分子模擬—活性自由基聚合法制備山奈酚分子印跡整體柱及其性能評價

買買提·吐爾遜+熱薩萊提·伊敏+買合木提江·杰力+古麗巴哈爾·達(dá)吾提+楚剛輝+尹學(xué)博

摘 要 通過分子模擬研究模板分子與功能單體的相互作用，可以縮短優(yōu)化時間，為選取合適的功能單體以及模板分子/功能單體比例提供依據(jù)。本研究以山奈酚為模板分子，通過分子模擬優(yōu)化實驗條件，確定以甲基丙烯酸（MAA）為最優(yōu)的功能單體，山奈酚/MAA最佳比例為1∶4 （w/w）。此外，以二芐基三硫代碳酸酯（DBTTC）為可逆加成鏈斷裂轉(zhuǎn)移劑，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）為交聯(lián)劑，實現(xiàn)了僅需優(yōu)化引發(fā)劑和可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合（RAFT）試劑即可制得性能優(yōu)異的山奈酚分子印跡整體柱。此整體柱對山奈酚和相似物槲皮素的分離度為1.52，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%。實驗結(jié)果表明，分子模擬計算簡化了實驗步驟，以DBTTC為RAFT試劑得到了具有更好形態(tài)和結(jié)構(gòu)的分子印跡整體柱。

關(guān)鍵詞 山奈酚； 分子印跡； 整體柱； 高效液相色譜； 分子模擬

1 引 言

采用分子印跡技術(shù)可以制備針對目標(biāo)分子具有專一性識別和高親和力的聚合物。非共價分子印跡技術(shù)是目前廣泛使用的分子印跡聚合物（MIP）制備方法[1，2]。相對而言，非共價分子印跡聚合物雖然對目標(biāo)分子的識別專一性略低，但具有吸附解吸附快等優(yōu)點，特別適合制備樣品前處理柱和色譜柱[3，4]。其中，分子印跡整體柱結(jié)合了MIP的高選擇性和整體柱的優(yōu)點，近年來受到了研究者的廣泛關(guān)注[5～10]。

制備柱效高的色譜固定相材料是整體柱制備的關(guān)鍵。影響色譜柱柱效的因素有聚合物的形態(tài)和孔結(jié)構(gòu)，以及單體與模板分子比例。一些文獻(xiàn)報道了聚合條件和方法對整體柱形態(tài)和孔結(jié)構(gòu)的影響[11]。常用的自由基聚合方法在合成整體柱聚合物過程中，存在偶合終止反應(yīng)、歧化終止反應(yīng)和鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)等，使制備過程難以控制[12，13]，得到的MIP聚合物分子量分布寬，聚合物結(jié)構(gòu)均勻性差。而開發(fā)新的可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合（RAFT）試劑有助于消除自由基聚合中的副反應(yīng)[14，15]。對于聚合反應(yīng)中單體與模板分子比例的選擇，目前多采用實驗摸索，即比較不同比例的單體與模板分子所制備得到的聚合物的性質(zhì)，以確定最佳的比例，但這種通過實驗的方法復(fù)雜費時，且由于需考慮較多的影響因素，因此較難得到優(yōu)化的比例。

針對上述問題，本研究采用分子模擬計算考察了模板分子山奈酚（Kaempferol）和功能單體的結(jié)合能以及結(jié)合比，計算結(jié)果表明，與2乙烯基吡啶（2VP）相比，甲基丙烯酸（MAA）為更好的功能單體，且模板分子山奈酚/MAA的最佳比例為1∶4 （w/w）。制備了二芐基三硫代碳酸酯（Dibenzyltrithiocarbonate， DBTTC）為RAFT試劑[16]，有效抑制了雙基終止反應(yīng)，從而實現(xiàn)對自由基聚合的有效控制，并克服了MIP整體柱結(jié)構(gòu)的不均勻性問題，僅需優(yōu)化引發(fā)劑和RAFT試劑即可制備出性能優(yōu)異的整體柱。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

LC20AT高效液相色譜儀，配有SPDM20A二極管陣列檢測器、DGU20A5在線脫氣機(jī)、LCsolution 工作站（日本島津公司）；S3500N掃描電子顯微鏡（日本日立公司）；Tristar 3000氮吸附儀（美國Micromeritics公司）；Autopore Ⅳ 9500壓汞儀（Micromeritics， USA）。

山奈酚（純度98%，中國藥品生物制品檢定所）；甲基丙烯酸（MAA，分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠）；2乙烯基吡啶（2VP，分析純，上海阿拉丁試劑有限公司）；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，分析純，山東煙臺云開化工有限責(zé)任公司）；偶氮二異丁腈（AIBN，化學(xué)純，上海試四赫維化工有限公司）；其余試劑均為分析純；實驗用水為二次蒸餾水。

