嗜熱子囊菌JCM12803的α-半乳糖苷酶基因tcgal27A在畢赤酵母中的表達(dá)

張多多鄭菲羅會(huì)穎李中媛羅學(xué)剛

（1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081；3北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

嗜熱子囊菌JCM12803的α-半乳糖苷酶基因tcgal27A在畢赤酵母中的表達(dá)

張多多1鄭菲2，3羅會(huì)穎2李中媛1羅學(xué)剛1

（1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081；3北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

從嗜熱子囊菌（Thermoascus crustaceus）JCM12803克隆α-半乳糖苷酶基因，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)的研究，旨為獲得工業(yè)應(yīng)用性質(zhì)優(yōu)良的α-半乳糖苷酶。通過(guò)RT-PCR方法從T. crustaceus JCM12803中克隆α-半乳糖苷酶基因序列，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)的分析。結(jié)果顯示，tcgal27A屬于糖苷水解酶27家族，基因全長(zhǎng)1 918 bp，含有4個(gè)內(nèi)含子，cDNA全長(zhǎng)1 419 bp，編碼472個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)tcgal27A N端含有24個(gè)氨基酸為其可能的信號(hào)肽。將TCGal27A在畢赤酵母中成功地進(jìn)行了表達(dá)，所獲得的重組TCGal27A具有高比活（336.5 U/mg）及寬泛的底物特異性，對(duì)蜜二糖（14.4 U/mg）、棉子糖（9.1 U/mg）、角豆膠（3.6 U/ mg）、魔芋粉（1.6 U/mg）、瓜爾豆膠（1.3 U/mg）、水蘇糖（0.7 U/mg）都有著不同程度的降解作用。以pNPG為底物時(shí)的Km值為1.6 mol/mL，Vmax為536.8 μmoL/（min·mg）。TCGal27A的最適作用pH為4.5，最適溫度為65℃，50℃處理1 h之后酶活力還能保持86.0%。這些結(jié)果表明耐高溫TCGal27A性質(zhì)優(yōu)良，可添加到飼料中，在消化和提高豆粕蛋白能量利用率方面有良好的潛在應(yīng)用價(jià)值。

嗜熱真菌；α-半乳糖苷酶；熱穩(wěn)定性；異源表達(dá)

α-半乳糖苷酶又稱(chēng)蜜二糖酶，可特異性水解底物中的α-1，6-半乳糖苷鍵，釋放出末端的半乳糖殘基。底物包括分支多糖（如半乳甘露聚糖）、半乳糖寡糖（如棉子糖、蜜二糖和水蘇糖）和半乳糖脂［1］。按照氨基酸序列一級(jí)結(jié)構(gòu)的相似性和疏水基團(tuán)可以把糖苷水解酶分成133個(gè)家族，其中α-半乳糖苷酶被劃分到4、27、32、36、57、97和110這7個(gè)不同的糖苷水解酶家族中［2］，其中對(duì)27家族和36家族α-半乳糖苷酶的研究比較深入，大多數(shù)真菌來(lái)源的α-半乳糖苷酶都屬于27家族。

α-半乳糖苷酶可以廣泛的應(yīng)用在飼料、食品、化學(xué)、造紙和醫(yī)療等行業(yè)［3-5］，它們可以增加通用血型，提高糖結(jié)晶產(chǎn)量［6］，改善紙漿漂白［7］，增強(qiáng)動(dòng)物飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［8］，從豆?jié){中除去棉子糖［9］，治療法布里疾?。?0］可提高瓜爾豆膠的流變性［8，11］。目前α-半乳糖苷酶工業(yè)化產(chǎn)品主要是通過(guò)動(dòng)植物提取和篩選微生物菌株發(fā)酵獲得，然而這些傳統(tǒng)的方法存在著酶活低、熱穩(wěn)定性差、生產(chǎn)效率不高等弊端，大大影響了α-半乳糖苷酶在工業(yè)生產(chǎn)及其他領(lǐng)域的應(yīng)用［12］。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，許多來(lái)源于微生物的α-半乳糖苷酶序列得以明確［13，14］，因此利用現(xiàn)代基因工程手段來(lái)提高酶的產(chǎn)量和簡(jiǎn)化提取條件成為研究的熱點(diǎn)。到目前為止，已經(jīng)有多個(gè)不同來(lái)源的α-半乳糖苷酶基因被克隆并在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了異源表達(dá)。本研究從嗜熱子囊菌（Thermoascus crustaceus）JCM12803中克隆得到一個(gè)新的α-半乳糖苷酶基因tcgal27A，構(gòu)建了高效表達(dá)的畢赤酵母基因工程菌株，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)的研究，以期獲得工業(yè)應(yīng)用的性質(zhì)優(yōu)良的α-半乳糖苷酶。

