脫鈣預處理對提高濃縮乳蛋白溶解性的影響

劉大松，余韻，李珺珂，徐雨婷，王淼，周鵬

(江南大學，食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫，214122)

脫鈣預處理對提高濃縮乳蛋白溶解性的影響

劉大松，余韻，李珺珂，徐雨婷，王淼*，周鵬

(江南大學，食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫，214122)

以脫脂乳為原料，通過超濾、洗濾、離子交換和噴霧干燥制備了脫鈣率為0%、11%、19%、27%和37%的濃縮乳蛋白(milk protein concentrate, MPC)，并在35 ℃加速貯藏4個月，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳、激光共聚焦、激光粒度儀等方法分析了MPC中可溶性蛋白的含量、組成及其溶解液的微觀結構和粒徑分布，旨在探討脫鈣程度對MPC溶解性和貯藏穩(wěn)定性的影響。脫鈣MPC的初始溶解度都在95%以上，且隨脫鈣程度的增加而略有提高。在貯藏過程中，0%脫鈣MPC的溶解度顯著降低；11%脫鈣MPC的溶解度隨貯藏時間增加而顯著降低；19%～37%脫鈣MPC的溶解度在貯藏期內(nèi)幾乎不變。MPC溶解度的降低，主要是由酪蛋白聚集所致。MPC的脫鈣率越高，其在水中的分散程度越高，且分散程度隨貯藏時間降低的速度越慢。綜上所述，當脫鈣率達到19%及其以上時，MPC具有良好的溶解性和貯藏穩(wěn)定性。

濃縮乳蛋白；脫鈣；溶解性；粒徑分布

濃縮乳蛋白(MPC)是脫脂牛乳經(jīng)過超濾和洗濾脫除部分乳糖和鹽之后，再通過真空濃縮和噴霧干燥脫水，所得到的一類高蛋白粉[1-2]。MPC中蛋白質(zhì)的含量介于40%～90%之間，這是由脫脂乳超濾和洗濾的程度決定的。膜分離工藝具有非熱、高效、綠色等特點，因而MPC較好地保持了牛乳中蛋白質(zhì)原有的結構和性質(zhì)。此外，MPC的蛋白質(zhì)組成與牛乳幾乎完全相同，即含酪蛋白與乳清蛋白，且兩者的比例約為4∶1。MPC是一種相對新型的功能性蛋白配料，具有高蛋白、低脂肪、低乳糖等特點，并具有良好的風味和口感，因而被廣泛的應用于酸奶、乳酪、嬰幼兒食品、烘焙食品、運動營養(yǎng)食品、功能性飲料等食品的研發(fā)和生產(chǎn)[3]。

目前，MPC在應用過程中存在的一個突出問題是其溶解性較差，主要表現(xiàn)為：在室溫條件下，新生產(chǎn)的MPC，其溶解度較低；在貯藏過程中，MPC的溶解度會進一步降低[2,4-6]。MPC的蛋白含量越高，其溶解性較差的問題越嚴重。較低的溶解度會影響MPC的其它功能性質(zhì)，如凝膠性、起泡性、乳化性、熱穩(wěn)定性等，從而限制了MPC在食品工業(yè)中的應用[1]。升高溶解溫度、延長溶解時間、超聲和均質(zhì)輔助等物理方法，均可提高MPC的溶解度，但這都會額外增加產(chǎn)品的生產(chǎn)成本[7]。前期研究表明，MPC溶解性較差的主要誘導機理是蛋白非共價聚集，即MPC中的鈣離子會通過離子鍵介導蛋白之間產(chǎn)生非共價交聯(lián)，從而降低MPC的溶解度[6,8-10]。

基于鈣離子介導的蛋白非共價聚集機理，本論文采用離子交換樹脂對脫脂乳的超濾截留液進行脫鈣處理，并采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、激光共聚焦(CLSM)、激光粒度分析儀等方法，探討脫鈣程度對MPC溶解度和貯藏穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

優(yōu)倍巴氏殺菌脫脂乳，上海光明集團；羅門哈斯Amberlite SR1L Na樹脂，美國Dow’s化學品公司；異硫氰酸熒光素(FITC)，美國Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、過硫酸銨，美國Amresco公司；高氯酸、濃HNO3、濃H2SO4、氧化鑭、CaCl2、疊氮化鈉、乙酸、甘氨酸，國藥集團化學試劑有限公司；甘油、考馬斯亮藍R-250、β-巰基乙醇，上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 主要儀器

