IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17α、TNF-α、IFN-γ mRNA和IL-1β、TNF-α蛋白的表達(dá)隨著年齡的增長(zhǎng)逐漸升高，TSPJ各劑量組均在一定程度上降低其表達(dá)。結(jié)論 竹節(jié)參總皂苷對(duì)自然衰老大鼠肝臟有一定的保護(hù)作用，可能與其對(duì)抗肝臟炎癥有關(guān)。

衰老；竹節(jié)參總皂苷；肝臟；細(xì)胞因子；炎癥反應(yīng)；大鼠

衰老是生物體普遍的生理現(xiàn)象，是一個(gè)極其復(fù)雜和多因子的過程，以許多器官漸進(jìn)的退行性變化為主要特征[1]。研究顯示，隨著衰老的進(jìn)行，體內(nèi)穩(wěn)態(tài)并不能良好維持，而肝臟是最容易受到影響的器官之一。在人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟中，與衰老相關(guān)的形態(tài)學(xué)和功能學(xué)的變化包括肝血流量、脂質(zhì)積累、儲(chǔ)存脂肪和產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的肝星狀細(xì)胞的減少、腫脹以及炎性因子的增加[2]。慢性炎癥已經(jīng)被提議作為潛在的衰老以及與衰老相關(guān)的疾病的主要分子機(jī)制[3]，炎癥細(xì)胞因子在肝臟疾病中的作用受到密切關(guān)注。其中包括Th1類炎癥因子如IL-1β、IL-12、IL-6、TNF-α、IFN-γ和Th17類炎癥因子IL-17α，這些炎癥因子直接反映了肝臟內(nèi)的炎癥狀態(tài)[4]。

竹節(jié)參為五加科人參屬植物竹節(jié)參PanaxjaponicusC.A. Mey的干燥呈竹鞭狀根莖，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、散瘀止痛、止血祛痰的功效。竹節(jié)參總皂苷(total saponins ofPanaxjaponicus，TSPJ)是從竹節(jié)參塊根中提取分離而得，是竹節(jié)參的主要活性成分之一。竹節(jié)參總皂苷包括人參皂苷Re、竹節(jié)參皂苷Ⅴ、竹節(jié)參皂苷Ⅳ、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、竹節(jié)參皂苷2等[5]，多以齊墩果烷型五環(huán)三萜為主，達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜(原人參二醇、原人參三醇型)相對(duì)較少?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，竹節(jié)參總皂苷具有抗炎[6]、抗腫瘤[7]、降血脂[8]等多種藥理活性。前期研究顯示，竹節(jié)參總皂苷可以保護(hù)異煙肼、利福平以及四氯化碳所致的小鼠肝損傷[9-10]，竹節(jié)參對(duì)D-半乳糖所致的衰老具有保護(hù)效應(yīng)[11]?；诖?，本研究建立大鼠自然衰老模型，初步探討竹節(jié)參總皂苷對(duì)自然衰老大鼠肝臟炎癥的干預(yù)作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)♂ SD大鼠，購自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于空調(diào)室內(nèi)，室溫(22±2)℃，濕度(60±5)%，喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水和攝食。

1.2 藥物與試劑 竹節(jié)參的塊根購于湖北省恩施椿木營(yíng)竹節(jié)參種植基地，經(jīng)湖北省天然產(chǎn)物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄒坤教授鑒定其為五加科人參屬植物竹節(jié)參PanaxjaponicusC.A.Mey。TSPJ是由本研究團(tuán)隊(duì)提取分離，其提取分離方法參照前期研究基礎(chǔ)，提取率為18.4%，純度83.48%?？俁NA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR擴(kuò)增試劑盒，大連寶生物科技有限公司；PCR引物，生工生物工程(上海)股份有限公司；羊抗β-actin、兔抗白介素-1β(IL-1β)、兔抗腫瘤壞死因子-α(TNF-α)抗體，美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)依次為：sc-4778、sc-13968、sc-1351。羊抗兔及兔抗羊IgG-HRP，武漢科瑞有限公司；化學(xué)發(fā)光劑ECL，碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 儀器 TP1020脫水機(jī)(Leica公司)；ULTRACUTR型超薄切片機(jī)(奧地利萊卡公司)；DMIRB光學(xué)顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；Bio-Rad電源、小型垂直電泳槽[Mini-PROTEAN Tetra(1.0 mm)]及其小型Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽(Mini Trans-Blot Electrophoretic)(Bio-Rad/伯樂公司); Veriti 96孔PCR 熱循環(huán)儀(美國(guó)Applied Biosystems)；Gene Genius凝膠分析系統(tǒng)(美國(guó)SYNGNE公司)。

