高效液相色譜法測(cè)定牛羊雜碎等肉類中嘌呤及尿酸

王靜瑩，薄海波*，吉生軍，程子毓，陳秀紅

1(青海師范大學(xué)，青海 西寧，810000) 2(青海省出入境檢驗(yàn)檢疫局，青海 西寧，810000)

高效液相色譜法測(cè)定牛羊雜碎等肉類中嘌呤及尿酸

王靜瑩1，薄海波1*，吉生軍1，程子毓1，陳秀紅2

1(青海師范大學(xué)，青海 西寧，810000) 2(青海省出入境檢驗(yàn)檢疫局，青海 西寧，810000)

建立同時(shí)測(cè)定肉類食品中尿酸、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤的高效液相色譜分析方法，并測(cè)定肉類樣品中上述4種嘌呤及尿酸的含量。色譜條件：資生堂CAPCELL PAK-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱，柱溫30℃；流動(dòng)相為7×10-3mol/L KH2PO4-H3PO4(pH=3.83)，流速1.0 mL/min；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果：在上述條件下4種嘌呤和尿酸分離和測(cè)定效果良好，4種嘌呤和尿酸的質(zhì)量濃度和峰面積在0.05～50 μg/mL線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.999 6以上，檢出限在0.010～0.024 μg/mL之間，精密度檢測(cè)RSD為0.25%～0.81%，各組分回收率為92.0%～105.0%，方法精密度RSD為6.27%～11.09%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便，快捷，可靠，各組分分離度好，可應(yīng)用于肉類食品中嘌呤和尿酸的同時(shí)分析測(cè)定。

高效液相色譜(HPLC)；牛羊雜碎；嘌呤；尿酸

嘌呤(C5H4O4)是一類生物堿，是核酸的重要組成部分，人體內(nèi)嘌呤的主要來源有體內(nèi)合成、人體組織中核酸分解以及食物中攝取，而飲食是人體嘌呤的一個(gè)重要來源。常見的嘌呤主要有腺嘌呤(adenine)、鳥嘌呤(guanine)、黃嘌呤(xanthine)和次黃嘌呤(hypoxanthine) 4 種[1]，嘌呤經(jīng)體內(nèi)代謝最終轉(zhuǎn)化生成尿酸(Uric acid)，正常情況下主要經(jīng)腎排出體外。尿酸是人體內(nèi)特有的天然水溶性抗氧化劑，具有刺激樹突狀細(xì)胞及T細(xì)胞成熟以維護(hù)機(jī)體免疫力、維持血壓、促進(jìn)傷口愈合等功能[2]。長(zhǎng)期攝入高嘌呤的食品再加上一些誘導(dǎo)因素會(huì)導(dǎo)致嘌呤在體內(nèi)的最終產(chǎn)物——尿酸的沉積，最終引發(fā)痛風(fēng)。

食品嘌呤含量的檢測(cè)方法和樣品前處理方法多種多樣，目前國(guó)內(nèi)外沒有建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。嘌呤檢測(cè)的方法主要有液相色譜法、紙層析法、電泳法、薄層色譜法、氣相色譜法和離子色譜法等[3]，隨著液相色譜法日漸普及，并因其方便、快速、靈敏、選擇性高，已成為檢測(cè)嘌呤的主流方法。樣品中嘌呤的提取方法有酸提取法[4-7]、有機(jī)溶劑萃取[8-9]和超聲輔助萃取法[10-12]。研究者多采用HClO4[13-19]、三氟乙酸和甲酸[20-21]進(jìn)行樣品水解。HClO4水解樣品，分離效果較好,準(zhǔn)確度和精密度較高,檢測(cè)時(shí)間短。因此本實(shí)驗(yàn)采用高氯酸對(duì)樣品進(jìn)行水解。

本研究建立了同時(shí)測(cè)定青藏高原牛羊雜碎等風(fēng)味肉制品中腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤及尿酸的高效液相色譜分析方法，并對(duì)4種嘌呤和尿酸含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：新鮮黃牛肉、牦牛肉、手抓羊肉、牛肉、牛頭肉；牛腩、牛肚、牛筋、羊肝、羊心、羊腸等牛羊內(nèi)臟；牛雜碎(含有牛肚，牛筋，牛肺，牛腸，牛腩等內(nèi)臟)、羊雜碎(含有羊肚，羊心，羊肺，羊腸，羊肝等內(nèi)臟)購(gòu)自西寧市各大市場(chǎng)。-20 ℃冷凍保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：尿酸、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98.0%)，Agilent公司。

稱取尿酸、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品各0.050 0 g，加20 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液助溶，分別用10%甲醇溶液定容至100 mL容量瓶中，搖勻，即得500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)單一儲(chǔ)備液。-20 ℃保存。

