高效液相色譜—熒光衍生法快速測(cè)定地溝油中的長(zhǎng)鏈脂肪醛

王婉+于清峰+肖瑩+何華

摘 要 本研究利用地溝油精煉過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生醛類(lèi)化合物的特點(diǎn)， 以O(shè)（3（9H咔唑9基）丙基）羥胺為熒光衍生化試劑， 采用高效液相色譜法測(cè)定己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛5種長(zhǎng)鏈脂肪醛來(lái)鑒別地溝油及食用油中是否摻雜地溝油。 10 μL待測(cè)油樣品溶于200 μL異丙醇， 在最佳條件下與O（3（9H咔唑9基）丙基）羥胺反應(yīng)生成穩(wěn)定的衍生物， 乙腈萃取后進(jìn)樣分析。以乙腈水（90∶10， V/V）為流動(dòng)相， 在λex /λem=292 nm/348 nm下熒光檢測(cè)， 衍生物在C18柱上15 min內(nèi)可完全分離。檢測(cè)5種脂肪醛的線性范圍均為0.01～1.00 μmol/L， 檢出限為0.05～0.10 nmol/L， 加樣回收率為95.6%～101.4%。待測(cè)油樣品的測(cè)定結(jié)果表明， 食用油基本不含上述5種脂肪醛， 而精煉地溝油中5種脂肪醛含量顯著增加， 因此5種脂肪醛含量可作為檢測(cè)地溝油的指標(biāo)。本方法專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確性好＼，方便＼，快捷， 可用于快速檢測(cè)地溝油。

關(guān)鍵詞 地溝油； 長(zhǎng)鏈脂肪醛； 熒光衍生化； 高效液相色譜法

1 引 言

地溝油是各種劣質(zhì)油脂的通稱(chēng)， 狹義的地溝油是指從賓館、酒店、食堂等場(chǎng)所的餐廚垃圾中分離回收并加以提煉的油脂， 是地溝油中數(shù)量最大、危害最嚴(yán)重的一種[1]。這種油脂由于來(lái)自污水等各種垃圾污染的環(huán)境中， 附帶很多有毒有害物質(zhì)， 食用后會(huì)對(duì)人體健康造成巨大的威脅， 因此快速有效地鑒別地溝油越來(lái)越受到重視[2，3]。目前， 地溝油鑒別的常規(guī)指標(biāo)有酸值[4]、碘值[5]和過(guò)氧化值[6，7]和辣椒素[8]等， 但地溝油經(jīng)過(guò)精煉后， 這些指標(biāo)均符合現(xiàn)行食用油標(biāo)準(zhǔn)， 且不法商販會(huì)將精煉地溝油以一定比例添加入食用油中， 降低成本的同時(shí)可使各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)符合要求， 給分析檢測(cè)工作帶來(lái)更大的困難。因此， 研究人員開(kāi)發(fā)了基于不同原理的地溝油檢測(cè)方法， 例如： 康莉等[9]利用氣相氣譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法測(cè)定特征脂肪酸； 李軍濤等[10]用免疫熒光層析法檢測(cè)黃曲霉毒素B1； 趙琴等[11]用LCMS/MS測(cè)定辣椒素， 但上述方法多針對(duì)特定來(lái)源的地溝油， 易導(dǎo)致誤判。