2 方法

2.1 分組與給藥 不同時(shí)間點(diǎn)購買3M大鼠，在三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心常規(guī)喂養(yǎng)至不同月齡進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其中3 M(3月齡)大鼠12只、9 M(9月齡)大鼠12只、15 M(15月齡)大鼠12只、18 M(18月齡)大鼠48只，將18 M大鼠分為4組，每組12只，分別是衰老對(duì)照組、TSPJ低、中、高劑量組。18 M衰老對(duì)照組每天灌胃生理鹽水，每周灌6 d停1 d,至24個(gè)月；TSPJ低、中、高劑量組分別給予TSPJ 10、30、60 mg·kg-1灌胃至24個(gè)月，每周灌6 d停1 d。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，飲水不限制。實(shí)驗(yàn)過程、實(shí)驗(yàn)研究均遵循中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)動(dòng)物倫理委員會(huì)制定的指導(dǎo)原則和要求。

2.2 肝臟HE染色 大鼠處死后，完整取出肝臟組織，稱重后，用0.9%氯化鈉注射液沖洗，用濾紙盡量沾干，快速切取肝中葉標(biāo)本，置入4%多聚甲醛中固定，脫水、石蠟包埋、切片，按標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察結(jié)果。

2.3 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá) 取50～100 mg肝組織于1.5 mL EP管中，每管加入1 mL PBS，冰上快速剪碎肝組織，1 000 r·min-1離心10 s，上清液，如此反復(fù)至上清液接近無色，上清液，然后每管加入適量蛋白裂解液和PMSF(100 ∶1)，輕輕混勻，加至玻璃勻漿器中，迅速碾磨至呈乳白色無碎塊即可，4℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取上清，加入1/5上清體積的5×上樣緩沖液，煮沸10 min，進(jìn)行Western blot，檢測(cè)肝組織IL-1β、TNF-α蛋白的表達(dá)，Image J軟件進(jìn)行分析。

2.4 RT-PCR檢測(cè)基因的表達(dá) 將提取RNA所需用品均用0.1% DEPC水處理，泡酸后洗凈的玻璃勻漿器提前于150℃烘箱中放置6 h，用前取出放在超凈臺(tái)內(nèi)。取30～70 mg肝組織于1.5 mL EP管中，加入適量TRIzol，在勻漿器中進(jìn)行組織勻漿，4℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取上清，將其轉(zhuǎn)至1.5 mL EP管中，加入1/5上清體積的氯仿，震蕩30 s，室溫靜置5 min，4℃ 12 000 r·min-1離心15 min，將其轉(zhuǎn)至新的EP管中，加入同等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置5 min，4℃ 12 000 r·min-1離心10 min，棄去上清，加入1 mL 75%乙醇于管中，洗滌沉淀，4℃ 12 000 r·min-1離心10 min，棄去上清，即得到RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作，得到cDNA。按照PCR擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min，94℃ 30 s、53℃ 30 s、72℃ 30 s循環(huán)34次，72℃ 5 min。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)mRNA的表達(dá)。PCR引物序列見Tab 1。

Tab 1 PCR primer sequence

3 結(jié)果

3.1 活體動(dòng)物觀察 實(shí)驗(yàn)期間，3M大鼠精神狀態(tài)好，活動(dòng)正常，毛發(fā)光澤，膚色紅潤(rùn)，大小便正常；隨著年齡的增長(zhǎng)，9、15、24 M大鼠精神萎靡，喜靜，活動(dòng)明顯減少，飼料消耗量比3 M少，體重增長(zhǎng)較慢；TSPJ低、中、高劑量組大鼠比24 M大鼠活躍，進(jìn)食有所增加。

3.2 肝臟大體觀察 3 M大鼠肝臟外觀顏色呈鮮紅色，邊緣銳利，表面光滑；隨著年齡的增長(zhǎng)，9、15、24 M大鼠的肝臟體積逐漸增大，邊緣變鈍，與周圍組織黏連增加，切面呈油膩狀；TSPJ低、中、高劑量組大鼠肝臟體積略有減輕，外觀色澤有所改善。見Fig 1、2。

