半夏葉柄愈傷組織誘導(dǎo)與分化最適培養(yǎng)基篩選

溫琳，惠國強(qiáng)，楊海鵬，宋紅霞，梁藝，孫毅，劉小紅，張紅梅，4

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，山西忻州034000；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031；4.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源和種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031；5.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川南充637002）

半夏葉柄愈傷組織誘導(dǎo)與分化最適培養(yǎng)基篩選

溫琳1，惠國強(qiáng)2，楊海鵬2，宋紅霞1，梁藝2，孫毅3，4，劉小紅5，張紅梅2，4

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，山西忻州034000；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031；4.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源和種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031；5.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川南充637002）

以半夏（Pinellia ternata（Thunb.）Breit）葉柄為外植體，研究不同培養(yǎng)基配方對(duì)誘導(dǎo)脫分化、愈傷組織增殖及分化的影響。結(jié)果表明，適合半夏葉柄誘導(dǎo)脫分化的最佳培養(yǎng)基是MS＋1.0 mg/L2，4-D＋0.2 mg/L6-BA；最適愈傷組織增殖培養(yǎng)基是MS＋1.0 mg/L2，4-D＋0.2 mg/L6-BA；最適分化培養(yǎng)基是MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L NAA。

半夏；葉柄；組織培養(yǎng)；愈傷組織

半夏（Pinellia ternata（Thunb.）Breit），別名三葉半夏、三興草，屬天南星科，主要產(chǎn)于四川、云南、貴州、江南等地。半夏是多年生宿根小草本植物，塊莖入藥，具有燥濕化痰、和胃止嘔，主治痰濕水飲、嘔吐、咳喘等病癥[1-2]。半夏已有2 000多年的用藥歷史，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其良好的應(yīng)用價(jià)值備受國內(nèi)外的關(guān)注，社會(huì)需求量較大[3]。但是近年來，由于土地開發(fā)、放牧、環(huán)境污染及野生資源過度采挖等原因，我國大部分地區(qū)的半夏棲息地遭到不同程度的破壞，導(dǎo)致野生半夏資源日益減少[4-8]。

半夏組培苗具有生長速度快、繁殖系數(shù)高、不帶病毒等特點(diǎn)，所以，利用組織培養(yǎng)再生苗或者用于提取有效成分已成為半夏生產(chǎn)發(fā)展的趨勢(shì)[9-12]。徐秀梅等[13]通過對(duì)半夏葉片和葉柄的誘導(dǎo)，得到半夏叢生芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS＋2 mg/L 6-BA＋0.1 mg/LNAA。萬美亮等[14]采用葉片、葉柄得到一次成苗的最適培養(yǎng)基為MS＋0.2 mg/L2，4-D＋1 mg/L KT。夏海武等[15]在半夏出苗期、生長旺盛期、珠芽成熟期、倒苗期分別取葉片、葉柄、塊莖接種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，材料的采集時(shí)間與再生愈傷組織的數(shù)量有密切的關(guān)系，出苗期和生長旺盛期材料分生能力較強(qiáng)，而珠芽成熟期和倒苗期材料分生能力逐漸減弱。半夏塊莖的誘導(dǎo)率較高，最高可達(dá)94%，且塊莖的誘導(dǎo)率與采集時(shí)間關(guān)系不大。

本試驗(yàn)選用半夏葉柄進(jìn)行誘導(dǎo)脫分化、愈傷組織增殖和分化的最適培養(yǎng)基的研究，旨在為工廠化、規(guī)模化生產(chǎn)脫毒種苗奠定基礎(chǔ)，提供技術(shù)支持[16-20]。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料選自陵川縣栽培的半夏珠芽及種子。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的獲得分別取半夏的珠芽、種子，先用流水洗去表面的灰塵及泥土等，再用洗滌劑漂洗。珠芽清洗干凈后需要?jiǎng)內(nèi)ネ鈱悠?，清水洗凈，避免傷到生長點(diǎn)；種子剝?nèi)シN皮，清水洗凈，流水下沖洗30 min。珠芽和種子處理好后進(jìn)行第1輪消毒，75%酒精處理30 s，無菌水沖洗3～4次，然后將珠芽、種子各分成4份，每份都用0.1%HgCl2進(jìn)行第2輪消毒，消毒時(shí)間依次是4，8，10，12 min共4個(gè)處理，第2輪消毒處理后都經(jīng)無菌水沖洗3～4次，轉(zhuǎn)至未添加任何激素的MS培養(yǎng)基中，珠芽每瓶放置1個(gè)，每個(gè)處理接種50瓶，種子每瓶放置5個(gè)，每處理接種10瓶。接種后置于25℃，光強(qiáng)2 000 lx的培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行無菌苗培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計(jì)珠芽和種子的染菌率和成活率。

