氣泡微萃取—氣相色譜—質(zhì)譜法測定尿中咖啡因

宋愛英+王麗紅+張延霞+石恩林+曾俊菱

摘 要 建立了氣泡微萃取結合氣相色譜/質(zhì)譜技術（GCMS）測定尿中咖啡因的方法。對影響萃取效率的實驗條件進行了優(yōu)化，確定了最佳萃取條件：三氯甲烷作為萃取溶劑，萃取溶劑暴露體積1 μL，氣泡體積1.6 μL，攪拌速度300 r/min，萃取時間5 min，鹽度15%（m/V），氣泡與磁子間距離1 cm。在優(yōu)化條件下，所建立方法在咖啡因濃度0.005～10 mg/L范圍內(nèi)有較好的線性關系，相關系數(shù)可達0.986，檢出限為0.003 mg/L。在人尿液中添加不同濃度的咖啡因（0.050、0.500和5.000 mg/L），回收率為89.2%～107.5%，相對標準偏差小于8%（n=6）。

關鍵詞 氣泡微萃取； 咖啡因； 氣相色譜/質(zhì)譜； 尿

1 引 言

咖啡因（Caffeine）是一種嘌呤類生物堿，即1，3，7三甲基黃嘌呤，屬中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑，適量攝入能夠緩解疲勞、振奮精神、提高注意力[1，2，]，被廣泛用作食品添加劑[3]。同時，咖啡因也是一種毒品，不當使用會造成上癮、神經(jīng)過敏和睡眠紊亂等不良反應，嚴重者甚至會導致中毒或死亡[4～7]。因此，對人體檢材中咖啡因的測定具有非常重要的意義。由于人體檢材基體復雜，在進行儀器分析前需對其進行適當前處理，但以液液萃取、固相萃取為代表的傳統(tǒng)樣品前處理技術存在操作步驟繁瑣、耗時耗力、要消耗大量對人體和環(huán)境有毒有害的有機溶劑等缺點[8，9]，因此，亟待開發(fā)綠色高效的新型樣品前處理技術。

近年發(fā)展起來的氣泡微萃取技術（BIDSDME）采用向萃取溶劑微滴中引入適量空氣的手段，在置于樣品溶液中的微量注射器針尖形成氣泡，萃取一定時間后，將氣泡抽回到微量注射器中， 完成萃取過程。該技術不僅保留了單滴液相微萃取的簡便快速、成本低廉、對環(huán)境友好等優(yōu)點[10，11]，而且還具有萃取溶劑微滴表面積更大、使比重大的萃取溶劑（如二氯甲烷、三氯甲烷等）微滴在萃取過程中更加穩(wěn)定等優(yōu)點，目前，已被成功用于對水樣、土壤、牛尿等樣品中的農(nóng)藥、除草劑和雌激素等目標分析物的萃取[12～15]。

此前，Shrivas等將0.5 μL三氯甲烷暴露于7 μL微量樣品中，完成了對咖啡因的萃取分離[16]。該方法雖有所需樣品量少、無基質(zhì)效應等優(yōu)點，但受萃取溶劑量少和萃取過程只能在無攪拌條件下進行等因素限制，其萃取效率還比較低。受此啟發(fā)，本研究將暴露于樣品溶液的萃取溶劑體積增至1 μL，并向其中引入了0.6 μL空氣，通過優(yōu)化攪拌速度、萃取時間和鹽度等實驗參數(shù)，結合GC/MS，建立了測定尿中咖啡因的BIDSDMEGC/MS分析方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

6890/5975氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司），HP5毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm × 0.50 μm， 美國Agilent公司）； WH220 plus磁力攪拌器（德國Wiggens公司）； MettlerAE 163十萬分之一分析天平； 微量注射器（5 μL，美國Agilent公司）； MilliQ Element純水機（美國Millipore公司）。

咖啡因標準品（純度為97%，北京世紀奧科生物技術有限公司）； 二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、正己烷和環(huán)己烷（分析純，天津利安隆博華醫(yī)藥化學有限公司）； 咖啡粉（1+2原味）購于當?shù)爻小?/p>

2.2 樣品預處理

自愿者在實驗前36 h內(nèi)未攝入任何含咖啡因的飲料或食品。將15 g咖啡粉用150 mL開水沖泡，涼溫后由自愿者飲用，采集自愿者飲用咖啡前所排尿液作為空白，采集飲用咖啡后1～24 h內(nèi)所排尿液作為待測樣品。代謝咖啡因測定于尿樣采集后1 h內(nèi)完成。測定過程中向待測尿液加入適量NaCl，使其鹽度保持在15%（m/V），尿樣的初始鹽度參照標準方法進行測定[17]。