1 材料與方法

1.1 材料

Thermoascus crustaceus JCM12803購(gòu)自日本微生物保藏中心；畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115和質(zhì)粒pPIC9為本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌（Escherichia coli）Trans1-T1和質(zhì)粒pEASY-T3購(gòu)自Transgen公司。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：15 g/L 豆粕，15 g/L 麥麩，15 g/L 玉米芯以及5 g/L的NaCl，1 g/L KH2PO4，5 g/L（NH4）2SO4，0.5 g/L MgSO4.7H2O，0.01 g/L FeSO4.7H2O，以及0.2 g/L CaCl2挑取1環(huán)絲狀真菌接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)2-3 d。

對(duì)硝基苯酚-α-D-半乳糖苷（4-nitrophenyl α-D-galactopyranoside，pNPG）、蜜二糖、棉子糖、水蘇糖購(gòu)買(mǎi)自Sigma公司；質(zhì)粒小提中量試劑盒購(gòu)買(mǎi)自北京天根生化科技有限公司；SV Total RNA Isolation kit購(gòu)買(mǎi)自Promega公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)買(mǎi)自O(shè)MEGA公司；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis Super MIX和FastPfu DNA聚合酶購(gòu)買(mǎi)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Taq酶和限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)買(mǎi)自TaKaRa公司；T4DNA連接酶購(gòu)買(mǎi)自New England Biolabs公司。

1.2 方法

1.2.1 半乳糖苷酶基因tcgal27A的克隆 提取T. crustaceus JCM12803的 總RNA， 反 轉(zhuǎn) 成cDNA，以cDNA為 模 板 設(shè) 計(jì) 引 物12803GH27-1-F和12803GH27-1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到T. crustaceus JCM12803來(lái)源的半乳糖苷酶cDNA序列。用軟件預(yù)測(cè)信號(hào)肽序列，根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，設(shè)計(jì)去除信號(hào)肽序列并帶有酶切位點(diǎn)的引物TCGal27A-F/TCGal27A-R引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

表1 本文中所用引物

1.2.2 真核表達(dá)載體pPIC9/tcgal27A的構(gòu)建 利用含有酶切位點(diǎn)的引物TCGal27A-F/TCGal27A-R，以pEASY-T3/tcgal27A質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的條件為：95℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃退火30 s，72℃延伸2 min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收后進(jìn)行雙酶切（SnaBⅠ/NotⅠ），目的片段連接pPIC9轉(zhuǎn)化入TransI-T1中并進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選。