試劑：甲醇(色譜純)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；HClO4(分析純)，天津東方化工廠；KH2PO4(分析純)，北京紅星化工廠；H3PO4(分析純)，天津市濱海科迪化學(xué)試劑有限公司；KOH(分析純)，四川成都化工廠；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

U1tiMate3000高效液相色譜儀(配有紫外檢測(cè)器)，美國(guó)戴安公司；FW-100高速萬能粉碎機(jī)，紹興市科弘儀器有限公司；雷磁PHS-3C型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；L600離心機(jī)，湘儀公司；WB-2000水浴鍋，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；TG332A微量分析天平，湘儀天平儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：資生堂CAPCELL PAK-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫30 ℃；流動(dòng)相：7×10-3mol/L KH2PO4-H3PO4(pH=3.83)，流速1.0 mL/min；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 樣品的制備與前處理

將樣品室溫下自然解凍，新鮮黃牛肉、牦牛肉、手抓羊肉、牛肉、牛頭肉等肉類和牛腩、牛肚、牛筋、羊肝、羊心、羊腸等牛羊內(nèi)臟；用刀切碎，再用高速萬能粉碎機(jī)絞碎并勻漿，貼明標(biāo)簽，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

將市購(gòu)的牛雜碎(含有牛肚，牛筋，牛肺，牛腸，牛腩等內(nèi)臟)和羊雜碎(含有羊肚，羊心，羊肺，羊腸，羊肝等內(nèi)臟)分別分樣為牛雜碎肉(干物質(zhì))、牛雜碎湯、牛雜碎肉和湯(混合物)、羊雜碎肉(干物質(zhì))、羊雜碎湯、羊雜碎肉和湯(混合物)，用高速萬能粉碎機(jī)絞碎并勻漿，貼明標(biāo)簽，-4 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取0.200 0 g樣品于10 mL具塞刻度離心管中，加入3 mL 體積分?jǐn)?shù)10%的HClO4，搖勻后在沸水浴中水解60 min，冷卻。用1 mol/L的KOH溶液調(diào)節(jié)pH至3.8，再用超純水定容至10 mL，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心30 min，上清液濾紙過濾，再用0.22 μm微孔水膜過濾，待進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

CAPCELL PAK-C18柱采用高純度多孔球形硅膠作為基質(zhì)，表面包覆單層有機(jī)硅聚合物薄膜，并在其上鍵合十八烷基(C18)等各種官能團(tuán)的高性能填料填充的色譜柱。該填料既具有硅膠類填料的高分離能力，又具有聚合物填料的耐久性。該色譜柱適合測(cè)定極性成分，能與極性較強(qiáng)的水流動(dòng)相兼容使分離的各組分呈現(xiàn)出良好的色譜峰形。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：使用資生堂CAPCELL PAK-C18能將4種嘌呤和尿酸完全分離。

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

尿酸、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤都有著共軛雙鍵，在紫外區(qū)220～300 nm之間有強(qiáng)吸收峰。綜合考慮4種嘌呤和尿酸的吸收峰，選擇以波長(zhǎng)254 nm作為實(shí)驗(yàn)檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.3 流動(dòng)相的優(yōu)化

2.1.3.1 流動(dòng)相pH的選擇

流動(dòng)相的酸度對(duì)嘌呤類物質(zhì)的分離程度和保留時(shí)間影響較大，應(yīng)選擇合適的pH值使4種嘌呤和尿酸達(dá)到最佳分離效果?？疾炝藵舛认嗤?7.0×10-3mol/L)，不同pH(3.65，3.83、3.93、4.15)的KH2PO4- H3PO4溶液對(duì)4種嘌呤及尿酸峰形和分離效果的影響。見圖1。

1-尿酸；2-鳥嘌呤；3-次黃嘌呤；4-黃嘌呤；5-腺嘌呤圖1 流動(dòng)相pH為3.65、3.83、3.93、4.15的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mobile phase pH is 3.65、3.83、 3.93、 4.15

觀察上圖中4種嘌呤和尿酸的分離情況結(jié)果，在pH為3.83時(shí)，4種嘌呤和尿酸可以完全分離，而且基線穩(wěn)定，重復(fù)性最好，出峰順序依次為尿酸、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤。因此確定流動(dòng)相pH為3.83。

2.1.3.2 流動(dòng)相濃度的選擇

采用KH2PO4- H3PO4溶液做流動(dòng)相，考察了相同pH(3.83)，不同濃度(2.0×10-4、5.0×10-3、7.0×10-3、1.0×10-2、2.0×10-2mol/L)的KH2PO4-H3PO4溶液對(duì)4種嘌呤及尿酸峰形和分離效果的影響，見圖2。