SPPM-24S-1超濾系統(tǒng)，廈門三達膜科技有限公司；Spectr AA 220原子吸收光譜分析儀，美國Varian公司；B-290噴霧干燥儀，瑞士步琪公司；S3500激光粒度儀，美國Microtrac公司；4TE/TEV水分活度儀，美國Aqualab公司；LSM-780激光共聚焦顯微鏡，德國Zeiss公司；Waters e2695 Separations Module高效液相色譜分析儀，美國Waters公司；Heraeus Multifuge XIR冷凍離心機，美國Thermo公司；C-MAG HS7磁力攪拌器，德國IKA集團；K1302凱氏定氮儀，上海晟聲自動化分析儀器有限公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 脫鈣MPC的制備

在脫脂乳中加入0.01%疊氮化鈉以防止微生物生長，采用10 kDa截留分子量的聚醚砜濾膜進行超濾，待體積濃縮3倍后，在截留液中補加水至原脫脂乳體積，經(jīng)洗濾濃縮3倍后，再在相同條件下重復上述洗濾步驟2次，收集最終所得的截留液，并加入0.01%疊氮化鈉。取1 kg截留液分別加入0、10、20、30、40 g離子交換樹脂，在室溫下攪拌2 h后，在進口溫度135 ℃和出口溫度75 ℃的條件下進行噴霧干燥，所得MPC分裝于鋁箔袋中，然后置于底部盛有飽和氯化鎂溶液(0.32水分活度)的干燥器中，并將干燥器放置在生化培養(yǎng)箱中，35 ℃貯藏112 d。

1.3.2 鈣和鈉含量的測定

稱取0.1 g脫鈣MPC至250 mL高腳燒杯中，加入20 mL濃硝酸和5 mL高氯酸，高溫消化至剩余體積約為2 mL，用超純水定容至50 mL，取5 mL定容后樣品與1 mL鑭溶液(50 mg/mL)一起定容至50 mL，然后再采用原子吸收光譜法測定鈣和鈉含量[11]。

1.3.3 蛋白含量的測定

稱取0.2 g脫鈣MPC、0.2 g硫酸銅、4 g硫酸鉀于消化管中，加入20 mL濃硫酸，高溫消化至澄清透明。采用凱氏定氮法測定脫鈣MPC中的蛋白含量，所用的蛋白質(zhì)換算系數(shù)為6.38。

1.3.4 乳糖含量的測定

稱取2.5 g脫鈣MPC至50 mL容量瓶中，加入10 mL水，60 ℃水浴5 min，然后置于超聲波振蕩器中振蕩10 min，用乙腈定容，靜置10 min后，用0.45 μm有機濾膜過濾，所得濾液采用高效液相色譜法測定其乳糖含量，所用色譜柱為氨基柱。

1.3.5 溶解度的測定

稱取0.75 g脫鈣MPC，加入15 mL超純水，在25 ℃攪拌30min，然后取5 mL溶解液在700 g條件下離心10 min，將上清液轉移至干燥皿中，再另取5 mL溶解液直接置于干燥皿中，在105 ℃干燥10 h，所得上清液固形物質(zhì)量占溶解液固形物質(zhì)量的百分比即為溶解度[12]。

1.3.6 可溶性蛋白的電泳分析

取1.3.5中脫鈣MPC的溶解上清液稀釋10倍后，與樣品緩沖液等體積混合，沸水浴3 min后冷卻。濃縮膠和分離膠濃度分別為4%和13%，其所對應使用的電流分別為20和40 mA，上樣量為25 μL。

1.3.7 溶解液的CLSM分析

取1.3.5中脫鈣MPC的溶解液，采用FITC(0.01 mg/mL)標記，然后取200 μL標記樣品置于玻底培養(yǎng)皿中，蓋上蓋玻片，即刻在488 nm激發(fā)波長下觀測MPC粉末顆粒微觀結構的變化。

1.3.8 溶解液的粒徑分析

取1.3.5中脫鈣MPC的溶解液，采用激光粒度儀測定其粒徑分布，使用濕法分散單元，所設置的測試參數(shù)如下：顆粒形狀為irregular，分散相折光系數(shù)為1.33，顆粒的折光系數(shù)為1.57。