1.2.2 半夏葉柄的脫分化以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的2，4-D和6-BA，共9個(gè)處理組（表1）。切取長勢(shì)良好的半夏無菌苗葉柄接種于9種培養(yǎng)基中，每瓶接種3個(gè)，每個(gè)處理接種10瓶，重復(fù)3次，接種后置于培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃。培養(yǎng)30 d后觀察統(tǒng)計(jì)半夏愈傷組織誘導(dǎo)率及生長情況。

表1 半夏愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基不同激素配比mg/L

1.2.3 半夏愈傷組織增殖選取長勢(shì)一致的半夏愈傷組織分別接種到以下3種培養(yǎng)基上，Ⅰ號(hào)：MS＋1.0mg/L2，4-D＋0.2mg/L6-BA；Ⅱ號(hào)：MS＋1.5mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IAA；Ⅲ號(hào)：MS＋0.5 mg/L 2，4-D＋0.2 mg/LNAA；每個(gè)培養(yǎng)瓶接4塊愈傷組織，每種培養(yǎng)基接20瓶。培養(yǎng)溫度25℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，30 d后觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織生長情況。

1.2.4 半夏愈傷組織分化分化培養(yǎng)基為MS添加不同濃度的6-BA和NAA。6-BA和NAA濃度設(shè)計(jì)為9個(gè)處理，如表2所示。選取生長狀態(tài)相同的增殖愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上，每瓶接種4塊，每個(gè)處理接種10瓶，每個(gè)處理重復(fù)3次。接種后暗培養(yǎng)5 d，然后轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照為16 h/d。每10 d觀察出苗數(shù)（葉柄高于5 mm為1苗）。

表2 半夏愈傷組織分化培養(yǎng)基不同激素配比mg/L

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌時(shí)間對(duì)珠芽和種子的影響

以半夏珠芽、種子獲得無菌苗時(shí)，滅菌時(shí)間對(duì)滅菌效果和成活率的影響如圖1所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，用0.1%的升汞消毒，消毒時(shí)間越長滅菌效果越好，但外植體的成活率隨之降低；種子消毒8 min就可獲得理想的滅菌效果，污染率是0，而成活率可達(dá)81.8%，珠芽消毒時(shí)間達(dá)到10 min才可獲得較理想的滅菌效果，污染率僅4.3%，而成活率可高達(dá)91.5%。試驗(yàn)結(jié)果表明，珠芽與種子相比，種子滅菌較為容易。珠芽滅菌困難主要由于其接觸土壤，自身攜帶生物細(xì)菌、真菌或者霉菌較多，且珠芽外表皮質(zhì)地略硬，較難清潔干凈，因此，滅菌較困難。種子最外有佛焰苞包被，又具有易分離的種皮包裹，生存環(huán)境相對(duì)純凈，因此，滅菌較容易。

試驗(yàn)表明，用0.1%的升汞消毒，消毒時(shí)間8～12 min，種子的存活率差異較小，但珠芽隨滅菌時(shí)間的延長，成活率呈下降趨勢(shì)。這個(gè)現(xiàn)象可能是珠芽生長點(diǎn)的包被層較薄，生長點(diǎn)易遭到傷害使其無法生長。種子生長點(diǎn)包被的相對(duì)較厚，不易受到傷害。但珠芽得到的無菌苗比由種子獲得的無菌苗健壯，表現(xiàn)為葉柄粗，葉子大，顏色深，根系粗且長，這可能與半夏珠芽本身含營養(yǎng)物質(zhì)較多有關(guān)。

在自然環(huán)境中，半夏的發(fā)芽率只有20%左右，采用本試驗(yàn)的方法，可將發(fā)芽率提高到87.5%，這對(duì)于提高雜交選育半夏優(yōu)良品種的效率是個(gè)突破。

2.2 半夏葉柄的脫分化

外植體葉柄接種到培養(yǎng)基上20 d時(shí)，葉柄兩端上翹或彎曲，并且膨大，出現(xiàn)大量黃綠色疏松愈傷組織，隨著時(shí)間延長，愈傷組織不斷增大，此外還有白色疏松狀的愈傷組織，質(zhì)地疏松無器官分化，分散性好，但數(shù)量較少。表3顯示，除T1外，其他培養(yǎng)基皆可誘導(dǎo)得到愈傷組織，其中，T5的愈傷誘導(dǎo)率最高。