1-尿酸；2-鳥嘌呤；3-次黃嘌呤；4-黃嘌呤；5-腺嘌呤圖2 流動(dòng)相濃度為2.0×10-4、5.0×10-3、7.0×10-3、1.0×10-2、2.0×10-2 mol/L的色譜圖Fig.2 Chromatogram of mobile phase concentration is 2.0×10-4、5.0×10-3、7.0×10-3、1.0×10-2、2.0×10-2 mol/L

觀察上圖中4種嘌呤和尿酸的分離情況，流動(dòng)相的濃度對(duì)于峰形、分離度影響較大。在濃度7.0×10-3mol/L的情況下，基線較穩(wěn)定，分離度好。因此最終確定流動(dòng)相濃度為7.0×10-3mol/L[22]。

2.2 線性范圍及檢出限、定量限

分別移取500 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)單一儲(chǔ)備液,用超純水稀釋至0.05、 10、 20、30、40、50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列混合溶液。將系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液分別用0.22 μm微孔濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中, 在1.3.1所述的色譜條件下，各進(jìn)樣10 μL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

采用外標(biāo)法對(duì)進(jìn)樣的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積和相應(yīng)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得峰面積(Y)與質(zhì)量濃度(X)的線性方程和相關(guān)系數(shù)。按3倍信噪比計(jì)算檢出限(LOD)，10倍信噪比計(jì)算定量限(LOQ)。數(shù)據(jù)結(jié)果見表1。

表1 四種嘌呤和尿酸的回歸方程和線性范圍

表1數(shù)據(jù)結(jié)果顯示：4種嘌呤和尿酸的質(zhì)量濃度和峰面積在0.05～50 μg/mL線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R)在0.999 6～0.999 9之間，檢出限在0.010～0.024 μg/mL之間。說明此方法適合實(shí)際樣品的測(cè)定。

2.3 精密度考察

將20 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，根據(jù)定量的質(zhì)量濃度分別計(jì)算4種嘌呤和尿酸的精密度。數(shù)據(jù)結(jié)果見表2。

表2數(shù)據(jù)結(jié)果顯示：尿酸、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.25%～0.81%,精密度良好。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 回收率考察

采用牛肚作為實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行添加回收率實(shí)驗(yàn)，取已知4種嘌呤和尿酸含量的牛肚樣品18份，每份0.200 0 g，加入3個(gè)不同濃度水平的四種嘌呤和尿酸的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,每個(gè)濃度水平平行6份，按照1.3.2節(jié)中的前處理方法進(jìn)行處理后,根據(jù)添加的標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度和測(cè)定出的加標(biāo)樣品質(zhì)量濃度計(jì)算4種嘌呤和尿酸的回收率，尿酸、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤的平均加標(biāo)回收率分別為99.1%、99.0%、105.0%、92.0%、92.6%，根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的18份加標(biāo)樣品中4種嘌呤和尿酸的回收率，計(jì)算出方法精密度RSD為6.27%～11.09%，均符合分析測(cè)定的要求。

2.5 樣品測(cè)定結(jié)果

將牛羊雜碎等肉類樣品按1.3.3節(jié)進(jìn)行處理，按1.3.1節(jié)的色譜條件下進(jìn)樣分析。采用外標(biāo)法對(duì)實(shí)測(cè)樣品的4種嘌呤和尿酸進(jìn)行定性定量分析。部分樣品色譜圖見圖3～圖5。樣品測(cè)定數(shù)據(jù)結(jié)果見表3。

1-尿酸；2-鳥嘌呤；3-次黃嘌呤；4-黃呤；5-腺嘌呤圖3 牛肚色譜圖Fig.3 Chromatogram of tripe

1-尿酸；2-鳥嘌呤；3-次黃嘌呤；4-黃嘌呤；5-腺嘌呤圖4 牛肉色譜圖Fig.4 Chromatogram of beef

1-尿酸；2-鳥嘌呤；3-次黃嘌呤；4-黃嘌呤；5-腺嘌呤圖5 羊肝色譜圖Fig.5 Chromatogram of Sheep liver

表3 樣品中4種嘌呤和尿酸的含量 單位：mg/kg

注：4種嘌呤折算為尿酸的量是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量計(jì)算4種嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸的理論含量值。

