利用代謝組學研究大氣細顆粒物的生殖毒性效應

王曉飛+蔣守芳+張維冰+張凌怡+劉穎+杜曉妍+張潔+申河清

摘 要 大氣細顆粒物（PM2.5）污染已成為嚴峻的環(huán)境問題，探究PM2.5的毒性效應和機理變得尤為重要。本研究利用基于液相色譜/質譜的代謝組學技術，分析經(jīng)PM2.5懸混液氣管滴注暴露后成年雄性大鼠睪丸代謝組的全局變化，采用偏最小二乘判別分析法和非參數(shù)檢驗進行統(tǒng)計分析。結果表明，PM2.5暴露組大鼠睪丸的油提和水提代謝指紋譜均可與對照組實現(xiàn)準確區(qū)分，表明PM2.5暴露對大鼠睪丸的整體代謝網(wǎng)絡產(chǎn)生了顯著影響，最終鑒定出56個差異代謝物。通路分析顯示，PM2.5暴露會引起大鼠睪丸的氨基酸和核苷酸代謝紊亂、類固醇激素代謝失衡以及脂類代謝異常，而這些重要通路可能是PM2.5生殖毒性的關鍵分子事件。

關鍵詞 代謝組學； 大氣細顆粒物； 睪丸； 生殖毒性； 液相色譜質譜

1 引 言

隨著城市化進程的推進和經(jīng)濟發(fā)展，以細顆粒物（PM2.5）為主要成分的空氣污染已成為全國性的環(huán)境問題。PM2.5顆粒表面附著大量具有內分泌和代謝干擾效應的內分泌干擾物（Endocrine disrupting chemicals，EDCs），如重金屬、多環(huán)芳烴、揮發(fā)性有機物等，而且固體顆粒本身也對機體的正常代謝存在顯著影響。PM2.5進入呼吸道深部并沉積在末細支氣管和肺泡中，其中化學組分和細顆粒物進入血液循環(huán)，可能通過干擾下丘腦垂體性腺軸的內分泌和代謝通路從而影響生殖健康。美國環(huán)保署2009年發(fā)布的《關于顆粒物的綜合科學評估報告》指出暴露在濃度水平較高的空氣污染物中，未來生育能力會受到影響。已有研究表明，大氣顆粒物暴露引起生物體內炎癥反應和氧化脅迫，導致小鼠睪丸P450scc基因表達和血清睪酮水平顯著下降[1]，影響激素分泌相關通路[2，3]，并且大氣顆粒物污染可通過誘導生殖細胞DNA損傷、異常甲基化和內分泌干擾影響動物生殖器官發(fā)育，干擾睪丸類固醇激素合成與分泌，抑制精子發(fā)生，降低精子質量[4～6]。此外，PM2.5還可干擾大鼠睪丸細胞周期進程及引起細胞脂質過氧化，進而對其生殖系統(tǒng)產(chǎn)生毒害[7，8]。雖然目前的很多報道證明了PM2.5暴露對雄性生殖的影響，但是這些研究大部分停留在效應層面，相關生殖毒性的分子機理尚不明確[9]。

鑒于PM2.5的組成非常復雜，闡明其毒性機制面臨巨大的挑戰(zhàn)，代謝組學技術為解決這一問題提供了強大的工具。代謝組學研究生物體低分子量代謝物的系統(tǒng)響應，有助于從復雜的分子變化中識別出關鍵事件，而無需對毒性成分不確定的細顆粒物做明確的毒理學假設[10]。與基于假設的傳統(tǒng)毒理學不同，代謝組學基于高通量獲取的大數(shù)據(jù)篩選暴露效應相關的標志物，某些標志物本身就是毒性機制中的關鍵分子，與其它標志物結合通過進一步的聚類分析可發(fā)現(xiàn)相關的重要毒性通路。目前，PM2.5暴露相關的代謝組學研究還較少，并且主要側重肺部毒性效應的研究。 Chen等[11]利用脂質組學的方法研究了PM2.5對大鼠肺部脂質代謝的影響，發(fā)現(xiàn)一系列重要的脂類代謝物的合成和代謝通路發(fā)生了顯著變化。本研究組也利用代謝組學技術探討了PM2.5對A549肺上皮細胞的代謝網(wǎng)絡的影響，大量的氨基酸代謝、TCA循環(huán)和能量代謝相關小分子代謝物的表達發(fā)生了顯著變化[12]。