1.2.3 重組酶TCGal27A在畢赤酵母中的表達(dá)與純化 將含有TCGal27A的pPIC9的質(zhì)粒進(jìn)行線(xiàn)性化（DraⅠ）并電轉(zhuǎn)入GS115感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行陽(yáng)性克隆子的篩選，陽(yáng)性克隆子活性的檢測(cè)方法參照［15］。將酶活高的菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，從MD平板上挑取酶活較高的轉(zhuǎn)化子接種于400 mL BMGY液體培養(yǎng)基中，30℃、260 r/min搖床振蕩培養(yǎng)2 d后更換培養(yǎng)基為200 mL含有0.5%甲醇的BMMY 液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d，為補(bǔ)償甲醇的損失，每隔12 h補(bǔ)加一次甲醇溶液，使甲醇濃度維持在0.5%左右，12 000 r/min離心10 min收集酶液，首先用10 kD的膜包除掉小分子的雜質(zhì)初步濃縮粗酶液，其次，用7 kD透析袋進(jìn)行脫鹽處理。將收集的鹽濃度低的酶液加入平衡好的HiTrap Q XL陰離子柱，用0.1 mol濃度的NaCl進(jìn)行梯度洗脫，流速為2.0 mL/min，且分步收集洗脫下來(lái)的酶液。并對(duì)各個(gè)管中洗脫液的半乳糖苷酶活性進(jìn)行測(cè)定。收集對(duì)應(yīng)管中的酶液，并進(jìn)行濃縮。將收集的酶液進(jìn)行N-糖基化的脫糖基處理，重組酶經(jīng)Endo H在37℃下處理2 h后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.2.4 酶活力測(cè)定 依據(jù)底物的不同α-半乳糖苷酶的酶活力測(cè)定方法有如下3種，見(jiàn)表2。

一個(gè)酶活單位（U）定義：在最適反應(yīng)條件下，每分鐘分解pNPG生成1 μmol的pNP所需要的酶量。

表2 α-半乳糖苷酶的酶活力測(cè)定方法

1.2.5 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 在干凈的酶標(biāo)條中加入20 μL適當(dāng)稀釋的待測(cè)樣品，然后加入200 μL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，混勻37℃顯色10 min后，測(cè)定595 nm波長(zhǎng)處吸光值（OD595）。根據(jù)測(cè)得的吸光值和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)含量（mg/mL）。

1.2.6 重組酶TCGal27A酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.2.6.1 α-半乳糖苷酶最適pH和最適溫度的測(cè)定 α-半乳糖苷酶的最適pH值是在以下pH條件下（2.0-10.0）進(jìn)行測(cè)定的。所用緩沖液為：pH 2.0的甘氨酸-鹽酸緩沖液，pH 3.0-8.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，pH 8.0-9.0的Tris-HCl緩沖液，以及pH 9.0-10.0的Gly-NaOH緩沖液。并用對(duì)應(yīng)pH的緩沖液將酶液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，65℃下準(zhǔn)確保溫5 min，以測(cè)定其酶活力。根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制最適pH曲線(xiàn)。α-半乳糖苷酶的最適溫度是用最適pH 4.5的0.2 mol/L的McIlvaine緩沖液及不同溫度（40-80℃）下進(jìn)行準(zhǔn)確保溫5 min測(cè)定其酶活力，根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制最適溫度曲線(xiàn)。

1.2.6.2 α-半乳糖苷酶pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性的測(cè)定 將酶液在不同pH的緩沖液（2.0-8.0）下于37℃下處理1 h，在重組酶TCGal27A的最適反應(yīng)條件（65℃、pH 4.5）下測(cè)定其殘余酶活力，以未保溫的酶液的酶活力作為對(duì)照（100%）計(jì)算，繪制重組酶TCGal27A的pH穩(wěn)定曲線(xiàn)。將稀釋一定倍數(shù)的α-半乳糖苷酶在50℃、60℃和70℃下分別保溫處理2、5、10、20、30、60 min后，測(cè)定其殘余酶活力，以未保溫的酶液的酶活力作為對(duì)照（100%）計(jì)算，繪制重組酶TCGal27A的熱穩(wěn)定曲線(xiàn)。

1.2.6.3 金屬離子和相關(guān)化學(xué)試劑對(duì)酶活的影響 在α-半乳糖苷酶酶促反應(yīng)體系中加入各種不同的金屬離子及化學(xué)試劑（Na+，K+，Ca2+，Ni2+，Cu2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，F(xiàn)e3+，Cr3+，β-巰基乙醇，EDTA和SDS），分別使這些離子和化學(xué)試劑的終濃度達(dá)至5 mmol/L。在該酶的最適反應(yīng)條件（65℃、pH 4.5）下測(cè)定生成的總還原糖的量，計(jì)算酶活力，以未用以上試劑處理的酶液作為對(duì)照。

