桂花類胡蘿卜素異構(gòu)酶基因的克隆及表達(dá)分析

張超 劉玉成 王藝光 付建新 趙宏波

（浙江農(nóng)林大學(xué)風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，臨安 311300）

桂花類胡蘿卜素異構(gòu)酶基因的克隆及表達(dá)分析

張超 劉玉成 王藝光 付建新 趙宏波

（浙江農(nóng)林大學(xué)風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，臨安 311300）

利用已構(gòu)建的桂花‘堰虹桂’花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中Unigene序列信息，結(jié)合RT-PCR技術(shù)對1個桂花類胡蘿卜素異構(gòu)酶基因（OfCRTISO）的最大閱讀框進(jìn)行擴(kuò)增，并測序驗證。生物信息學(xué)分析表明OfCRTISO基因含有長為1 842 bp的開放讀碼框，編碼613個氨基酸殘基。桂花OfCRTISO與已知胡麻科和茄科植物的CRTISO序列相似性最高，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)OfCRTISO與芝麻CRTISO（XP_011077785）親緣關(guān)系最近，聚為同一小支。表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，OfCRTISO基因在桂花‘堰虹桂’花蕾前期花序中的表達(dá)量極低，花蕾后期其表達(dá)量逐漸增加，初開期達(dá)到高峰，而盛開期時，其表達(dá)量顯著下降。對桂花不同花色品種花瓣中OfCRTISO基因的表達(dá)分析表明，桂花初開期OfCRTISO基因的表達(dá)量可能影響盛開期各品種花瓣中類胡蘿卜素的積累。

桂花；花色；類胡蘿卜素；類胡蘿卜素異構(gòu)酶基因

桂花（Osmanthus fragrans Lour.）是我國十大傳統(tǒng)名花之一，也是我國重要的園林植物之一。根據(jù)花期桂花可分為秋桂和四季桂兩大類，秋桂又可根據(jù)花色分為金桂（黃色至金黃色系）、銀桂（黃白色至黃色系）和丹桂（橙色至橙紅色系）三大品種群［1］。前人通過對秋桂不同花色品種花瓣呈色物質(zhì)成分進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，類胡蘿卜素（Carotenoid）的種類及其含量是影響秋桂花色呈現(xiàn)的最主要因素［2，3］。其中，葉黃素（Lutein）、α-胡蘿卜素（α-carotene）和β-胡蘿卜素（β-carotene）這3種類胡蘿卜素的含量與秋桂花瓣顏色的呈現(xiàn)緊密相關(guān)［3］。

類胡蘿卜素屬于萜烯類化合物，呈現(xiàn)黃色、橙紅色和紅色，是觀賞植物花瓣的重要呈色物質(zhì)之一［4］。根據(jù)類胡蘿卜素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，主要分為胡蘿卜素和葉黃素類化合物兩大類［5］。到目前為止，通過各種生物學(xué)方法和手段已經(jīng)分離和鑒定了參與植物類胡蘿卜素生物合成的全部基因［4，6］。

類胡蘿卜素異構(gòu)酶（Carotenoid isomerase，CRTISO）能催化前番茄紅素（7，9，7'，9'-四順式-番茄紅素，7，9，7'，9'-tetra-cis-lycopene）生成全反式番茄紅素（All-trans-lycopene）［7，8］。植物CRTISO基因首先在擬南芥（Arabidopsis thaliana）［9］和番茄（Lycopersicon esculentum）［10］中被分離和鑒定。Park等［9］在擬南芥中定位并克隆了CRTISO基因，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌，證實(shí)CRTISO具有催化多順式類胡蘿卜素向全反式類胡蘿卜素異構(gòu)化的功能。相對于野生型番茄，Isaacson等［10］發(fā)現(xiàn)CRTISO缺失突變體tangerinemic和CRTISO低豐度表達(dá)突變體tangerine3183果實(shí)中積累大量前番茄紅素和ζ-胡蘿卜素，而番茄紅素和β-胡蘿卜素含量較低。

此后，除了模式植物和園藝作物［11-13］以外，許多觀賞植物的CRTISO基因也相繼被分離，如菊花（Chrysanthemum morifolium）［14］、 百 合（Lilium spp.）［15］、金盞菊（Calendula officinalis）［16］和香石竹（Dianthus caryophyllus）［17］。通過對菊花的研究發(fā)現(xiàn)，富含葉黃素的黃花品種的CRTISO基因表達(dá)量顯著高于葉黃素含量低的白花品種［14］。另有研究發(fā)現(xiàn)，不同牽牛屬（Ipomoea）植物和百合不同品種番茄紅素下游類胡蘿卜素的含量與CRTISO基因表達(dá)量緊密相關(guān)［15，18］。