廢棄油脂中多含有植物油， 植物油的主要成分為油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸， 它們?cè)诘販嫌头蛛x、精煉過(guò)程中會(huì)發(fā)生各種化學(xué)反應(yīng)， 繼而產(chǎn)生醇、酸、醛、多環(huán)芳烴等物質(zhì)。其中脂肪醛類(lèi)化合物被確定存在于地溝油中[12，13]， 基于此原理研究者開(kāi)發(fā)了許多鑒別地溝油的方法， 例如董樹(shù)清等[14，15]、沈衛(wèi)陽(yáng)等[16]以2，4二硝基苯肼（DNPH）為衍生化試劑檢測(cè)粗制地溝油、精煉地溝油中的短鏈脂肪醛， 陳振賀等[17]也采用DNPH為衍生化試劑， 測(cè)定餐飲油煙中的15種短鏈的醛酮， 為地溝油中脂肪醛類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)提供了一種可行的方法。然而以DNPH為衍生化試劑時(shí)靈敏度不高， 且上述方法測(cè)定的是在地溝油精煉過(guò)程中由于揮發(fā)造成含量降低的短鏈脂肪醛類(lèi)物質(zhì)， 使結(jié)果不準(zhǔn)確。曹文明[18]等指出， 不飽和脂肪酸在加熱時(shí)會(huì)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)生壬醛、癸醛等長(zhǎng)鏈脂肪醛， 這些長(zhǎng)鏈脂肪醛不易揮發(fā)， 且隨著加熱時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)逐漸累積， 更適于作為地溝油鑒別檢測(cè)的指標(biāo)。因此， 本研究以O(shè)（3（9H咔唑9基）丙基）羥胺[19]作為熒光衍生化試劑， 測(cè)定了食用油和地溝油樣品中的己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛這5種長(zhǎng)鏈脂肪醛， 結(jié)果顯示， 新開(kāi)封食用油基本不含這5種長(zhǎng)鏈脂肪醛， 而在地溝油中含量較高。 此方法靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)， 可實(shí)現(xiàn)對(duì)地溝油或摻有地溝油的食用油的鑒別。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀（脫氣機(jī)、四元泵、熒光檢測(cè)器， 美國(guó)Agilent公司）； TS100恒溫混勻儀（杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司）； TGL16G高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）； ZLS2真空離心濃縮儀（湖南赫西儀器裝備有限公司）。

己醛（≥99.0%）、庚醛（≥ 98%）、辛醛（99%）、壬醛（96%）、癸醛（97%）標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司； O（3（9H咔唑9基）丙基）羥胺衍生化試劑為實(shí)驗(yàn)室自制[19]； 其它試劑均為色譜純或分析純。食用油樣品： 某品牌壓榨葵花籽油（20160814）、某品牌玉米油（20160712）、某品牌玉米胚芽油（20161016）、某品牌葵花籽油（20160727）為超市購(gòu)得。地溝油樣品： 于中國(guó)藥科大學(xué)食堂收集的廢棄油脂參考文獻(xiàn)[14～17]中的方法精煉而得， 2016.11.08食堂一樓采集精煉得地溝油1樣品， 2016.11.09食堂二樓得地溝油2樣品， 2016.11.11食堂三樓得地溝油3樣品。

2.2 溶液的配制

己醛標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制： 取適量己醛標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇， 配制成濃度為2.0 mmol/L的儲(chǔ)備液， 將儲(chǔ)備液稀釋20倍， 得0.10 mmol/L的己醛標(biāo)準(zhǔn)溶液。

混合脂肪醛標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制： 取適量的己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛標(biāo)準(zhǔn)品， 溶于甲醇， 配制成濃度各為2.0 mmol/L的混合醛儲(chǔ)備液， 將儲(chǔ)備液稀釋20倍， 得0.10 mmol/L的混合醛標(biāo)準(zhǔn)溶液。

O（3（9H咔唑9基）丙基）羥胺衍生化試劑溶液的配制： 取24.0 mg的衍生化試劑， 溶于甲醇， 配制成10 mmol/L的儲(chǔ)備液， 將儲(chǔ)備液稀釋10倍， 得1.0 mmol/L的衍生化試劑溶液。

以上溶液儲(chǔ)均存于20℃的冰箱待用中， 每月更換。

2.3 液相色譜條件

色譜柱為Kinetex EVOC18柱（100 mm×4.6 mm， 2.6 μm， 廣州菲羅門(mén)科學(xué)儀器有限公司）， 柱溫30℃； 流動(dòng)相為乙腈水（90∶10， V/V）， 流速0.4 mL/min； 熒光檢測(cè)條件： 激發(fā)波長(zhǎng)為 292 nm， 發(fā)射波長(zhǎng)為 348 nm。