1.2.6.4 α-半乳糖苷酶比活力的測(cè)定 比活力單位的定義為：每毫克酶蛋白所具有的酶活力單位數(shù)。通過(guò)pNPG法測(cè)TCGal27A酶液的酶活力單位，再通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量，由此計(jì)算得到TCGal27A的比活力。

1.2.6.5 α-半乳糖苷酶酶促反應(yīng)初速度Vmax和Km的測(cè)定 在最適條件下以不同濃度的pNPG（0.2、0.25、0.3、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL）為底物，加入純化后適當(dāng)稀釋的重組酶進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后加入1.5 mL 1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，測(cè)定吸光度值OD405，以1/［s］為橫坐標(biāo)，1/v為縱坐標(biāo)繪制曲線(xiàn)，得出該酶在以pNPG為底物時(shí)的Km和Vmax值。

1.2.6.6 α-半乳糖苷酶底物特異性的測(cè)定 pNP糖苷類(lèi)底物的酶活力測(cè)定方法參照 1.2.4；棉子糖和水蘇糖酶活力測(cè)定采用DNS法（Miller，1959），參照 1.2.4；蜜二糖底物酶活力測(cè)定采用GOD-POD 法，參照 1.2.4；LBG、魔芋粉和瓜爾豆膠酶活力測(cè)定：900 μL的0.5%底物，加入100 μL稀釋適當(dāng)倍數(shù)的酶液進(jìn)行反應(yīng)，在最適條件下水浴10 min，最后加入1.5 mL DNS進(jìn)行終止反應(yīng)，煮沸5 min，冷卻，測(cè)定OD540下的吸光值。

2 結(jié)果

2.1 α-半乳糖苷酶基因tcgal27A的克隆

T. crustaceus JCM12803由上海銳翌生物科技有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序。通過(guò)測(cè)序的結(jié)果設(shè)計(jì)引物，提取T. crustaceus JCM12803的總RNA進(jìn)行RTPCR，通過(guò)特異性引物獲得該基因的cDNA，cDNA連接T3載體后測(cè)序。測(cè)序正確后進(jìn)行質(zhì)粒提取，用含有酶切位點(diǎn)的特異性引物進(jìn)行PCR，進(jìn)行雙酶切（SnaBⅠ/NotⅠ），目的片段連接pPIC9轉(zhuǎn)化入TransI-T1中并進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選。

2.2 基因序列分析

來(lái)源于T. crustaceus JCM12803的α-半乳糖苷酶基因tcgal27A全長(zhǎng)為1，918 bp，含有4個(gè)內(nèi)含子。cDNA全長(zhǎng)1，419 bp，編碼472個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子。用軟件SignalP預(yù)測(cè)的tcgal27A N端含有24個(gè)氨基酸為其可能的信號(hào)肽。Vector分析tcgal27A不含有SnaBⅠ，NotⅠ和DraⅠ等三個(gè)酶切位點(diǎn)，tcgal27A所編碼的成熟蛋白等電點(diǎn)為4.8，理論分子量為49.4 kD。BlastP分析結(jié)果顯示tcgal27A推導(dǎo)的氨基酸序列與Rasamsonia emersonii CBS 393.64來(lái)源的27家族半乳糖苷酶最相似，相似度為74%。

2.3 真核表達(dá)載體pPIC9/tcgal27A的構(gòu)建

用分別含有SnaBⅠ和NotⅠ的引物擴(kuò)增得到不含信號(hào)肽的α-半乳糖苷酶cDNA序列（tcgal27A），以正確的閱讀方式克隆到表達(dá)載體pPIC9上，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒（pPIC9/ tcgal27A）。