具體萃取過程： 取1 mL尿樣于盛有磁子的具塞小瓶中，用微量注射器吸入1.1 μL有機溶劑，再吸入0.6 μL空氣，用微量注射器刺穿瓶塞，伸入尿樣液面以下，緩慢推出空氣和1 μL有機溶劑（保留在微量注射器金屬針管中的0.1 μL有機溶劑用于提高對氣泡的固定作用）， 在注射器針尖形成氣泡，以300 r/min轉(zhuǎn)速萃取5 min后，停止攪拌，仔細將整個氣泡抽回微量注射器后，直接向GC/MS進樣。BIDSDME萃取裝置為自行搭建，其結構如圖1 所示。

2.3 儀器工作參數(shù)

2.3.1 氣相色譜條件 HP5毛細管色譜柱，柱溫保持在200℃，每次信號采集時間為5 min； 進樣口溫度為250℃； 采用分流進樣模式，分流比為10∶1； 載氣為高純（純度≥99. 999%）氦氣，流量為1.3 mL/min。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源為電子轟擊離子（EI）源，電子轟擊能量為70 eV，離子源溫度為230℃，傳輸線溫度為150℃，采用全掃描（SCAN）模式； 相對保留時間4.67 min，根據(jù)碎片離子峰的相對強度大小，選取離子m/z 194，109和 82對目標分析物進行定性[22]； 溶劑延遲時間為3 min。

2.4 標準溶液的配制

咖啡因標準儲備液：準確稱取咖啡因10.00 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1 mg/mL的溶液作為標準儲備液，4℃避光保存。

咖啡因工作溶液：吸取適量的標準儲備液于10 mL容量瓶中，用去離子水定容， 使其質(zhì)量濃度分別為0.005、0.010、0.050、0.100、0.500、1.00、5.00和10.00 mg/L。

3 結果與討論

3.1 萃取條件的優(yōu)化

3.1.1 萃取溶劑的選擇 萃取溶劑的選取對萃取效率具有重要影響。萃取溶劑須滿足：（1）不溶或難溶于樣品溶液； （2）對目標分析物具有很好的選擇性，并盡可能少的萃取樣品基體成分； （3）密度適宜，使得萃取微滴在樣品中所受重力和浮力的合力盡可能小，從而保證在萃取過程中微滴不易從針尖易位或脫落等條件[14，18]。根據(jù)以上原則，考察了二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、正己烷和環(huán)己烷7種有機溶劑對水樣中咖啡因的萃取能力，結果表明，三氯甲烷的萃取效率最好。因此選取三氯甲烷作為萃取溶劑。

3.1.2 氣泡體積的選擇 氣泡體積為吸入的有機溶劑和空氣的體積之和。由萃取溶劑和所引入空氣體積共同決定，對萃取效率有顯著影響。首先考察了三氯甲烷暴露體積（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 μL）對萃取效率的影響。由圖2可見，萃取效率隨著三氯甲烷暴露體積的增加而提高，但當體積超過1 μL時， 引入空氣會導致氣泡易位甚至掉落，因此選取三氯甲烷暴露體積為1 μL。其次，考察了引入空氣體積（0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 μL）對萃取效率的影響。由圖3可見，隨著引入空氣體積的增加，萃取效率和精密度在逐漸提高，當引入空氣體積增至0.6 μL時，萃取效率和精密度達到了最佳，而后隨氣泡體積的增大而下降。因此，選取引入空氣體積為0.6 μL，最終確定氣泡體積為1.6 μL。

3.1.3 攪拌速度的選擇 提高攪拌速度可以有效增大傳質(zhì)速率，從而進一步提高萃取效率，但攪拌速度過高會損害氣泡的穩(wěn)定性?？疾炝瞬煌瑪嚢杷俣龋?、100、150、200、250、300、350、400、450和500 r/min）對萃取效率的影響，結果表明，隨著轉(zhuǎn)速增加，萃取效率不斷提高，但當轉(zhuǎn)速超過300 r/min時，易造成氣泡偏離針尖， 甚至掉落，因此，選取轉(zhuǎn)速為300 r/min。