本研究利用已構(gòu)建的桂花‘堰虹桂’花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫［19］中Unigene序列信息，結(jié)合RT-PCR技術(shù)克隆得到桂花OfCRTISO基因cDNA全長，對其基因序列及其編碼氨基酸序列進(jìn)行分析，并采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對該基因在‘堰虹桂’不同發(fā)育階段花序和營養(yǎng)器官中以及不同花色品種花瓣中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步研究桂花OfCRTISO基因的功能，探討桂花花色形成的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以浙江農(nóng)林大學(xué)桂花資源圃地栽桂花丹桂品種‘堰虹桂’、銀桂品種‘小葉蘇桂’和金桂品種‘金球桂’為試驗材料。

不同發(fā)育階段花序（圖1）取樣：2014年8月9日、8月15日、8月22日、8月29日、9月4日、9月10日、9月17日、9月23日、9月24日和9月25日對‘堰虹桂’不同發(fā)育狀態(tài)花序進(jìn)行取樣。其中，8月9日至9月17日花序狀態(tài)為花蕾期（Bud stage），簡寫為B1-B7；9月23日花序狀態(tài)為鈴梗期（Linggeng stage，L）；9月24日花序狀態(tài)為初開期（Initial flowering stage，IF）；9月25日花序狀態(tài)為盛開期（Full flowering stage，F(xiàn)F）。取樣時間均為上午10時，花序樣品離體后速凍于液氮中，于-80℃儲藏備用。

營養(yǎng)器官取樣：2014年9月25日對‘堰虹桂’一年生莖（當(dāng)年生枝條先端第2至第3節(jié)之間的莖）、嫩葉（當(dāng)年生枝條先端第1對葉片）和成熟葉（當(dāng)年生枝條先端第3對葉片）進(jìn)行取樣，液氮速凍后，于-80℃儲藏備用。

不同花色品種花瓣取樣：2014年9月下旬對‘堰虹桂’、‘小葉蘇桂’和‘金球桂’鈴梗期、初開期和盛開期花序的花瓣進(jìn)行取樣，取樣時間均為上午10時，離體后速凍于液氮中，于-80℃儲藏備用。

圖1 桂花‘堰虹桂’不同發(fā)育階段花序

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA的第一鏈的合成 采用RNAprep pure Plant Kit（天根，北京）按照說明書步驟提取各樣品的總RNA。紫外分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA濃度和質(zhì)量。采用Reverse Transcriptase M-MLV（TaKaRa，大連）按照說明書合成cDNA的第一鏈后，儲存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 OfCRTISO基因的克隆 根據(jù)前期課題組已構(gòu)建的桂花‘堰虹桂’花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫［19］，從中篩選出與CRTISO基因相關(guān)序列Locus_7474，設(shè)計特異性引物F1（5'- TTACTTTTACTTGTTAACCACCG -3'） 和 R1（5'- GCAATCACTATTTCTAATCCTCT -3'），以‘堰虹桂’盛開期花瓣RNA反轉(zhuǎn)的cDNA為模板，對桂花OfCRTISO基因最大閱讀框序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：10×Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶1.25 U，cDNA 2 μL，加去離子水至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸2.5 min，35個循環(huán)，最后72℃保溫10 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收、純化，與pMD18-T載體（TaKaRa）連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選陽性克隆，經(jīng)PCR鑒定后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.3 序列分析 測序獲得的序列通過NCBI提供的ORF Finder進(jìn)行ORF查找，序列翻譯、氨基酸序列比對采用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行。通過ExPASy（http://www.expasy.org/tools/protparam.html）提供的Prot-Param在線軟件對蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)進(jìn)行分析。通過NetPhos 2.0（http://www.cbs. dtu.dk/services/NetPhos/）對蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測；使用Plant-PLoc軟件（http://www.csbio.sjtu.edu. cn/bioinf/plant/）對編碼蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測；使用MEGA 5.05軟件中的 Neighbor-Joining（鄰位相連法，NJ）法建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR 按照Takara公司的SYBR?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus） 試 劑盒的說明書，采用7300 real-time PCR儀（Applied Biosystems）檢測桂花OfCRTISO基因的相對表達(dá)量。OfCRTISO基因表達(dá)引物為F2（5'- GAAAAACAAGGGATTCTCGGA -3'）和R2（5'- GCAGATAGTAGGCAAGGGTCAA -3'），內(nèi)參基因OfACT表達(dá)引物為F3（5'- CCCAAGGCAAACAGAGAAAAAAT -3'） 和R3（5'- ACCCCATCACCAGAATCAAGAA -3'）［20］。所用反應(yīng)體系和程序如下，PCR反應(yīng)體系為20 μL，其 中 2×SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）10 μL，10 μmol/L上下游定量引物各0.8 μL，模板cDNA 2 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，用滅菌雙蒸水補(bǔ)齊至20 μL。熒光定量PCR擴(kuò)增采用兩步法，即在95℃預(yù)變性30 s之后，先運(yùn)行40個循環(huán)的95℃ 5 s，60℃ 31 s，再運(yùn)行熔解曲線階段的95℃15 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s，60℃ 15 s。反應(yīng)后根據(jù)熔解曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性，分別導(dǎo)出目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，利用參照基因的ΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 桂花OfCRTISO基因的克隆與序列分析