圖1 重組酶TCGal27A的SDS-PAGE分析

2.4 重組酶TCGal27A的表達(dá)純化與SDS-PAGE分析

重組表達(dá)載體pPIC9/tcgal27A經(jīng)過(guò)小管誘導(dǎo)培養(yǎng)，篩選出高酶活的菌株，并在搖床水平上甲醇誘導(dǎo)48 h。通過(guò)酶活力測(cè)定和SDS-PAGE初步確定了TCGal27A在畢赤酵母中成功表達(dá)。將搖瓶表達(dá)的TCGal27A粗酶液用10 kD膜包濃縮，7 kD的透析袋透析脫鹽后，通過(guò)HiTrap Q XL陰離子凝膠層析進(jìn)一步純化，收集洗脫峰并進(jìn)一步濃縮，得到酶活力為24.9 U/ml比活力336.5 U/mg的α-半乳糖苷酶。純化后的TCGal27A經(jīng)過(guò)SDS-PAGE鑒定為電泳純的單一條帶，分子質(zhì)量大約為48.1 kD（第2泳道），第1泳道為endo-H處理后的，可以看出明顯的糖基化修飾。

2.5 重組酶TCGal27A酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

2.5.1 pH和溫度對(duì)TCGal27A的影響 TCGal27A的最適作用 pH、pH 穩(wěn)定性、最適作用溫度及熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 TCGal27A的酶學(xué)性質(zhì)

由圖可知TCGal27A α-半乳糖苷酶的最適作用pH為4.5，在pH 3.5-5.0保持62.4%以上的相對(duì)酶活性，37℃下pH 3.0-7.0處理1 h后，TCGal27A能保持62.0%以上的酶活力；最適溫度為65℃，在55-65℃范圍內(nèi)保持72.4%以上的相對(duì)酶活性，50℃處理1 h之后TCGal27A的酶活力還能保持86.0%。

2.5.2 不同金屬離子及部分化學(xué)試劑對(duì)TCGal27A的影響 金屬離子及不同化學(xué)試劑對(duì)α-半乳糖苷酶活性的影響結(jié)果見(jiàn)表4 。

Fe3+對(duì)酶有一定的抑制作用；其他金屬離子對(duì)酶活力沒(méi)有明顯的促進(jìn)與抑制作用。SDS作為一種蛋白變性劑，對(duì)酶活力的有一定抑制作用，5 mmol的EDTA對(duì)酶活力的影響不大，相比于未處理的原酶液，酶活力有96.4%。

2.5.3 α-半乳糖苷酶TCGal27A動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定 按照雙倒數(shù)作圖法繪制曲線(xiàn)，分別求得α-半乳糖苷酶對(duì)pNPG的Km及Vmax值。根據(jù)所繪制的曲線(xiàn)，計(jì)算得到TCGal27A對(duì)pNPG底物的Km及Vmax值分別為1.6 mol/mL、536.8 μmoL/（min·mg）。

2.5.4 α-半乳糖苷酶TCGal27A比活性的測(cè)定 取純化后的TCGal27A酶液通過(guò)pNPG法測(cè)得其酶活力為25.0 U/mL，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得蛋白含量為52.9 μg/mL，經(jīng)計(jì)算得α-半乳糖苷酶TCGal27A的比活為336.5 U/mg。

2.5.5 α-半乳糖苷酶的底物特異性 該α-半乳糖苷酶可以降解蜜二糖、棉子糖和水蘇糖，也可降解多糖類(lèi)的角豆膠、魔芋粉、瓜爾豆膠。比活力由高到低依次為，蜜二糖（14.4 U/mg）＞棉子糖（9.1 U/mg）＞角豆膠（3.6 U/mg）＞魔芋粉（1.6 U/mg）＞瓜爾豆膠（1.3 U/mg）＞水蘇糖（0.7 U/mg）