3.1.4 萃取時間的選擇 萃取時間也是影響萃取效率的重要參數(shù)?？疾炝溯腿r間（1， 5， 10， 15， 20， 25和30 min）對萃取效率的影響。由圖4可見，在15 min內(nèi)，隨著萃取時間延長，萃取效率也在逐漸提高，但當萃取時間超過15min時，萃取效率會明顯下降，原因可能是三氯甲烷具有揮發(fā)性和部分水溶性，萃取時間過長，導致三氯甲烷的揮發(fā)和/或溶解損失。另外，在分析尿樣過程中發(fā)現(xiàn)，當萃取時間超過6 min時，氣泡在被抽回的過程中有少量掉落，因此選取萃取時間為5 min。

3.1.5 pH值和鹽度的選擇 pH值會影響某些目標物分子在樣品溶液中的存在形式，因而會通過改變目標分子在水相和有機相間的分配比，因而會通過改變目標分子在水相和有機相之間的分配比來影響萃取效率。本研究采用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH對咖啡因標準液pH值進行調(diào)控，考察了pH值對萃取效率的影響。結果表明，在pH 2～7范圍內(nèi)，萃取效率隨pH值增加而明顯提高。原因是咖啡因?qū)儆谌鯄A性化合物，在酸性條件下，其主要以離子形式存在，在水相中的溶解度較大； 隨著pH值增加，咖啡因主要以分子形式存在，在有機相/水相間的分配比會增大所致[19]。為了盡量保證樣品的原始狀態(tài)和減少操作步驟，本研究未對pH值進行調(diào)控。

利用鹽析效應可以降低目標物在樣品溶液中的溶解度，進而提高萃取效率。在靜態(tài)（無攪拌條件下）和動態(tài)（攪拌條件下）兩種模式下，考察了NaCl含量（m/V）對萃取效率的影響。由圖5可見，采用動態(tài)模式有利于提高萃取效率，并且在靜態(tài)模式下，增加鹽度對萃取效率有抑制作用，該現(xiàn)象與文獻[16]報道結果完全一致。在動態(tài)模式下，起初萃取效率隨著鹽度增加而提高，當鹽度增至15%時，萃取效率達到了最佳，隨后萃取效率下降。出現(xiàn)以上現(xiàn)象的原因可能是，鹽的存在不僅可提高咖啡因在有機相和水相間的分配比，同時大量鹽的陰陽離子還會抑制咖啡因在水相中的自由擴散，在靜態(tài)模式下，第二種效果起了主導作用； 在動態(tài)模式下，當鹽度較低時，第一種效果起主導作用，而當鹽度較高時，則第二種效果起了主導作用。為了獲取最佳萃取效率，本研究選取鹽度為15%。

3.1.6 氣泡與磁子間距離的選擇 在實際萃取過程中，氣泡與磁子間距離的變化也會影響萃取效率，距離越小，樣品液體攪動越劇烈，萃取效率也越高，但同時氣泡受到的擾動也越加嚴重。通過考察不同距離時的萃取效率發(fā)現(xiàn)，氣泡與磁子間距離d=1 cm時萃取效果最佳。 綜上所述，選擇三氯甲烷為萃取溶劑，萃取溶劑暴露體積1 μL，氣泡體積為1.6 μL，轉(zhuǎn)速300 r/min，萃取時間5 min，鹽度15% （m/V），氣泡與磁子間的距離1 cm作為最佳的萃取條件，用于后續(xù)實驗。

3.2 檢出限、線性范圍、加標回收率及富集倍數(shù)

配制不同濃度的咖啡因標準溶液，在上述最佳條件下進行萃取實驗，檢出限按信噪比等于3進行計算，分別以總離子流峰面積y對為質(zhì)量濃度x（mg/L）做工作曲線。本方法檢出限為0.003 mg/L，線性范圍為0.005～10 mg/L，其線性方程為y=1213x+875，r=0.982。向尿樣中添加不同濃度的咖啡因標準，使其理論濃度分別為0.050、0.500和5.000 mg/L，利用本方法測得平均回收率為89.2%～107.5%，相對標準偏差（RSD， n=6）為5.7%～7.8%（結果見表1），說明本方法精密度和準確度均比較好，并且不存在基質(zhì)效應。對含0.1 mg/L咖啡因的水樣進行測定，計算出富集倍數(shù)為37。

3.3 實際尿樣分析

利用本方法對尿中咖啡因24 h內(nèi)的代謝濃度進行了分析（圖6），結果表明，自愿者第一次排尿（1.2 h）中的咖啡因濃度為0.821 mg/L，并且在7 h內(nèi)基本保持恒定，此后尿中咖啡因濃度逐漸降至0.506 mg/L，說明本方法完全可用于對尿樣中咖啡因的測定。