表3結(jié)果顯示：青藏高原牛羊雜碎等風(fēng)味肉制品中總尿酸含量為89.12～3 750.26 mg/kg，總嘌呤含量為67.44～2 659.75 mg/kg。在實(shí)測(cè)樣品中羊肝的尿酸和總嘌呤含量最高，其總嘌呤含量達(dá)到2 659.75 mg/kg，牦牛肉、黃牛肉、牛肉和學(xué)府巷-羊排中總嘌呤含量次之；牛羊雜碎湯中總嘌呤含量最低，牛羊肚次之。采用本方法在羊肺和學(xué)府巷-羊排中未檢測(cè)到尿酸；在羊心、羊肚、冷湖-羊排、羊腸、牛雜碎肉和羊雜碎肉和湯中尿酸含量較低。

在牛肉和牛雜碎中總嘌呤含量順序?yàn)椋狐S牛肉>牛肉>牦牛肉>牛腩>牛筋>牛頭肉>牛排>牛雜碎肉>牛雜碎肉和湯>牛肚>牛雜碎湯;在羊肉和羊雜碎中總嘌呤含量順序?yàn)椋貉蚋?羊肺>學(xué)府巷-羊排>羊心>手抓羊肉>五四大街-羊排>羊雜碎肉>羊腸>冷湖路-羊排>羊雜碎肉和湯>羊肚>羊雜碎。

由表3可知，不同地方購(gòu)買的牛羊雜碎等肉類中總嘌呤和尿酸含量差異較大，尤其是不同地的羊排中總嘌呤和尿酸含量有著顯著的差異，羊排中總嘌呤含量學(xué)府巷-羊排>五四大街-羊排>冷湖路-羊排，三個(gè)地區(qū)結(jié)果差異較大。嘌呤含量差異大可能是由于生物體生長(zhǎng)環(huán)境和自身生長(zhǎng)情況不一樣，造成同一部位的肉中嘌呤含量差異較大。

在痛風(fēng)發(fā)病率高的青藏高原地區(qū)，為預(yù)防和治療痛風(fēng)癥，建議人們少量食用高嘌呤含量的黃牛肉、牦牛肉、牛肉、羊肺、羊排，尤其是嘌呤含量特高的羊肝；可合理食用牛羊肚和牛羊雜碎等嘌呤含量較低的食物。

3 結(jié)論

本研究建立的方法對(duì)尿酸、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤分離效果好，能快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)定量肉類食品中4種嘌呤和尿酸的含量。此方法在線性范圍0.05～50 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R)在0.999 6～0.999 9之間，方法檢出限在0.010～0.024μg/mL之間，精密度RSD為0.25%～0.81%，各組分回收率在92.0%～105.0%之間，方法精密度RSD為6.27%～11.09%，適用于4種嘌呤和尿酸的同時(shí)分析測(cè)定。應(yīng)用此方法測(cè)定的青藏高原牛羊雜碎等特色肉類食品中嘌呤和尿酸的含量數(shù)據(jù)，可為通風(fēng)發(fā)病率高的青藏高原地區(qū)消費(fèi)者提供科學(xué)健康的飲食指導(dǎo)。

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Determination of purine and uric acid in cooked cow and sheep offal by high performance liquid

WANG Jing-ying1, BO Hai-bo1*, JI Sheng-jun1, CHENG Zi-yu1, CHEN Xiu-hong2

1(Department of Chemistry, Qinghai Normal University, Xining 810008, China) 2(Qinghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xining 810008, China)

A high performance liquid Chromatography method for the determination of uric acid, guanine, hypoxanthine, xanthine and adenine in meat was established and applied. The detecting method for Chromatography was: Shiseido CAPCELL PAK-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)column, column temperature was at 30 ℃.The mobile phase was 7×10-3mol/L KH2PO4-H3PO4(pH=3.83)at a flow rate of 1.0 mL/min. The UV detector was used and the wavelength was set at 254 nm and the Sample volume was 10 μL. Result: Under the above conditions, good separation was obtained and four kinds of purines and uric acid was showed in the range of 0.05-50 μg/mL; a good linear relation was observed between the concentration and peak area,and all the correlation coefficients are higher than 0.9996, the limit of detection was between 0.010-0.024 g/mL, precision detection of RSD% was between 0.25%-0.81%,the recovery rate of each component was between 92.0%-105.0%, the precision RSD% was between6.27%-11.09%. Conclusion: The method was simple, rapid and reliable，had a good separation for each component, and can be used for the analysis and determination of purine and uric acid in meat products.

HPLC; cooked chopped entrails of cattle and sheep; purine; uric acid

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704037

碩士研究生(薄海波教授為通訊作者，E-mail：1025104004@qq.com)。

青藏高原特色風(fēng)味食品中危害物質(zhì)高通量篩查及快速檢測(cè)技術(shù)研究(2014-ZJ-722)

2016-08-23，改回日期：2016-10-16