3 討論

目前，工業(yè)上用的α-半乳糖苷酶主要來(lái)源于絲狀真菌，如曲霉屬，木霉屬和青霉屬［16］，由于它們多為細(xì)胞外表達(dá)，且pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性較好，所以多用于工業(yè)生產(chǎn)［17］。由于野生菌的發(fā)酵表達(dá)水平低下，因此為了降低工業(yè)生產(chǎn)成本，目前已構(gòu)建了許多不同異源宿主的重組菌株，例如，人類(lèi)的α-半乳糖苷酶已在大腸桿菌和嗜冷假交替單胞菌（Pseudoalteromonas haloplanktis）進(jìn)行了異源表達(dá)［18］。盡管真核生物的α-半乳糖苷酶基因可以大腸桿菌中得到復(fù)制，但其蛋白質(zhì)產(chǎn)物往往均是無(wú)活性的包涵體。雖然利用嗜冷表達(dá)系統(tǒng)中可以產(chǎn)活性蛋白，但是產(chǎn)率低下，而且低溫生產(chǎn)制造過(guò)程成本過(guò)高。釀酒酵母［19］和巴斯德畢赤酵母［20］等酵母表達(dá)系統(tǒng)則具有活性好、表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，從而有利于真核生物α-半乳糖苷酶的生產(chǎn)。例如，來(lái)自Bispora sp. MEY-1、Penicillium sp. F63、Rhizomucor miehei等的α-半乳糖苷酶基因都已在酵母中實(shí)現(xiàn)了有效的胞外表達(dá)，在甲醇誘導(dǎo)96 h后，利用pNPG法測(cè)的酶活分別為1.5 U/mL［21］，111 U/mL和240 U/mL［22］。

在本研究中，首次克隆鑒定了T. crustaceus JCM12803中的α-半乳糖苷酶TCGal27A，并利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行了重組表達(dá)，TCGal27A具有高比活（336.5 U/mg）。真菌和酵母來(lái)源的α-半乳糖苷酶與細(xì)菌來(lái)源的α-半乳糖苷酶在酶學(xué)性質(zhì)方面相差較大，真菌來(lái)源α-半乳糖苷酶的最適pH一般在4.5-5.5，和大多數(shù)真菌來(lái)源的α-半乳糖苷酶一樣，TCGal27A的最適作用pH為4.5。不過(guò)，相對(duì)于其它真菌半乳糖苷酶而言，TCGal27A有著較高的作用溫度和最適反應(yīng)溫度，最適溫度為65℃，在50℃處理1 h仍保持86.0%以上的酶活。雖然上述來(lái)自Bispora sp. MEY-1、Penicillium sp. F63、Rhizomucor miehei的半乳糖苷酶均實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，但最適溫度分別為55℃、40℃、55℃，且在65℃僅剩較低的相對(duì)酶活。而TCGal27A能在65℃保持336.5 U/mg的比活，說(shuō)明TCGal27A是一種新的酸性，耐熱的α-半乳糖苷酶。

豆類(lèi)餅粕飼料中含有一些單胃動(dòng)物不能進(jìn)行消化的α-半乳糖苷的多聚糖和低聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)因子。其中低聚糖主要是游離的水蘇糖、棉子糖等，較高濃度的此類(lèi)游離水溶性低聚糖會(huì)造成食糜度增高，不利于動(dòng)物的消化和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。但是如果在飼料中加入α-半乳糖苷酶、蛋白酶和果膠酶就能有效地提高豆粕蛋白能量利用率并且改善消化，酶在加工應(yīng)用過(guò)程中要先經(jīng)受原料混合、加工高溫制粒后才在動(dòng)物胃腸道溶解發(fā)生作用，所以酶制劑的溫度和穩(wěn)定性倍受關(guān)注［23］。TCGal27A的最適溫度為65℃，在飼料的低溫65℃制粒過(guò)程中可以保持良好的酶活力，因此本研究中的耐高溫TCGal27A即可添加到飼料中實(shí)現(xiàn)此應(yīng)用。

表4 不同金屬離子及部分化學(xué)試劑對(duì)TCGal27A活性的影響

4 結(jié)論

本研究成功從嗜熱真菌T. crustaceus JCM12803克隆到一個(gè)α-半乳糖苷酶基因，與R. emersonii CBS 393.64來(lái)源的α-半乳糖苷酶序列一致性很高，相似性74%，具有一定的新穎性。通過(guò)畢赤酵母系統(tǒng)對(duì)該酶進(jìn)行了異源表達(dá)，該酶具有良好的酶學(xué)性質(zhì)，TCGal27A具有高比活（336.5 U/mg）及寬泛的底物特異性。TCGal27A最適pH為4.5，在pH為3.5-5.0基本保持62.4%以上的相對(duì)酶活性，其最適溫度為65℃，在50℃處理1 h仍保持86.0%以上的酶活。本研究中的耐高溫TCGal27A可添加到飼料中，在消化和提高豆粕蛋白能量利用率方面有良好的潛在應(yīng)用價(jià)值。

［1］ Golotin VA, Balabanova LA, Noskova YA, et al. Optimizationof cold-adapted alpha-galactosidase expression in Escherichia coli［J］. Protein Expression & Purification, 2016, 123：14-18.