2.4 衍生化反應(yīng)過(guò)程

O（3（9H咔唑9基）丙基）羥胺與脂肪醛類(lèi)化合物的反應(yīng)原理見(jiàn)下式：

其中， 酸為該反應(yīng)的催化劑。反應(yīng)產(chǎn)物包括cis和trans兩個(gè)異構(gòu)體， 在本實(shí)驗(yàn)的色譜條件下， cis和trans兩個(gè)異構(gòu)體合并為一個(gè)色譜峰， 這有利于脂肪醛含量的測(cè)定。以己醛為例， 衍生化過(guò)程如下： 取10 μL 0.10 mmol/L己醛標(biāo)準(zhǔn)溶液與10 μL 1.0 mmol/L衍生化試劑溶液， 加入100 μL 10 μmol/L Η3ΡΟ4調(diào)節(jié)酸度， 加水至總體積為1 mL， 混勻后將反應(yīng)液置于恒溫混勻儀上， 在600 r/min、 40℃條件下反應(yīng)15 min， 反應(yīng)完成后冷卻至室溫， 取10 μL進(jìn)樣分析。

2.5 供試油樣的采集與處理

地溝油的采集與精煉： 參考文獻(xiàn)[14～17]的方法， 將從食堂中收集到的餐廚垃圾中的上層油脂先用棉花過(guò)濾， 濾液加熱至沸除去水分， 得粗制地溝油。在50 mL粗制地溝油中加入20 mL 1 mol/L NaOH， 油樣迅速變混濁， 出現(xiàn)白褐色絮狀物， 再加入10 mL 10% NaCl溶液靜置過(guò)夜， 油樣分層。取分層后的油樣加入一定量活性炭， 置于115℃油浴中30 min后過(guò)濾得到金黃色透明的精制地溝油， 其外觀與食用油基本一致。

超市購(gòu)買(mǎi)的食用油無(wú)需前處理， 開(kāi)封后直接取樣， 進(jìn)行衍生化反應(yīng)。

2.6 食用油與地溝油樣品的分析測(cè)定

取供試油樣品10 μL， 分別加入異丙醇200 μL、 1.0 mmol/L 衍生化試劑溶液10 μL、 10 μmol/L Η3ΡΟ4溶液100 μL、 水180 μL充分振蕩混勻， 置恒溫混勻儀上在600 r/min、40℃條件下反應(yīng)15 min。反應(yīng)后的溶液用少量的乙腈萃取3次， 離心分層， 取上清液合并后揮干溶劑， 殘留物用乙腈1 mL溶解， 0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾， 取10 μL續(xù)濾液進(jìn)樣分析。以保留時(shí)間定性， 按試樣峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品峰面積比較進(jìn)行定量。

3 結(jié)果與討論

3.1 衍生化條件的優(yōu)化

以己醛為代表， 分別考察了酸的種類(lèi)和用量、衍生化試劑用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間等條件對(duì)衍生化反應(yīng)的影響。按2.4節(jié)操作， 保持其它條件不變， 分別以相同濃度（105 mol/L）的不同的酸作為催化劑， 衍生化產(chǎn)物的色譜峰面積見(jiàn)表1， 即以Η3ΡΟ4為催化劑時(shí)效果最好。保持其它條件不變， 以不同濃度的Η3ΡΟ4（102～106 mol/L）作為催化劑時(shí)， 衍生化產(chǎn)物隨著Η3ΡΟ4濃度降低而增加， 但當(dāng)濃度低于10 μmol/L時(shí)， 衍生化產(chǎn)物開(kāi)始減少（圖1A）， 因此選擇最佳的Η3ΡΟ4濃度為105 mol/L。同理， 在保持其它條件不變的條件下， 確定了衍生化試劑與脂肪醛的濃度比為10∶1（圖1B）、反應(yīng)溫度為40℃（圖1C）、反應(yīng)時(shí)間為15 min（圖1D）為最佳條件。

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 線性關(guān)系與檢出限、進(jìn)樣精密度、重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取0.10 mmol/L混合醛標(biāo)準(zhǔn)溶液， 依次稀釋為75， 50， 25， 10， 5.0， 1.0 μmol/L， 各取10 μL， 加入濃度分別為混合醛溶液濃度10倍的衍生化試劑溶液50 μL、10 μmol/L Η3ΡΟ4 100 μL、異丙醇200 μL， 加水至總體積為1 mL， 充分振蕩混勻， 置恒溫混勻儀上在600 r/min、40℃條件下反應(yīng)15 min， 分別得到濃度為1.0， 0.75， 0.50， 0.25， 0.10， 0.05， 0.01 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)混合醛衍生反應(yīng)液， 各取10 μL進(jìn)樣分析。取線性關(guān)系中0.01 μmol/L標(biāo)準(zhǔn)混合醛衍生反應(yīng)液按稀釋法操作， 按信噪比3∶1測(cè)定各脂肪醛的檢出限。取0.10 μmol/L標(biāo)準(zhǔn)混合醛衍生反應(yīng)液， 按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次， 測(cè)定進(jìn)樣精密度。取10 μL地溝油1樣品， 按照2.6節(jié)方法處理樣品進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)， 測(cè)定重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。各脂肪醛在0.010～1.00 μmol/L的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好， 檢出限（S/N=3）在0.05～0.1 nmol/L之間， 進(jìn)樣精密度和重復(fù)性良好。