2 結果與討論

2.1.1 脫鈣MPC的基本組成

脫脂乳經(jīng)超濾和洗濾后，所得截留液的固形物含量為10.1%，蛋白質(zhì)含量為9.0%。如表1所示，截留液經(jīng)鈉型陽離子交換樹脂處理后，所得脫鈣MPC的鈣含量分別為2.7%、2.4%、2.2%、2%和1.7%，其脫鈣率分別為0%、11%、19%、27%和37%。隨著脫鈣率的增加，脫鈣MPC的鈉含量也逐漸增加，分別為0.2%、0.5%、0.7%、0.9%和1.1%。陽離子交換樹脂常用的離子形式為鈉型和鉀型，后者會導致脫鈣MPC產(chǎn)生過重的小蘇打堿味，而前者對脫鈣MPC風味的影響較小[13]。脫鈣MPC的蛋白質(zhì)含量約為78%，對應于食品工業(yè)中常用的MPC80。脫鈣MPC的水分活度保持在0.32～0.37，與商業(yè)MPC接近。脫鈣MPC的乳糖含量約為5%，而脫脂乳粉的乳糖含量約為50%～55%[14]。乳蛋白粉在貯藏過程中的色澤變化主要是由美拉德反應所導致的，而脫鈣MPC的乳糖含量較低，因而其在貯藏過程中的色澤變化不明顯[15]。然而，隨著脫鈣率的增加，酪蛋白膠束逐漸解離成單體的酪蛋白分子和小分子質(zhì)量的酪蛋白聚集體，因而脫鈣MPC復溶液的濁度隨脫鈣率的增加而逐漸降低，當脫鈣率達到37%及其以上時，脫鈣MPC復溶液由乳白色轉變?yōu)榘胪该鳡顟B(tài)，因而高脫鈣率的MPC可用于半透明及透明乳飲料的研發(fā)和生產(chǎn)[16]。

表1 脫鈣MPC的基本組成

注：同一列中小寫字母不同代表對應的數(shù)據(jù)之間差異顯著(P<0.05)。

2.1.2 脫鈣MPC的溶解度

MPC良好的溶解性是實現(xiàn)凝膠性、乳化性、起泡性等其它功能性質(zhì)的先決條件[17]。在工業(yè)生產(chǎn)中，通常要求MPC在常溫條件下能夠快速和完全的溶解。脫鈣MPC在35 ℃條件下加速貯藏112 d的過程中，其溶解度隨脫鈣程度和時間的變化如圖1所示。從圖1中可以看出，未經(jīng)脫鈣處理的MPC，在貯藏0 d時，其溶解度為95%；貯藏28 d后，溶解度降為71%；貯藏56 d后，溶解度降低到44%；貯藏112 d后，溶解度降低至21%，相比貯藏0 d的樣品，溶解度減少了74%。脫鈣率為11%的MPC，在貯藏0、28、56、112 d后，其溶解度分別為97%、88%、76%、54%，在貯藏過程中溶解度減少了約40%。脫鈣率為19%的MPC，在貯藏過程中，其溶解度從98%降低至91%，溶解度僅減少了7%；脫鈣率為27%和37%的MPC，在貯藏過程中，其溶解度無明顯變化，均保持在98%左右。這說明，MPC的脫鈣率越高，其初始溶解度越高，且溶解度隨貯藏時間降低的速度越慢；當脫鈣率達到19%及其以上時，MPC具有良好的溶解性和貯藏穩(wěn)定性。

圖1 脫鈣MPC在35 ℃貯藏條件下其溶解度隨時間的變化Fig. 1 Changes in solubility of decalcified MPC during storage at 35 ℃

2.1.3 脫鈣MPC中可溶性蛋白的電泳圖

脫鈣MPC在35 ℃條件下貯藏112 d的過程中，其可溶性蛋白隨脫鈣程度和時間的變化如圖2所示。在貯藏0 d時，脫鈣MPC的溶解液中主要含β-酪蛋白、α-酪蛋白和β-乳球蛋白，不同脫鈣率MPC所對應的各蛋白條帶的強度無明顯差別，而且脫鈣MPC的溶解液上清中，各蛋白條帶的強度也無明顯變化。貯藏28 d后，0%脫鈣MPC的溶解液上清中，α-和β-酪蛋白所對應的條帶顯著變淺，β-乳球蛋白所對應的條帶無明顯變化；11%脫鈣MPC的溶解液上清中，α-和β-酪蛋白所對應的條帶略有變淺；19%、27%和37%脫鈣MPC的溶解液上清中，各蛋白條帶均無明顯變化。貯藏56 d后，0%脫鈣MPC的溶解液上清中，α-和β-酪蛋白所對應的條帶只能模糊可見，β-乳球蛋白所對應的條帶略有變淺；11%脫鈣MPC的溶解液上清中，α-和β-酪蛋白所對應的條帶顯著變淺，β-乳球蛋白所對應的條帶無明顯變化；19%、27%和37%脫鈣MPC的溶解液上清中，各蛋白條帶均無明顯變化。貯藏112 d后，0%脫鈣MPC的溶解液上清中，α-和β-酪蛋白所對應的條帶已完全消失，β-乳球蛋白所對應的條帶顯著變淺；11%脫鈣MPC的溶解液上清中，α-和β-酪蛋白所對應的條帶只能模糊可見，β-乳球蛋白所對應的條帶略有變淺；19%、27%和37%脫鈣MPC的溶解液上清中，各蛋白條帶的變化不顯著。這說明，MPC在貯藏過程中其溶解度的降低，主要是由酪蛋白的聚集導致的，而乳清蛋白的溶解度則是在貯藏后期才會輕微地降低。MPC的脫鈣率越高，酪蛋白的溶解度隨貯藏時間降低的速度越慢；當脫鈣率達到19%及其以上時，酪蛋白保持良好的溶解性和貯藏穩(wěn)定性。