3.3 TSPJ對(duì)自然衰老大鼠肝臟HE染色的影響 3 M大鼠肝細(xì)胞排列緊密，鏡下肝小葉結(jié)構(gòu)完整，隨著年齡的增長(zhǎng)，9、15、24 M大鼠肝臟匯管區(qū)炎性細(xì)胞、壞死細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞索排列紊亂，脂滴和假小葉明顯增加。TSPJ低、中、高劑量組在鏡下觀察發(fā)現(xiàn)TSPJ中劑量組的肝細(xì)胞和肝索的排列最為整齊，脂滴明顯減少，炎性細(xì)胞和壞死細(xì)胞數(shù)量明顯下降。見Fig 3。

Fig 1 Appearance in liver of rats in each group

A:3 M；B：9 M；C：15 M；D：24 M；E：TSPJ 10 mg·kg-1；F：TSPJ 30 mg·kg-1；G：TSPJ 60 mg·kg-1

3.4 TSPJ對(duì)自然衰老大鼠肝臟IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)的影響 如Fig 4顯示，隨著大鼠年齡的逐漸增長(zhǎng)，肝臟組織IL-1β、TNF-α蛋白的表達(dá)逐漸增加，TSPJ低、中、高劑量組能夠明顯降低其表達(dá)。

Fig 3 Pathological morphology in liver of rats in each group

A:3 M；B：9 M；C：15 M；D：24 M；E：TSPJ 10 mg·kg-1；F：TSPJ 30 mg·kg-1；G：TSPJ 60 mg·kg-1

Fig 4 Expressions of IL-1β,TNF-α protein

#P<0.05vsthree months group;*P<0.05vstwenty-four months group

3.5 TSPJ對(duì)自然衰老大鼠炎癥因子基因的影響 如Fig 5、6所示，與3M大鼠肝臟相比，隨著年齡的增長(zhǎng)，IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、IL-17α和IFN-γ mRNA表達(dá)明顯增加；與24 M相比，TSPJ低、中、高劑量組均能夠降低其表達(dá)。

Fig 5 Expressions of IL-1β,IL-6,IL-12 mRNA

#P<0.05vsthree months group;*P<0.05vstwenty-four months group

4 討論

衰老被廣泛定義為生物體隨著時(shí)間的推移，機(jī)體功能的逐漸衰退。研究發(fā)現(xiàn)，年齡的增長(zhǎng)始終伴隨著一定程度的炎癥反應(yīng)，這種炎癥反應(yīng)是一種持續(xù)的、低強(qiáng)度的狀態(tài)[12-13]。肝臟是人體至關(guān)重要的代謝器官，不僅調(diào)節(jié)體內(nèi)物質(zhì)和能量的代謝，可以產(chǎn)生多種炎癥因子，也是炎癥介質(zhì)的靶器官。肝臟炎癥反應(yīng)的變化會(huì)影響整個(gè)機(jī)體的炎癥狀態(tài)，在機(jī)體的炎癥反應(yīng)中占有舉足輕重的地位。隨著年齡的增長(zhǎng)，肝臟的功能和病理變化已經(jīng)被廣泛研究，但隨著增齡對(duì)其生理衰退的程度仍有爭(zhēng)議。因此，在分子水平全面評(píng)估其變化，可能至少解決部分問題[14]。

隨著年齡的增長(zhǎng)，衰老大鼠炎癥標(biāo)記物，如IL-1β，TNF-α,IL-6和IFN-γ的水平逐漸升高。在D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠模型中，肝臟的IL-1β，TNF-α，IL-6的基因和蛋白的表達(dá)水平均有明顯的升高[14]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17α、TNF-α、IFN-γ mRNA和IL-1β、TNF-α蛋白的表達(dá)隨著大鼠年齡的增長(zhǎng)，表達(dá)逐漸增加，提示增齡過程中肝組織的炎性因子表達(dá)的增加對(duì)機(jī)體的炎癥反應(yīng)可能具有重要作用。

Fig 6 Expressions of TNF-α，IL-17α，IFN-γ mRNA

#P<0.05vsthree months group;*P<0.05vstwenty-four months group

我們前期的實(shí)驗(yàn)研究顯示，竹節(jié)參總皂苷對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝損傷和異煙肼合用利福平所致的肝損傷具有保護(hù)作用[9-10]。此外，竹節(jié)參總皂苷能有效抑制脂多糖(LPS)刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制與竹節(jié)參總皂苷能夠調(diào)控NF-κB通路，進(jìn)而抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO的釋放，降低IL-1β、TNF-α和iNOS的表達(dá)有關(guān)[9]；竹節(jié)參皂苷Ⅴ對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有一定的抗炎作用，可能是抑制了NF-κB和MAPK信號(hào)通路[15]。