提取所有樣品總RNA均有28S和18S兩條清晰條帶，RNA無降解，部分樣品總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測如圖2所示。紫外分光光度計檢測OD260/OD280均在1.9-2.0之間，濃度為210-420 ng/μL之間。以‘堰虹桂’盛開期花瓣總RNA反轉(zhuǎn)的cDNA為模板，擴(kuò)增出一條約2 200 bp的單一特異性條帶（圖3）。經(jīng)測序獲得一條長度為2 241 bp的cDNA序列（圖4），Blast比對發(fā)現(xiàn)該序列與CRTISO基因同源，命名為OfCRTISO。

利用NCBI提供的ORF Finder進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，OfCRTISO包含一個長度為1 842 bp的開放讀碼框，5'非翻譯區(qū)長50 bp，3'非翻譯區(qū)長349 bp。其開放讀碼框編碼一個含有613個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)（圖4）。

2.2 桂花OfCRTISO基因編碼氨基酸的基本特征

利用NCBI Conserved Domain Search進(jìn)行保守域分析表明，OfCRTISO編碼的蛋白含有1個carot_ isom保守域（第96-590位氨基酸殘基）。利用Prot-Param軟件分析桂花OfCRTISO氨基酸序列的基本特征發(fā)現(xiàn)，該蛋白的分子式為C3079H4818N816O875S24，相對分子量為68.04 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為8.58。該蛋白中亮氨酸（Leu）最多占10.4%；色氨酸（Trp）含量最低，只占0.8%。

利用NetPhos 2.0軟件對OfCRTISO蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)的分析（圖4）發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有14個絲氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)（分別為第72、85、91、149、155、200、238、282、363、442、473、481、498和531位氨基酸），5個蘇氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)（分別為第299、382、425、519和522位氨基酸）和7個酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)（分別為第86、127、244、343、403、485和534位氨基酸）。經(jīng)Plant-PLoc軟件分析，推測OfCRTISO蛋白定位于葉綠體中。

2.3 桂花OfCRTISO基因編碼氨基酸的同源性比較

利用DNAMAN軟件對桂花OfCRTISO及其他11個物種的CRTISO氨基酸序列進(jìn)行了多重比對，發(fā)現(xiàn)桂花OfCRTISO與已知胡麻科和茄科植物的CRTISO氨基酸序列有很高的同源性（圖5），其中與芝麻（Sesamum indicum）CRTISO序列（XP_011077785）相似性最高，序列一致性為81%。

為進(jìn)一步了解OfCRTISO與其他植物CRTISO之間的進(jìn)化關(guān)系，用上述11個物種的CRTISO氨基酸序列與桂花OfCRTISO構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖6）發(fā)現(xiàn)，桂花OfCRTISO與其他雙子葉植物CRTISO聚為一大支，而水稻（Oryza sativa）和玉米（Zea mays）等單子葉植物則聚在另一大支。馬鈴薯（Solanum tuberosum）、番茄（Solanum lycopersicum）和枸杞（Lycium barbarum）等茄科植物聚為一小支，表明CRTISO氨基酸的進(jìn)化與植物的進(jìn)化基本一致。桂花OfCRTISO與芝麻CRTISO聚為同一小支，表明其具有更近的親緣關(guān)系（圖6）。