2.1.4 脫鈣MPC溶解液的CLSM圖

脫鈣MPC在35 ℃條件下貯藏112 d的過程中，其溶解液的微觀結構隨脫鈣程度和時間的變化如圖3所示。從圖中可以看出，在貯藏0 d時，0%脫鈣MPC的溶解液中仍有大量的顆粒物，11%脫鈣MPC的溶解液中顆粒物相對較少，19%脫鈣MPC的溶解液中僅有極少的顆粒物，而27%和37%脫鈣MPC的溶解液中無顆粒物出現(xiàn)，呈現(xiàn)出均一的分散狀態(tài)。脫鈣MPC溶解液中的顆粒物對應于未分散開的MPC粉體顆粒，其呈現(xiàn)出中空的狀態(tài)。脫鈣率為0%和

圖2 脫鈣MPC在35 ℃貯藏條件下其可溶性蛋白的電泳圖(CN-酪蛋白，Lg-乳球蛋白)Fig. 2 SDS-PAGE patterns of the soluble proteins in decalcified MPC stored at 35 ℃

圖3 脫鈣MPC在35 ℃貯藏條件下其溶解液的CLSM圖Fig. 3 CLSM micrographs of reconstituted decalcified MPC stored at 35 ℃

11%的MPC，在貯藏過程中，其溶解液中顆粒物的數(shù)量逐漸增加，而且顆粒物的平均尺寸也隨貯藏時間略有增加。脫鈣率為19%的MPC，在貯藏28 d后，其溶解液中顆粒物略有增加；貯藏56 d和112 d后，其溶解液中顆粒物顯著增加，但仍比0%和11%脫鈣MPC的溶解液少。脫鈣率為27%的MPC，在貯藏過程中，其溶解液中僅有極少的顆粒物出現(xiàn)。脫鈣為37%的MPC，在貯藏過程中，其溶解液中無顆粒物出現(xiàn)，呈現(xiàn)出均一的分散狀態(tài)。這說明，MPC的脫鈣率越高，其在水中的分散程度越高，且分散程度隨貯藏時間降低的速度越慢，該部分結果與MPC的溶解度隨脫鈣程度和貯藏時間而變化的趨勢基本一致。

2.1.5 脫鈣MPC溶解液的粒徑分布圖

圖4 脫鈣MPC在35 ℃貯藏條件下其溶解液的粒徑分布圖Fig. 4 Particle size distribution of reconstituted decalcified MPC stored at 35 ℃