［2］ Weignerová L, Simerská P, K?en V. α-Galactosidases and their applications in biotransformations［J］. Biocatalysis & Biotransformation, 2009, 27（2）：79-89.

［3］ Gant er C, B?ck A, et al. Production of thermostable recombinant alpha-galactosidase suitable for raffinose elimination from sugar beet syrup［J］. Journal of Biotechnology, 1988, 8（4）：301-310.

［4］ Prashanth SJ, Mulimani VH. Soymilk oligosaccharide hydrolysis by Aspergillus oryzae, α-galactosidase immobilized in calcium alginate［J］. Process Biochemistry, 2005, 40（3-4）：1199-1205.

［5］ Lenny LL, Hurst R, Goldstein J, et al. Transfusions to group O subjects of 2 units of red cells enzymatically converted from group B to group O［J］. Transfusion, 1994, 34（3）：209-214.

［6］ Ganter C, Bock, A, et al. Production of thermostable, recombinant α-galactosidase suitable for raffinose elimination from sugar beet syrup［J］. Journal of Biotechnology, 1988, 8（4）：301-310.

［7］ Clarke JH, Davidson K, Rixon JE, et al. A comparison of enzymeaided bleaching of softwood paper pulp using combinations of xylanase, mannanase and α-galactosidase［J］. Applied Microbiology & Biotechnology, 2000, 53（53）：661-667.

［8］ Ghazi S, Rooke JA, Galbraith H. Improvement of the nutritive value of soybean meal by protease and a-galactosidase treatment in broiler cockerels and broiler chicks［J］. British Poultry Science, 2003, 44（3）：410-418.

［9］ Cao Y, Yuan T, et al. Properties of a novel α-galactosidase from Streptomyces, sp. S27 and its potential for soybean processing［J］. Enzyme & Microbial Technology, 2010, 47（7）：305-312.

［10］ Germain DP, Charrow J, Desnick RJ, et al. Ten-year outcome of enzyme replacement therapy with agalsidase beta in patients with Fabry disease. ［J］. Journal of Medical Genetics, 2015, 52（5）：353-358.

［11］ Kurakake M, Okumura T, Morimoto Y, et al. Synthesis of galactosyl glycerol from guar gum by transglycosylation of α-galactosidase from Aspergillus sp. MK14［J］. Food Chemistry, 2015, 172：150-154.

［12］ Carrera-Silva EA, Silvestroni A, Leblanc JG, et al. A Thermostable α-Galactosidase from Lactobacillus fermentum, CRL722：Genetic Characterization and Main Properties［J］. Current Microbiology, 2006, 53（5）：374-378.

［13］ Halstead JR, Fransen MP, Eberhart RY, et al. alpha-Galactosidase A from Pseudomonas fluorescens subsp. cellulosa：cloning, high level expression and its role in galactomannan hydrolysis［J］. Fems Microbiology Letters, 2000, 192（2）：197-203.

［14］ Jindou S, Karita S, Fujino E, et al. alpha-Galactosidase Aga27A, an enzymatic component of the Clostridium josui cellulosome［J］. Journal of Bacteriology, 2002, 184（2）：600-604.

［15］ Luo HY, Wang K, Huang HQ, et al. Gene cloning, expression, and biochemical characterization of an alkali-tolerant β-mannanase from Humicola insolens, Y1［J］. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2012, 39（4）：547-555.

［16］ Manzanares P, de Graaff LH, Visser J. Characterization of galactosidases from Aspergillus niger：purification of a novel alphagalactosidase activity. ［J］. Enzyme & Microbial Technology, 1998, 22（5）：383-390.