2.4 桂花OfCRTISO基因的表達(dá)分析

桂花OfCRTISO基因在‘堰虹桂’營養(yǎng)器官（一年生莖、嫩葉和成熟葉）和不同發(fā)育階段花序中的表達(dá)模式如圖7所示，結(jié)果表明，OfCRTISO基因在花蕾前期（B1-B5）花序中的表達(dá)量極低，花蕾后期（B6-B7）時其表達(dá)量逐漸增加。隨著花瓣展開，花序中OfCRTISO基因的表達(dá)量急劇增大，于初開期達(dá)到最大值；而當(dāng)花序開放至盛開期時，其表達(dá)量顯著下降。OfCRTISO基因在一年生莖、嫩葉和成熟葉片中的表達(dá)量無顯著差異，與B6時期花序中表達(dá)量相近。

隨著花序開放過程（鈴梗期至盛開期），OfCRTISO基因在銀桂品種‘小葉蘇桂’花瓣中的表達(dá)量不變，在金桂品種‘金球桂’花瓣中表達(dá)量逐漸增加，而在丹桂品種‘堰虹桂’花瓣中的表達(dá)量呈現(xiàn)先增加再減少的趨勢（圖8）。

OfCRTISO基因在鈴梗期不同花色桂花品種花瓣中的表達(dá)量相近；初開期時，‘堰虹桂’花瓣中OfCRTISO基因的表達(dá)量顯著高于‘金球桂’和‘小葉蘇桂’，‘金球桂’花瓣中的OfCRTISO基因的表達(dá)量顯著高于‘小葉蘇桂’；盛開期‘金球桂’和‘堰虹桂’花瓣中OfCRTISO基因的表達(dá)量相近，均顯著高于‘小葉蘇桂’（圖8）。

圖2 桂花部分樣品總RNA電泳圖

圖3 桂花OfCRTISO基因的PCR擴(kuò)增電泳圖

3 討論

對于桂花而言，雖然已明確類胡蘿卜素的種類與含量是影響其花色呈現(xiàn)的最主要因素［21］，但是，桂花類胡蘿卜素合成的分子機(jī)制仍不清晰［2，3，19］。本研究從桂花中獲得了CRTISO基因cDNA全長序列，并分析該基因在‘堰虹桂’不同發(fā)育階段花序和營養(yǎng)器官中以及不同花色品種花瓣中的表達(dá)模式，為探討桂花花色形成的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

圖4 桂花OfCRTISO基因的核苷酸序列及推測的氨基酸序列

前人研究證實(shí)CRTISO基因在擬南芥和番茄基因組中均以單拷貝形式存在［9，10］，本研究利用已構(gòu)建的桂花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫只獲得1個桂花CRTISO基因序列，推測CRTISO基因在桂花基因組中也可能以單拷貝形式存在。氨基酸序列對比和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明桂花OfCRTISO與芝麻CRTISO（XP_011077785）序列相似性最高，兩者親緣關(guān)系最近（圖6）。

圖5 桂花OfCRTISO與其他物種CRTISO氨基酸序列對比

圖6 桂花OfCRTISO與其他物種CRTISO氨基酸序列的進(jìn)化樹分析

CRTISO可以催化前番茄紅素生成全反式番茄紅素［7，8］，是植物類胡蘿卜素生物合成過程中一個重要的催化酶。觀賞植物花瓣中類胡蘿卜素合成與CRTISO基因的表達(dá)量緊密相關(guān)［14，15，18］。與菊花品種‘Yellow Paragon’［14］和百合品種‘Connecticut King’［15］相似，桂花‘堰虹桂’花序發(fā)育過程中，類胡蘿卜素總量逐漸增加，至盛開期時達(dá)到最大［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，‘堰虹桂’花序和花瓣中OfCRTISO基因的表達(dá)量均于初開期達(dá)到最大，但是盛開期時，其表達(dá)量顯著下降。這與百合品種‘Connecticut King’花蕾發(fā)育過程中LhCRTISO基因的表達(dá)模式［15］一致，推測桂花‘堰虹桂’初開期OfCRTISO基因的高豐度表達(dá)對盛開期類胡蘿卜素的大量積累至關(guān)重要。