上述研究表明，代謝組學技術在揭示PM2.5毒性分子機理方面巨大的應用潛力。本研究針對PM2.5暴露組和對照組大鼠的睪丸代謝輪廓進行研究，應用統(tǒng)計分析方法篩選出差異性顯著的代謝物并加以鑒定，結合相關代謝通路對PM2.5的睪丸毒性機理進行了研究。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

ACQUITY超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Q Exactive質譜儀（美國Thermo公司）；大氣顆粒物采樣儀（中國武漢天虹公司）；石英纖維濾膜（英國Whatman公司）。甲醇和異丙醇（色譜純，德國Merck公司）；實驗用水由MilliQ超純水系統(tǒng)制備；甲酸（質譜純，百靈威J&K公司）。

2.2 實驗方法

2.2.1 PM2.5的收集和懸浮液制備 PM2.5的采樣地點為唐山市中心的華北理工大學公共衛(wèi)生學院二樓樓頂，采樣時間為2014年11月至2015年5月（污染最嚴重時期），濾膜在40℃避光保存。

將濾膜剪碎后放入超純水中，冰浴下超聲30 min，取出濾膜后，經(jīng)6層無菌紗布過濾，得到混懸液，上述提取過程重復一次，合并兩次所得混懸液，真空冷凍干燥得到PM2.5顆粒物。準確稱取PM2.5顆粒物，加入生理鹽水超聲下配制混懸液。PM2.5暴露前滅菌并超聲振蕩使混懸液均勻。

2.2.2 試驗動物分組與染毒方法 SD成年雄性大鼠（體重為（200±20） g，2月齡）適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分成兩組，分別為PM2.5混懸液處理組和對照組，每組6只。飼養(yǎng)條件為SPF級實驗動物室，晝夜交替各為12 h，暴露期間大鼠可以自由攝取食物和水。暴露組采用氣管滴注的方式進行染毒，每周染毒1次，連續(xù)染毒3個月，每周染毒容量為25 mg/kg。對照組采用生理鹽水進行氣管滴注。

2.2.3 睪丸組織的收集和代謝物提取 （1）睪丸組織樣品收集 大鼠末次染毒24 h后，采用10%水合氯醛腹腔注射方法麻醉，快速分離睪丸，放入液氮急速冷凍后， 80℃保存。（2）水溶性和脂溶性代謝物提取步驟 ＼[13] 樣品在4℃下解凍。稱取100 mg解凍后的樣品，加入1.5 mL甲醇水（1∶1， V/V， 20℃預冷），勻漿，離心10 min（4℃，16000 g），上清液即為水提代謝物，上清液真空冷凍干燥。再向沉淀物中加入1.6 mL二氯甲烷甲醇（3∶1， V/V， 20℃預冷），勻漿，離心10 min（4℃，16000 g），有機相即為油提代謝物，通風櫥內揮干。 所有樣品先用200 μL甲醇水（1∶1， V/V）復溶，離心除去不溶物后再進行檢測。（3）質量控制（QC）樣品的制備 每個大鼠睪丸組織稱取等量混合均勻后，按照上述樣品處理過程處理，所得代謝提取物作為質量控制樣品。

2.2.4 睪丸代謝提取物的LCMS條件 （1） 水提代謝物分析 Waters公司ACQUITY HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm i.d.， 1.7 μm，）；流動相A為0.1%甲酸的水溶液； 流動相B為含有0.1%甲酸的甲醇。梯度洗脫：初始流動相為0.1% B，保持2 min，6 min時升至25% B，10 min時升至80% B，12 min時升至90% B，21 min時升至99.9% B并保持2 min，隨后快速恢復初始0.1% B，并保持3 min。進樣體積為5 μL；流速為400 μL/min；柱溫40℃。（2）油提代謝物分析 Waters公司ACQUITY BEH C8 色譜柱（100 mm ×2.1 mm i.d.， 1.7 μm）；流動相C為0.1%甲酸溶液， 流動相D為含0.1%甲酸的甲醇異丙醇（85∶15， V/V）溶液。梯度洗脫：初始流動相為75% D，保持1 min，6 min時升至85% D并保持4 min，15 min時升至90% D并保持2 min，18 min時升至91% D并保持3 min，22 min時升至92% D并保持5 min，29 min時升至99.9% D并保持3 min，隨后快速恢復初始75% D并保持3 min。進樣體積為5 μL；流速為400 μL/min；柱溫40℃。（3）電噴霧離子源（ESI） 分別采用正、負離子模式采集數(shù)據(jù)，F(xiàn)ull MS分辨率70000，質譜掃描范圍為m/z 100～1000。氮氣作為載氣，正離子模式和負離子模式的噴針電壓分別設為3200和2800 V。對于水提代謝物：鞘氣流量45 L/min；輔助氣體積流量15 L/min；輔助氣溫度350℃；對于油提代謝物：鞘氣流量40 L/min；輔助氣體積流量10 L/min；輔助氣溫度320℃。每個樣品進樣兩次，隨機進樣，以便能消除人為或者儀器造成的系統(tǒng)誤差，QC樣品每隔6個樣品進一次樣，F(xiàn)ull MS/ddMS2模式用于獲得標志物的二級結構信息，NCE設為30%。