［17］ Aleksieva P, Tchorbanov B, Nacheva L. High-Yield Production of Alpha-Galactosidase Excreted from Penicillium chrysogenum and Aspergillus niger［J］. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 2010, 24（1）：1620-1623.

［18］ Unzueta U, Accardi G, Mendoza R, et al. Strategies for the production of difficult-to-express full-length eukaryotic proteins using microbial cell factories：production of human alphagalactosidase A. ［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99（14）：5863-5874.

［19］ Shibuya H, Nagasaki H, Kaneko S, et al. Cloning and highlevel expression of alpha-galactosidase cDNA from Penicillium purpurogenum［J］. Applied & Environmental Microbiology, 1998, 64（11）：4489-94.

［20］ Jindou S, Karita S, Fujino E, et al. alpha-Galactosidase Aga27A, an enzymatic component of the Clostridium josui cellulosome. ［J］. Journal of Bacteriology, 2002, 184（2）：600-4.

［21］ Wang H, Luo H, Li J, et al. An α-galactosidase from an acidophilic Bispora sp. MEY-1 strain acts synergistically with β-mannanase［J］. Bioresource Technology, 2010, 101（21）：8376-82.

［22］ Chen Z, Yan Q, Jiang Z, et al. High-level［J］. Protein Expression & Purification, 2015, 110：107-114.

［23］ 王春林, 陸文清. 飼用α-半乳糖苷酶穩(wěn)定性及酶學(xué)特性的研究［J］. 中國(guó)飼料, 2010（6）：14-16.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Expression of α-Galactosidases from Thermoascus crustaceus JCM12803 in Pichia pastoris

ZHANG Duo-duo1ZHENG Fei2，3LUO Hui-ying2LI Zhong-yuan1LUO Xue-gang1
（1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology of the Ministry of Education & Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457；2. Key Laboratory for Feed Biotechnology of the Ministry of Agriculture，F(xiàn)eed Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081；3. College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083）

This work is to clone the α-galactosidase gene from Thermoascus crustaceus JCM12803 and systematically study its enzymatic properties for obtaining high-quality α-galactosidase in industry. The gene sequence of α-galactosidase was cloned from T. crustaceus JCM12803 by RT-PCR and its enzymatic properties were systematically analyzed. As results revealed，the full-length of tcgal27A belonging to glycoside hydrolase 27 was 1 918 bp，contained 4 introns，the cDNA of tcgal27 was 1 419 bp，and encoded 472 amino acids. SignalP analysis indicated 24 residues in the N-terminal of tcgal27 might be signal peptides. Recombinant TCGal27A successfully expressed in Pichia pastoris had a high specific activity（336.5 U/mg），and the broad substrate specificity，i.e.，presenting different degrees of degradation to melibiose（14.4 U/ mg），raffinose（9.1 U/mg），gum tragon（3.6 U/mg），konjaku flour（1.6 U/mg），guar gum（1.3 U/mg），stachyose（0.7 U/mg）. Using pNPG as the substrate，the Km and Vmax of TCGal27A were determined to be 1.6 mol/mL and 536.8 μmoL/（min·mg），respectively. Like most fungal a-galactosidases，TCGal27A had an optimal acidic pH 4.5. Purified recombinant TCGal27A was thermophilic，exhibiting themaximum activity at 65℃，and the enzyme remained 86% of initial activity at 50℃ for 1 h. All above results imply that heat-tolerant protein TCGal27A with excellent enzymatic properties can be additive for feedstuff，and will be solid potential applicable value in digesting and improving the energy utilization ratio of soybean meal protein.

Thermoascus crustaceus JCM12803；α-galactosidase；thermophilic；heterologous expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1083

2017-01-13

國(guó)家杰出青年科學(xué)基金（31225026）

張多多，女，研究方向：微生物與生化藥學(xué)；E-mail：zhangduoduo160@163.com

羅學(xué)剛，男，研究方向：益生菌、功能食品及生物技術(shù)藥物的研究與開(kāi)發(fā)；E-mail：luoxuegang@tust.edu.cn