2.2 實驗方法

2.2.1 復(fù)合物的分子模擬計算 利用喀什大學(xué)高性能計算平臺上的Gaussian 09 軟件， 使用DFT RBVP86模擬計算模板分子與功能單體形成復(fù)合物之間的相互作用能，計算了山奈酚為模板分子與MAA或2VP為功能單體形成的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)、成鍵情況、結(jié)合能以及復(fù)合物的聚合比等。計算平臺包括24個6核通用處理器，內(nèi)存容量128 GB，計算機(jī)群在Linux 操作系統(tǒng)下執(zhí)行Gaussian 09 軟件， 主要采用密度泛函理論（DFT）方法。

2.2.2 分子印跡整體柱的制備 采用文獻(xiàn)[16]報道的相轉(zhuǎn)移催化法合成RAFT 試劑二芐基三硫代碳酸酯 （DBTTC）。模板分子山奈酚加入甲醇1.0 mL、MAA 0.24 g （2.8 mmol，功能單體）、EDMA 2.8 g （14.0 mmol，交聯(lián)劑）、十二醇7.6 mL，超聲10 min使之混合均勻；加入引發(fā)劑AIBN和RAFT試劑DBTTC，再次超聲10 min，通氮氣10 min。將混合溶液注入兩端接有PVC管的不銹鋼色譜柱管（150 mm×4.6 mm）中，封口，60 ℃水浴反應(yīng)24 h后，將延長管取下，色譜柱接入液相色譜系統(tǒng)，用HAcCH3OH（20∶80， V/V）為流動相，洗去模板分子及未反應(yīng)物。改變AIBN和DBTTC的比例，按照上述過程制備不同比例的整體柱。非印跡柱的制備除不加模板分子外，其余條件與印跡整體柱相同。

2.2.3 山奈酚分子印跡整體柱材料的形態(tài)及孔徑分析 將延長管中的聚合物取出，以冰乙酸甲醇（20∶80， V/V）、甲醇索氏提取，置于真空干燥箱中50℃干燥2 h。掃描電鏡觀察整體柱聚合物的形貌，氮吸附（BET法）測定孔容和比表面積。整體柱的孔隙率（ε）、通透性KF用以下公式[17]進(jìn)行計算。

2.2.4 液相色譜法評價整體柱的分離效率 以分子印跡整體柱作為固定相，0.1% H3PO4甲醇（20∶80， V/V）為流動相，測定印跡整體柱和非印跡整體柱對山奈酚和槲皮素（Quercetin）的分離效率。檢測波長為365 nm，保留因子k、分離因子α、分離度（Rs）用以下公式進(jìn)行計算。

3 結(jié)果與討論

3.1 復(fù)合物的計算模擬

山奈酚和槲皮素是植物界分布最廣的類黃酮化合物，具有較強的抗氧化性能[18，19]，開發(fā)山奈酚選擇性提取或分離的MIP技術(shù)尤為重要。在本研究組前期條件實驗（結(jié)果未給出）的基礎(chǔ)上，從5個不同功能單體中選擇MAA和2VP兩種功能單體，采用Gaussian 09 軟件， 使用DFT RBVP86模擬計算模板分子山奈酚與MAA和2VP兩種功能單體之間的相互作用能及復(fù)合物的氫鍵鍵長。圖1為模擬計算得到的山奈酚與功能單體MAA和2VP的結(jié)構(gòu)示意圖，其中陰影部分為模板分子山奈酚，周圍是與山奈酚通過氫鍵結(jié)合的功能單體分子。

計算結(jié)果表明，山奈酚與MAA的摩爾比為1∶4時，可以通過氫鍵形成完整的包結(jié)結(jié)構(gòu)（圖1A）。山奈酚分子與MAA分子之間24O與28H、48O與23H、31O與79H等形成較穩(wěn)定的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，增加了復(fù)合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。而且，山奈酚分子22號、29號位置的O（22O、29O）和MAA分子55號、43號位置的H（55H、43H）所形成的氫鍵鍵長較短，鍵能較大。山奈酚與功能單體MAA所形成的氫鍵數(shù)為12，而與功能單體2VP所形成的復(fù)合物中氫鍵總數(shù)為10個。結(jié)合單體分子MAA與模板分子形成的氫鍵鍵長更短（表1）可知，由山奈酚與MAA所形成的印跡聚合物分子結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。因此，MAA適合作為山奈酚MIP的功能單體，且山奈酚/MAA的最優(yōu)分子比例為1∶4。分子模擬還可以預(yù)測分子印跡空穴的形狀，圖2顯示了MAA為功能單體時的分子印跡空穴及山奈酚吸附解吸附的過程。