2.2.5 數(shù)據(jù)處理及代謝物鑒定 LCMS采集的原始數(shù)據(jù)轉換為mzXML格式，經(jīng)XCMS軟件處理后得到離子信息表，離子質荷比窗口設為10 ppm，保留時間窗口設為40 s。所得數(shù)據(jù)經(jīng)過峰面積歸一化并刪除檢出率小于80%的離子峰，處理后的數(shù)據(jù)導入SIMCAP（Version 11.0，Sweden），首先進行主成分分析考察方法穩(wěn)定性（QC樣品聚合情況），然后進行偏最小二乘判別分析（PLSDA），并通過SPSS軟件 （Version 18.0） 和MetaboAnalyst 3.0進行相關統(tǒng)計學分析。差異代謝物的篩選標準為：VIP值（Variable importance in the projection）≥1； 變化倍數(shù)≥2（處理組vs對照組）； p<0.05（處理組vs對照組）。將滿足上述篩選條件的水提代謝物的精確分子量導入HMDB（http：//www.hmdb.ca）數(shù)據(jù)庫，質量偏差≤30 ppm，同時結合代謝物的二級質譜信息進行鑒定。對于滿足上述篩選條件油提代謝物，將其二級質譜信息導入LipidSearchTM軟件 （Thermo ScientificTM）進行鑒定，搜索及鑒定參數(shù)設置如下：Type，Product；ExpType，LC；Precursor Tol，30 ppm， Grade=A or B。

3 結果與討論

3.1 代謝組學分析

理想的代謝組學分析要求盡可能獲得所有代謝物的信息。本研究分別在正、負離子模式下對大鼠睪丸組織的水提和油提代謝物進行分析，以獲得綜合全面的代謝物信息。圖1為代謝物的代表性指紋譜。

樣品分析過程利用QC樣品檢驗方法的可靠性及LCMS的穩(wěn)定性。采用PCA方法對樣品和QC樣品進行模式識別，如圖1所示，QC樣品有很好的聚合度，說明本方法重復性好，儀器性能穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可靠，滿足代謝組學分析的要求。

偏最小二乘法判別分析（PLSDA）是代謝組學中常用的數(shù)據(jù)分析方法，可以在不降低模型的預測能力的前提下，有效減少模型的復雜性， 增強模型的解釋能力[14]。PLSDA分析（圖2）表明，在兩種代謝物提取方法和兩種離子掃描模式下，PM2.5處理組均能夠與對照組實現(xiàn)很好的聚類區(qū)分，說明PM2.5處理對大鼠睪丸的整體代謝產(chǎn)生了顯著影響。

處理過的離子信息表導入MetaboAnalyst 3.0進行統(tǒng)計學分析（圖3），不同提取方式下代謝物在兩組間差異性，橫坐標代表代謝物在兩組間的變化倍數(shù)的log2，縱坐標代表代謝物在兩組間ttests的p值的log10。由圖3可見，PM2.5處理組與對照組大鼠的睪丸中存在大量顯著性差異的代謝物。根據(jù)變量的重要性，結合變化倍數(shù)及變量在兩組間的差異性，最終篩選出56個差異代謝物（表1），包括2個氨基酸代謝物、 6個核苷酸代謝物、 3個類固醇激素代謝物、 2個前列腺素、 3個溶血磷脂、 20個磷脂酰膽堿、7個磷脂酰乙醇胺、 5個鞘磷脂、2個甘油單酯、1個甘油二酯和5個甘油三酯。

3.2 PM2.5通過誘導氧化應激引起核苷酸代謝紊亂

目前普遍接受的PM2.5暴露的毒性機理包括以下方面：PM2.5進入人體后，會增加體內的氧化應激壓力，導致DNA損傷[15，16]、細胞和器官的功能異常[17，18]，同時造成炎癥因子的釋放[19，20]，從而導致多種疾病的發(fā)生或者加重。氧化脅迫是PM2.5暴露所引起的體內主要反應[12]，睪丸內氧化應激的增強會影響睪丸內精子的產(chǎn)生和成熟[21]，并且核苷酸代謝紊亂被認為與氧化應激相關。6個與核苷酸代謝相關的代謝物在PM2.5處理組和對照組中產(chǎn)生了顯著變化（4個上升，2個下降），說明PM2.5暴露引起了大鼠睪丸內核苷酸代謝的紊亂，這表明PM2.5很可能通過引起氧化應激增強來干擾核苷酸代謝，并對大鼠睪丸正常生理功能產(chǎn)生損害。