脫鈣MPC在35 ℃條件下貯藏112 d的過程中，其溶解液的粒徑分布隨脫鈣程度和時間的變化如圖4所示。在貯藏0 d時，未經(jīng)脫鈣處理的MPC，其溶解液的粒徑分布主要集中在10～100 μm之間，在0.01～0.1 μm之間出現(xiàn)了小峰；脫鈣率為11%的MPC，其溶解液的粒徑分布也主要集中在10～100 μm之間，但峰面積比例略微變小，并向低粒徑區(qū)域偏移，且在1μm附近出現(xiàn)了極小的峰，在0.01～0.1 μm之間出現(xiàn)了較大的峰；19%脫鈣MPC的溶解液，在10～100 μm之間的粒徑分布比例顯著變小，而在0.01～0.1 μm之間的粒徑分布比例顯著增加；27%和37%脫鈣MPC的溶解液，其粒徑分布主要集中在0.01～0.1μm之間，在0.1～100μm出現(xiàn)了極小的峰。脫鈣率為0%和11%的MPC，在貯藏過程中，其溶解液的粒徑分布主要出現(xiàn)在大于10 μm的區(qū)域內(nèi)，且隨貯藏時間逐漸向大粒徑區(qū)域偏移。脫鈣率為19%的MPC，在貯藏28 d和56 d后，其溶解液在0.01～0.1 μm之間的粒徑分布比例逐漸變小，在10～100 μm之間的粒徑分布比例逐漸增加，且向大粒徑區(qū)域偏移；貯藏112 d后，其溶解液的粒徑分布主要集中在大于10 μm的區(qū)域內(nèi)。脫鈣率為27%的MPC，在貯藏過程中，其溶解液在0.01～0.1 μm之間的粒徑分布比例逐漸變小，在10～100 μm之間的粒徑分布比例逐漸增加，但粒徑分布仍比0%、11%和19%脫鈣MPC的溶解液小。脫鈣率為37%的MPC，在貯藏28 d和56 d后，其溶解液的粒徑分布主要集中在0.01～0.1 μm之間，在0.1～10 μm之間出現(xiàn)了極小的峰；貯藏112 d后，其溶解液的粒徑分布主要集中在大于10 μm的區(qū)域內(nèi)，在0.01～1 μm之間出現(xiàn)了極小的峰。這說明，MPC的脫鈣率越高，其在水中的分散程度越高，且分散程度隨貯藏時間降低的速度越慢，該部分結果與CLSM顯示的結果基本一致。

MPC的溶解是一個復雜過程，通?？煞譃闈櫇瘛⒊两?、分散和溶解4個階段。在潤濕階段，水分子首先浸潤粉體顆粒表面，并逐漸向粉體顆粒內(nèi)部滲透；在沉降階段，粉體顆粒自重增加，下沉入液體中；在分散階段，粉體顆粒被分散成更小的細粒并均勻分布于體系中；在最后的溶解階段，水分子的作用使小顆粒再進一步被分散，形成溶液、乳濁液或懸濁液[18]。該過程中任何一個階段的延遲都可能會降低MPC的溶解性能。MPC中鈣離子的脫除，減少了蛋白質(zhì)之間由離子鍵介導的非共價交聯(lián)，從而加速了MPC的溶解過程。

3 結論

以脫脂乳為原料，通過超濾、洗濾、離子交換和噴霧干燥等系列單元工藝，制備了脫鈣率為0%、11%、19%、27%和37%的MPC。脫鈣MPC的初始溶解度都在95%以上，且隨脫鈣程度的增加而略有提高。在35 ℃加速貯藏4個月后，未脫鈣MPC的溶解度顯著降低；11%脫鈣MPC的溶解度隨貯藏時間增加而明顯降低；19%～37%脫鈣MPC的溶解度在貯藏期內(nèi)幾乎不變。MPC溶解度的降低，主要是由酪蛋白聚集導致的。MPC的脫鈣率越高，其在水中的分散程度越高，且分散程度隨貯藏時間降低的速度越慢。綜上所述，當脫鈣率達到19%及其以上時，MPC具有良好的溶解性和貯藏穩(wěn)定性，這說明離子交換脫鈣可作為一種潛在的手段來改性MPC，以促進其在食品工業(yè)中的應用。

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Effect of decalcification pretreatment on the solubility of milk protein concentrate

LIU Da-song, YU Yun, LI Jun-ke, XU Yu-ting, WANG Miao*, ZHOU Peng

(School of Food Science and Technology, State Key Laboratory of Food Science and Technology, Collaborative Innovation Center of Food Safety and Quality Control, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

A series of milk protein concentrate (MPC) with 0%, 11%, 19%, 27% and 37% of decalcification were prepared by ultrafiltered-diafiltered-ion exchange-drying methods. Decalcified MPC was stored at 35 ℃ for 4 months. The changes in soluble proteins, microstructure and particle size distribution of reconstituted decalcified MPC were determined using sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, confocal laser scanning microscopy and static light scattering, respectively. All freshly prepared MPC maintained the solubility above 95%, and only a slightly increased with the increasing in decalcification. During storage, the solubility of MPC without decalcification decreased sharply and the solubility of MPC with 11% decalcification decreased less, while the solubility of MPC with 19%-37% decalcification remained almost unchanged. The decrease in solubility of MPC was mainly attributed to the aggregation of caseins. The dispersion of MPC also increased with the increasing decalcification. The result showed the solubility and stability of MPC were well maintained at and above 19% of decalcification.

milk protein concentration; decalcification; solubility; particle size distribution

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705014

博士(王淼教授為通訊作者，E-mail: mwang@jiangnan.edu.cn)。

國家自然科學基金(31471697)；教育部科學技術研究項目(113032A)

2016-09-08，改回日期：2016-10-08