3.2.2 加標(biāo)回收率 取10 μL某品牌壓榨葵花籽油（20160814）， 分別精密加入20 μmol/L混合醛標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL， 平行做6份， 另取未加混合醛標(biāo)準(zhǔn)溶液的該品牌壓榨葵花籽油（20160814）10 μL同時(shí)進(jìn)行衍生化反應(yīng)， 按2.6節(jié)方法處理， 將衍生物用1 mL乙腈溶解， 取10 μL進(jìn)樣測(cè)定， 計(jì)算加標(biāo)回收率， 結(jié)果見(jiàn)表3， 各脂肪醛的加樣回收率在95.6%～101.4%之間。隨著碳鏈增長(zhǎng)， 加樣回收率逐漸降低， 可能是由于碳鏈增長(zhǎng)后， 在油脂中的溶解度增大， 萃取效率降低所致。

3.3 供試油樣品分析

取地溝油1、地溝油2、地溝油3、某品牌壓榨葵花籽油、某品牌玉米油、某品牌玉米胚芽油、某品牌葵花籽油各10 μL， 按照2.6節(jié)方法處理并進(jìn)行分析， 典型色譜圖見(jiàn)圖2， 含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

由圖2可見(jiàn)， 與混合醛標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（圖2A）比較， 新開(kāi)封食用油中只含有極微量的己醛（圖2B）， 可能是灌裝過(guò)程中混入少量氧氣導(dǎo)致亞油酸過(guò)氧化生成的。開(kāi)封后的食用油隨著接觸空氣量增加， 過(guò)氧化反應(yīng)不斷進(jìn)行， 己醛和壬醛（來(lái)自油酸的過(guò)氧化）含量逐漸升高（圖2C）。地溝油中己醛和壬醛的含量顯著高于新開(kāi)封食用油（圖2D、2B）， 與開(kāi)封一段時(shí)間的食用油比較， 除了己醛和壬醛含量明顯增加外， 檢出庚醛、辛醛和癸醛（圖2D、2C）， 這可能是由于地溝油精煉過(guò)程中經(jīng)過(guò)高溫處理降解而產(chǎn)生的， 而未經(jīng)高溫處理的食用油僅含有極少量的己醛和壬醛。對(duì)不同時(shí)間、不同地點(diǎn)采集的餐廚垃圾中的油脂進(jìn)行精煉所得的地溝油和超市購(gòu)買(mǎi)的不同品牌、不同生產(chǎn)時(shí)間的食用油的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4， 結(jié)果表明， 購(gòu)買(mǎi)的食用油中僅含極微量的己醛， 而地溝油中均含有己醛、庚醛、辛醛、壬醛和癸醛這5種長(zhǎng)鏈脂肪醛， 且己醛和壬醛顯著高于新開(kāi)封食用油和已開(kāi)封一段時(shí)間的食用油。但對(duì)于摻有地溝油的已開(kāi)封食用油， 以己醛和壬醛含量判別其是否為地溝油可能出現(xiàn)誤判。由表4可知， 利用供試油樣品中是否含有庚醛、辛醛和癸醛可判斷其是否為地溝油， 按表4的測(cè)定結(jié)果即使以1∶10比例將地溝油摻入食用油仍可檢測(cè)到庚醛、辛醛和癸醛（濃度遠(yuǎn)高于檢出限）。由此可見(jiàn)， 本研究通過(guò)測(cè)定長(zhǎng)鏈脂肪醛可實(shí)現(xiàn)對(duì)地溝油和摻有地溝油的食用油的鑒別， 為地溝油的鑒別提供了一種新的方法。

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