通過比較3、9、15、24 M和竹節(jié)參總皂苷不同劑量組大鼠的體重，我們發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長(zhǎng)，大鼠肝臟重量逐漸增加，而竹節(jié)參各劑量組均能一定程度上降低其肝臟重量，其中竹節(jié)參中劑量組降低的最為明顯。

本實(shí)驗(yàn)通過HE染色，觀察到隨著年齡的增長(zhǎng)，大鼠肝臟組織中脂肪空泡和炎性細(xì)胞增加明顯，肝細(xì)胞由原先的放射狀排列到排列紊亂加重，肝索之間間隔變大，竹節(jié)參低、中劑量組可以明顯改善其病變程度，脂肪空泡和炎性細(xì)胞數(shù)量明顯降低，肝細(xì)胞排列趨近整齊。竹節(jié)參高劑量組肝索間距沒有很大的變化，但是脂肪空泡和炎性細(xì)胞明顯減少，說明竹節(jié)參各劑量組在一定程度上可以降低肝臟組織病變的程度，其中竹節(jié)參低、中劑量組效果更為明顯。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，竹節(jié)參總皂苷各劑量組均在一定程度上降低了衰老大鼠肝臟炎性因子表達(dá)，使IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17α、TNF-α、IFN-γ mRNA和IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)降低。因此，竹節(jié)參總皂苷可能是通過改善大鼠肝臟組織炎癥反應(yīng)來保護(hù)自然衰老大鼠的肝臟功能。本研究將為衰老中炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制及相應(yīng)的干預(yù)措施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥理科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成。感謝實(shí)驗(yàn)室中心、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心以及三峽大學(xué)腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供的幫助和支持，同時(shí)感謝本課題組老師和同學(xué)們?cè)趯?shí)驗(yàn)過程中的指導(dǎo)和幫助。)

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Effects of total saponins ofPanaxjaponicuson liver inflammation natural aging rats

XIANG Ting-ting1,ZHANG Chang-cheng1,LIU Chao-qi1,WANG Ting1,YUAN Cheng-fu1,XU Cheng1, YUAN Ding1,2

(1.CollegeofMedicine, 2.RenheHospital,ThreeGorgesUniversity,YichangHubei443002,China)

Aim To study the effects of total saponins ofPanaxjaponicus(TSPJ) on liver inflammation of natural aging rats.Methods The experimental rats were allocated into seven groups (twelve rats in each group): three months group, nine months group, fifteen months group, twenty-four months group, and TSPJ low-, mid- and high-dose groups(10, 30, 60 mg·kg-1). When the rats were eighteen months old, the TSPJ low-, mid-and high-dose groups of rats were given lavage treatments with TSPJ 10,30, 60 mg·kg-1respectively until twenty-four months.During lavage, we stopped a day every week for six consecutive months. HE staining was used to observe the pathological morphological changes. Western blot was utilized to test IL-1β and TNF-α protein expressions. RT-PCR method was adopted to test IL-1β, IL-6, IL-12, IL-17α, TNF-α, IFN-γ mRNA expressions.Results HE staining observation showed that as the rats grew older the hepatic cord and sinusoid were arranged in more severe disorder, and the fat vacuole and inflammatory cells were increased significantly. While every dose group of TSPJ could improve these pathological changes distinctly. The IL-1β, TNF-α protein and IL-1β, IL-6, IL-12, IL-17α, TNF-α, IFN-γ mRNA expressions were increased gradually as the rats grew older, and every dose group of TSPJ could reduce their expressions to some extent.Conclusion TSPJ could protect the aging rat liver to some extent by inhibiting the liver inflammation.

aging; total saponins ofPanaxjaponicus; liver; cytokines; inflammatory responses; rat

時(shí)間：2017-5-25 17:44 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.040.html

2017-02-26,

2017-03-24

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 31570329)

向婷婷(1991-)，女，碩士，研究方向：中藥藥理學(xué)，E-mail：xiangtingtingsxdx@outlook.com； 袁 丁(1964-)，男，博士，教授，研究方向：中藥藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：yxyydyd@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.020

A

1001-1978(2017)06-0848-06

R-332；R284.1；R322.47；R339.38；R392.12；R364.5；R575.1