3.3 PM2.5可引起類固醇激素及多種脂類的代謝異常

類固醇激素在促進性腺發(fā)育與生殖控制方面起重要作用，PM2.5處理組大鼠睪丸中17羥孕酮（17Hydroxyprogesterone）、7雙烯醇酮（7Dehydropregnenolone）和二氫雄甾酮（Dihydroandrosterone）這3個與類固醇激素相關代謝物的水平明顯上升，這表明PM2.5可能會引起體內類固醇激素合成代謝的紊亂。睪酮是雄性生殖調節(jié)過程中最重要的激素，二氫雄甾酮作為睪酮的代謝物，其表達在PM2.5處理組中明顯升高，表明PM2.5暴露加速了睪酮代謝，降低體內的睪酮水平，因此會影響雄性大鼠生殖功能。暴露后，45個脂類代謝物發(fā)生了顯著變化，涉及到前列腺素（Prostaglandins）的生成與代謝、溶血磷脂（Lysophospholipid）代謝、磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholine）代謝、磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamine）代謝、鞘磷脂（Sphingomyelin）代謝和甘油三酯代謝（Monoacylglyceride， diglycerideand triglyceride）。睪丸組織的脂類代謝在維持正常的雄性生殖功能方面也起到了非常重要的作用[22，23]，尤其是在細胞膜的流動性保持、精子運動能力和維持精子形態(tài)等方面[24]。前列腺素含量變化已被證明能夠顯著影響雄性生殖能力，包括影響睪丸的發(fā)育，精子的生成及活性[25]。磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂做為生物膜的主要成分，在維持精子細胞膜完整和功能正常方面起到了重要作用[26]。而且甘油三酯代謝與精子生成供能密切相關[27]。這表明PM2.5暴露會造成大鼠睪丸內脂類代謝紊亂，進而可能會影響到大鼠睪丸的正常生理功能、精子生成及精子形態(tài)的正常，從而損害大鼠的生殖功能。

3.4 PM2.5會干擾色氨酸和亮氨酸的合成和代謝通路

作為生物體內構成蛋白質分子的基本單位，氨基酸參與了蛋白質合成和能量代謝等多種生命活動。2氨基2，4己二烯二酸（2Aminomuconic acid）和2羥基異己酸（Hydroxyisocaproic acid）分別是色氨酸和亮氨酸的代謝產(chǎn)物。與對照組相比，PM2.5處理組大鼠睪丸中色氨酸和亮氨酸的代謝水平顯著升高，這說明PM2.5暴露擾亂了睪丸中部分氨基酸的合成和代謝通路。

4 結 論

本研究利用代謝組學技術對PM2.5處理后大鼠睪丸組織的代謝指紋譜進行了比對分析，發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露對大鼠睪丸的整體代謝組產(chǎn)生了顯著影響，鑒定了56個差異顯著的代謝物，代謝通路分析表明PM2.5暴露會導致氨基酸和核苷酸代謝紊亂、類固醇激素代謝失衡以及脂類代謝異常。這些重要通路是PM2.5生殖毒性的關鍵分子事件，在此基礎上，綜合利用常規(guī)毒理學方法和基因組學、蛋白質組學等系統(tǒng)生物學技術，深入研究這些分子事件上下游的響應機理，對于認識大氣顆粒物的生殖毒性機制具有重要的意義。

References

1 Li C， Li X， Jigami J， Hasegawa C， Suzuki A K， Zhang Y， Fujitani Y， Nagaoka K， Watanabe G， Taya K. Inhal.Toxicol.， 2012， 24（9）： 599-608

2 Balasubramanian P， Sirivelu M P， Weiss K A， Wagner J G， Harkema J R， Morishita M， MohanKumar P， MohanKumar S. Neurotoxicology， 2013， 36： 106-111