表3 不同激素組合對(duì)半夏愈傷組織發(fā)生的影響

從圖2可以看出，不添加6-BA時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率隨2，4-D質(zhì)量濃度的增加而增大；6-BA質(zhì)量濃度是0.4 mg/L時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率隨2，4-D質(zhì)量濃度的增加而降低；6-BA質(zhì)量濃度是0.2 mg/L時(shí)，3種2，4-D質(zhì)量濃度的愈傷組織誘導(dǎo)率均較高，但以2，4-D質(zhì)量濃度是1.0 mg/L時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為93.3%。所以，誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基是MS＋1.0 mg/L2，4-D＋0.2 mg/L6-BA。

2.3 半夏愈傷組織的增殖

愈傷組織在3種培養(yǎng)基上的增殖情況如圖3所示，Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基上愈傷組織可大量增殖，無明顯分化現(xiàn)象，適合做增殖培養(yǎng)基；Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基上愈傷組織增殖很少，出現(xiàn)少量分化的苗；Ⅲ號(hào)培養(yǎng)基上愈傷組織分化明顯，分化苗周圍伴隨顆粒狀愈傷生長。因此，Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基MS＋1.0mg/L2，4-D＋0.2mg/L 6-BA適合用作增殖培養(yǎng)基，Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基適合用作1次成苗培養(yǎng)基，Ⅲ號(hào)培養(yǎng)基適合用作分化培養(yǎng)基。

2.4 半夏愈傷組織的分化

9種分化培養(yǎng)基均可分化出苗（表4、圖4），但分化出苗數(shù)量和質(zhì)量在不同培養(yǎng)基上有差異。由圖4可知，培養(yǎng)基中不添加NAA時(shí)，6-BA對(duì)分化率的影響呈正效應(yīng)，隨6-BA質(zhì)量濃度的增高分化率也增高。但加入NAA后，在NAA質(zhì)量濃度一定的情況下，分化率隨6-BA質(zhì)量濃度的增高呈下降趨勢(shì)。說明NAA和6-BA之間存在互作，根據(jù)表4，圖4，5分析得出，分化最佳培養(yǎng)基為MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.2 mg/LNAA。

表4 不同激素組合對(duì)半夏愈傷組織分化的影響

3 討論

半夏種子數(shù)量較多，活力較強(qiáng)，易于滅菌，因此，種子是培養(yǎng)基初步篩選的較好材料[4]。在影響半夏出芽的外界因素中，外植體的年齡對(duì)植株再生有重要影響，無菌苗苗齡低，接種過程中容易造成機(jī)械損傷，使傷口褐化，導(dǎo)致外植體死亡，出芽率下降；苗齡過高，易形成倒苗，葉片和葉柄老化甚至枯萎，不能用作外植體；生長旺盛期和珠芽成熟期的半夏材料，其外植體的分化率都較高[21]。將種子接種在MS培養(yǎng)基時(shí)，87.5%以上的種子可以萌發(fā)成幼苗，前人的研究結(jié)果在自然狀態(tài)下半夏種子的發(fā)芽率只有20%，因此，本研究獲得的結(jié)果為通過雜交選育半夏優(yōu)良品種奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Screening of Optimal Medium for Callus Inducing and Differentiation of Petiole ofPinellia ternata（Thunb.）Breit

WENLin1，HUI Guoqiang2，YANGHaipeng2，SONGHongxia1，LIANGYi2，SUNYi3，4，LIUXiaohong5，ZHANGHongmei2，4
（1.College ofBiological Engineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Institute ofMaize，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Xinzhou 034000，China；3.Research Center ofBiotechnology，Shanxi Academyof Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；4.KeyLaboratoryofCrop Gene Resources and GermplasmEnhancement on Loess Plateau，MinistyofAgriculture，Taiyuan 030031，China；5.College ofLife Science，China West Normal University，Nanchong637002，China）

Petioles of Pinellia ternata（Thunb.）Breit were used to investigate the effects of several mediums on the induced dedifferentiation ratio,callus proliferation ratioofpetioles of Pinellia ternata（Thunb.）Breit.The results showed that the optimal medium for petioles dedifferentiation,callus proliferation and differentiation were MS＋1.0 mg/L 2,4-D＋0.2 mg/L 6-BA,MS＋1.0 mg/L 2, 4-D＋0.2 mg/L6-BA,MS＋0.5 mg/L6-BA＋0.2 mg/LNAA.

Pinellia ternata（Thunb.）Breit;petiole;tissue culture;callus

S567.23＋9

：A

：1002-2481（2017）06-0905-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.06.11

2017-01-19

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2016ZX08003-001）

溫琳（1992-），女，山西介休人，在讀碩士，研究方向：作物遺傳與育種。張紅梅為通信作者。