百合、香石竹和菊花不同花色品種開花早期CRTISO基因的表達(dá)量均無差異［6，14，15］，這與本研究結(jié)果相似，桂花不同花色品種鈴梗期時花瓣中OfCRTISO基因的表達(dá)量也相同。而開花中期，菊花黃色花品種‘Yellow Paragon’類胡蘿卜素總量和CRTISO基因的表達(dá)量則顯著高于白色花品種‘Paragon’［14］。同樣的，百合品種‘Connecticut king’ LhCRTISO基因的表達(dá)量于開花中期顯著高于百合品種‘Montreux’，而在該時期‘Connecticut king’類胡蘿卜素總量也顯著高于‘Montreux’［15］，表明CRTISO基因的表達(dá)量與類胡蘿卜素的積累緊密相關(guān)。在本研究中，初開期時‘堰虹桂’和‘金球桂’花瓣中OfCRTISO基因的表達(dá)量急劇上升，均顯著高于‘小葉蘇桂’中的表達(dá)量，而‘堰虹桂’中OfCRTISO基因的表達(dá)量上升更為顯著。侯丹測定‘堰虹桂’、‘金球桂’和‘小葉蘇桂’花瓣中類胡蘿卜素含量發(fā)現(xiàn)，‘堰虹桂’花瓣中類胡蘿卜素總量最高，‘金球桂’次之，而‘小葉蘇桂’最低［21］，這可能與3個品種初開期OfCRTISO基因的表達(dá)量正相關(guān)。盛開期時，‘堰虹桂’和‘金球桂’花瓣中OfCRTISO基因的表達(dá)量相近，而類胡蘿卜素含量存在差異，表明桂花初開期OfCRTISO基因的表達(dá)高低對盛開期花瓣中類胡蘿卜素積累的影響更大。

圖7 OfCRTISO基因在‘堰虹桂’營養(yǎng)器官和不同發(fā)育階段花序中的表達(dá)量

圖8 OfCRTISO基因在不同花色桂花品種花瓣中的表達(dá)量

4 結(jié)論

桂花OfCRTISO基因含有長為1 842 bp的開放讀碼框，編碼613個氨基酸殘基。桂花OfCRTISO與已知胡麻科和茄科植物的CRTISO序列相似性最高。OfCRTISO基因在桂花‘堰虹桂’初開期表達(dá)量最高，初開期OfCRTISO基因的表達(dá)量影響盛開期各品種花瓣中類胡蘿卜素的積累。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Cloning and Expression Analysis of Carotenoid Isomerase Gene in Osmanthus fragrans

ZHANG Chao LIU Yu-cheng WANG Yi-guang FU Jian-xin ZHAO Hong-bo
（School of Landscape Architecture，Zhejiang Agriculture and Forestry University，Lin’an 311300）

Based on the sequence information of Unigene of Osmanthus fragrans ‘Yanhong Gui’ from the petal transcriptome database，sequence of open reading frame in one carotenoid isomerase gene（OfCRTISO）from Osmanthus fragrans was amplified using RT-PCR technology and confirmed by sequencing. Bioinformatics analysis indicated that OfCRTISO contained a 1 842 bp open reading frame，encoding 613 amino acid residues. OfCRTISO from Osmanthus fragrans shared high sequence similarity with CRTISOs from Pedaliaceae and Solanaceae plants. Phylogenetic analysis showed that OfCRTISO and Sesamum indicum CRTISO（XP_011077785）gathered into one branch，revealing that these two proteins showed the closest genetic relationship. Gene expression analysis implicated that the expression level of OfCRTISO was extremely low at bud former stage，gradually increased at bud later stage，and reached the peak at initial flowering stage；however，it significantly decreased at full flowering stage. According to the expression analysis of OfCRTISO in the petals of sweet osmanthus cultivars with different flower color，it was demonstrated that the expression level of OfCRTISO at initial flowering stage might have an impact on the carotenoid accumulation in the petals of sweet osmanthus cultivars at full flowering stage.

Osmanthus fragransl；petal color；carotenoids；carotenoid isomerase gene

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1163

2017-01-05

國家自然科學(xué)基金項目（31501790），浙江省自然科學(xué)基金（LQ15C160004和LQ16C160003），浙江農(nóng)林大學(xué)科研發(fā)展基金人才啟動項目（2016FR031）

張超，男，博士，研究方向：觀賞植物分子生物學(xué)；E-mail：zhangchao24804@gmail.com

趙宏波，男，博士，研究方向：觀賞植物遺傳育種；E-mail：zhaohb@zafu.edu.cn