3.2 聚合條件對于分子印跡整體柱結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響

進(jìn)行RAFT聚合時，雙官能團(tuán)二芐基三硫代碳酸酯DBTTC作為鏈轉(zhuǎn)移試劑， 和由AIBN引發(fā)得到的聚合鏈進(jìn)行可逆鏈轉(zhuǎn)移，抑制雙基終止反應(yīng)，從而實現(xiàn)對自由基聚合的有效控制，得到分子量分布窄的MIP [20]。分子模擬計算表明MAA比2VP更適合作為功能單體，且MAA和山奈酚優(yōu)化的摩爾比為4∶1。因此，選擇MAA為功能單體，EDMA為交聯(lián)劑，模板分子/功能單體/交聯(lián)劑的摩爾比為1∶4∶20。為驗證分子模擬計算結(jié)果，同時使用2VP為功能單體合成山奈酚MIP整體柱，但所得聚合物顆粒小，柱壓過大后容易塌陷，這也從另一側(cè)面驗證了分子模擬計算結(jié)果的正確性。因此，通過分子模擬計算可以省去功能單體的選擇及功能單體和模板分子比例的優(yōu)化等步驟。

選擇甲醇十二醇（20∶80，V/V）為致孔劑，AIBN為引發(fā)劑，DBTTC為鏈轉(zhuǎn)移劑，優(yōu)化單體總量和致孔劑的比例，探討了RAFT法制備分子印跡整體柱的合成條件及其對于結(jié)構(gòu)、色譜分離特性的影響。表2為改變引發(fā)劑濃度及AIBN和DBTTC的比例合成的整體柱情況。研究了RAFT聚合條件對于整體柱結(jié)構(gòu)及分離效果的影響，并以氮吸附和壓汞實驗測定了聚合物的孔徑和比表面積（表2，圖3）。

氮氣吸附和壓汞實驗表明，加入RAFT試劑合成的C1和C2柱平均孔徑小于不加RAFT的C4。與AIBN引發(fā)傳統(tǒng)自由基反應(yīng)的整體柱相比，RAFT方法制備的整體柱孔徑分布較窄，聚合物顆粒均勻，證明了RAFT方法的可控性。同時，加入RAFT 試劑的C1和C2具有更大的比表面及孔隙率，具有更好的孔結(jié)構(gòu)。

從表2、圖3和圖4的結(jié)果可知，單體濃度增大導(dǎo)致整體柱材料的孔徑變小，比表面積增大和顆粒粒徑也變小?？赡苁且驗殡S著溶劑（致孔劑）量的減小，引發(fā)劑濃度增大導(dǎo)致活性中心增多，反應(yīng)速度加快，從而導(dǎo)致鏈增長和相分離速度加快。小顆粒相互連接成簇，且簇與簇之間的連接緊密，導(dǎo)致孔徑減小。與傳統(tǒng)自由基聚合相比，加入DBTTC的整體柱固定相孔徑較小，且比表面和孔隙率明顯較高。最終，選取C2柱的合成條件制備山奈酚MIP整體柱。

3.3 合成時Monomer/AIBN/RAFT比例對分離效率的影響

為考察印跡整體柱和非印跡整體柱對山奈酚和槲皮素的分離效率，測定了不同整體柱對于山奈酚和槲皮素的保留因子、選擇性、分離度（表3，圖5）。隨著RAFT試劑加入量的增加，由于孔徑分布較窄，比表面增大，結(jié)構(gòu)更加均勻，山奈酚印跡柱的分離因子和柱效都明顯提高，分離度增大。

圖5為C2柱的分離色譜圖，色譜數(shù)據(jù)顯示，結(jié)構(gòu)類似物槲皮素幾乎沒有被山奈酚整體柱保留，而作為模板分子的山奈酚被有效保留，并顯示出典型的分子印跡整體柱的洗脫曲線特性—拖尾。均勻的結(jié)構(gòu)是決定聚合物整體柱性能的重要因素，而RAFT試劑起到了控制聚合過程、調(diào)節(jié)聚合物形態(tài)和性能的作用。

3.4 整體柱的穩(wěn)定性

以0.1% H3PO4甲醇（20∶80，V/V）為流動相，呈良好的線性關(guān)系。流速達(dá)到3.0 mL/min時，柱壓僅為3.5 MPa。 另外，取山奈酚和槲皮素混合溶液， 6次進(jìn)樣，每次進(jìn)樣量20 μL，山奈酚和槲皮素的平均分離度為1.52，分離度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%。上述結(jié)果表明，整體柱存在大的通孔，且孔結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果表明， 分子模擬可以提供優(yōu)化的功能單體以及單體/模板分子比例信息，有效縮短整體柱制備的條件優(yōu)化過程。同時，采用二芐基三硫代碳酸酯為RAFT試劑可以實現(xiàn)可控自由基聚合，從而獲得更為均勻的分子印跡整體柱和較好分離效果。與傳統(tǒng)自由基聚合法相比，RAFT自由基聚合法得到的整體柱比表面積大、孔徑較小、骨架結(jié)構(gòu)均勻。本研究中的分子模擬優(yōu)化的功能單體和選擇單體/模板分子比例的方法也可用于其它模板分子的MIP的制備。

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