3 Block M L， CalderónGarcidueas L. Trends Neurosci.， 2009， 32（9）： 506-516

4 Somers C M. Syst. Biol.Reprod. Med.， 2011， 57（12）： 63-71

5 Ono N， Oshio S， Niwam Y， Yoshida S， Tsukue N， Sugawara I， Takano H， Takeda K. Inhal.Toxicol.， 2007， 9（3）： 275-281

6 Yoshida S， Sagai M， Oshio S， Umeda T， Ihara T， Suqamata M， Suqawara I， Takeda K. Int. J. Androl.， 1999， 22（5）： 307-315

7 ZHANG Lin， NIU JingPing， XU Jia， XU DaQin. Asian J. Ecotoxicol.， 2009， 4（2）： 271-275

張 琳， 牛靜萍， 徐 佳， 徐大琴. 生態(tài)毒理學報， 2009， 4（2）： 271-275

8 LIU XiaoLi， LI Hong， MENG ZiQiang. China Environmental Science J.， 2005， 25（2）： 160-164

劉曉莉， 李 紅， 孟紫強. 中國環(huán)境科學， 2005， 25（2）： 160-164

9 WANG EnPeng， SUN Yan， YUE Hao， CHEN HuanWen， WANG Yang， CHEN ChangBao， LIU ShuYing. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44（9）： 1410-1418

王恩鵬， 孫 巖， 越 皓， 陳煥文， 王 洋， 陳長寶， 劉淑瑩. 分析化學， 2016， 44（9）： 1410-1418

10 YAN Chao， CAO XiNing， SHEN LianJu， LIU DongYao， PENG JinPu， CHEN JinJun， ZHOU Yue， LONG ChunLan， LIN Tao， HE DaWei， LI XuLiang， WEI GuangHui. National Journal of Andrology， 2016， 22（2）： 104-109

嚴 超， 曹希寧， 沈煉桔， 劉東堯， 彭金普， 陳進軍， 周 玥， 龍春蘭， 林 濤， 何大維， 李旭良， 魏光輝. 中華男科學雜志， 2016， 22（2）： 104-109

11 Chen W L， Lin C Y， Yan Y H， Cheng K T， Cheng T J. Mol. Biosys.， 2014， 10（12）： 3163-3169

12 Huang Q， Zhang J， Luo L， Wang X F， Wang X X， Alamdar A， Peng S， Liu L， Tian M， Shen H. Toxicol. Res.， 2015， 4（4）： 939-947

13 Want E J， Masson P， Michopoulos F， Wilson I D， Theodoridis G， Plumb R S， Shockcor J， Loftus N， Holmes E， Nicholson J K. Nat. Protoc.， 2012， 8（1）： 17-32

14 Trygg J， Wold S. J. Chemometr.， 2002， 16 （3）： 119-128

15 Corsini E， Budello S， Marabini L. Arch. Toxicol.， 2013， 87（12）： 2187-2199

16 SaintGeorges F， Garon G， Escande F， Abbas I， Verdin A， Gosset P， Mulliez P， Shirali P. Toxicol. Lett.， 2009， 187（3）： 172-179

17 Deng X， Zhang F， Rui W， Long F， Wang L， Feng Z， Chen D， Ding W. Toxicol. in vitro， 2013， 27（6）： 1762-1770

18 Li N， Sioutas C， Cho A， Schmitz D， Misra C， Sempf J， Wang M， Oberley T， Froines J， Nel A. Environ. Health. Persp.， 2003， 111（4）： 455

19 Dagher Z， Garon G， Gosset P， Ledoux F， Surpateanu G， Courcot D， Aboukais A， Puskaric E， Shirali P. J. Appl. Toxicol.， 2005， 25（2）： 166-175

20 Potnis P A， Mitkus R， Elnabawi A， Squibb K， Powell J L. Toxicol. Res.， 2013， 2（4）： 259-269

21 Shiraishi K， Naito K. J. Urology， 2007， 178（178）： 1012-1017

22 Robinson B S， Johnson D W， Poulos A. J. Biot. Chem.， 1992， 267（3）： 1746-1751

23 Retterstl K， Haugen T B， Tran T N， Christophersen B O. Reproduction， 2001， 121（6）： 881-887

24 Connor W E， Lin D S， Wolf D P， Alexander M. J. Lipid. Res.， 1998， 39（7）： 1404-1411

25 YE GanCai. Progress in Physiological Sciences， 1983， 14（1）： 53-57

葉干才. 生理科學進展， 1983， 14（1）： 53-57

26 HinkovskaGalcheva V， Petkova D， Koumanov K. Cryobiology， 1989， 26（1）： 70-75

27 Aziz， M A， ELHAGGAR， S， Tawadrous， G A， Hamada， T， Shawky， M A， Amin， K S. Andrologia， 1983， 15（3）： 259-263