3.4 液泡微萃取與其它方法的比較

將本研究方法與液液萃?。↙LE）、固相萃取（SPE）和中空纖維保護的液相微萃?。℉FLPME）方法進行了比較。由表2可知，本方法所需萃取溶劑體積僅為HFLPME的1/5，遠少于LLE和SPE，萃取時間明顯短于其它方法。

本方法通過向萃取溶劑微滴引入空氣形成氣泡，增大了溶劑微滴的表面積，提高了目標分析物的傳質(zhì)速率，從而獲得了較高的方法靈敏度； 同時，還增大了萃取溶劑微滴在尿樣中所受浮力，降低了自身重力的影響，從而提高了微滴在萃取過程中的穩(wěn)定性，使其在攪拌條件下能夠順利完成對咖啡因的萃取和富集。本方法可在10 min內(nèi)完成對尿樣中咖啡因的分析，與傳統(tǒng)液液萃取法相比，具有快速、靈敏、準確、對環(huán)境友好等優(yōu)點[20～22]，具有很好的應用前景。

References

1 Ataka S， Tanaka M， Nozaki S， Mizuma H， Mizuno K， Tahara T， Sugino T， Shirai T， Kajimoto Y， Kuratsune H， Kajimoto O， Watanabe Y. Nutrition， 2008， 24（3）： 233-238

2 Maridakis V， O′Connor P J， Tomporowski P D. Int. J. Neurosci.， 2009， 119（8）： 1239-1258

3 AlOthman Z A， Aqel A， Alharbi M K E， BadjahHadjAhmed A Y， AlWarthan A A. Food Chem.， 2012， 132（4）： 2217-2223

4 Bonsignore A， Sblano S， Pozzi F， Ventura F， Dell′Erba A， Palmiere C. Forensic Sci. Med. Pathol.， 2014， 10（3）： 448-451

5 Holmgren P， NordénPettersson L， Ahlner J. Forensic Sci. Int.， 2004， 139（1）： 71-73

6 Riesselmann B， Rosenbaum F， Roscher S， Schneider V. Forensic Sci. Int.， 1999， 103（S1）： S49-S52

7 Kerrigan S， Lindsey T. Forensic Sci. Int.， 2005， 153（1）： 67-69

8 Song A Y. Anal.Sci.， 2016， 32（6）： 645-652

9 ZHANG HaiXia， ZHU PengLing. Chinese J. Anal. Chem.， 2000， 28（9）： 1172-1180

張海霞， 朱彭齡. 分析化學， 2000， 28（9）： 1172-1180

10 George M J， Marjanovic L， Williams D B G. Talanta， 2015， 144： 445-450

11 Williams D B G， George M J， Meyer R， Marjanovic L. Anal.Chem.， 2011， 83： 6713-6716

12 George M J. Int. J. Environ. An. Ch.， 2016， 96 （3）： 247-256

13 Xie H Y， Yan J， Jahan S， Zhong R， Fan L Y， Xiao H， Jin X Q， Cao C X. Analyst， 2014， 139： 2545-2550

14 George M J S. Afr. J. Chem.， 2014， 67： 56-60

15 Williams D B G， George M J， Marjanovic L. J. Agric. Food Chem.， 2014， 62（31）： 7676-7681

16 Shrivas K， Wu H F. J. Chromatogr. A， 2007， 1170（12）： 9-14

17 GB/T 5750.42006， Standard Examination Methods for Drinking WaterOrganoleptic and Physical Parametes. National Standards of the People's Republic of China

生活飲用水標準檢驗方法感官性狀和物理指標. 中華人民共和國國家標準. GB/T 5750.42006

18 Spietelun A， Marcinkowski L， de la Guardia M， Namies'nik J. Talanta， 2014， 199： 34-45

19 Sanghavi B J， Srivastava A K. Electrochim. Acta， 2010， 55（28）： 8638-8648

20 WANG Yao， LIAO Jie， LI Li， DONG FangTing， ZHAO YuLan. J. Anal. Sci.， 2003， 19（5）： 410-412

王 瑤， 廖 杰， 黎 力， 董方霆， 趙玉蘭. 分析科學學報， 2003， 19（5）： 410-412

21 Atia N N， York P， Clark B J. J. Sep. Sci.， 2009， 32（7）： 931-938

22 Xiong J， Chen J， He M， Hu B. Talanta， 2010， 82： 969-975